Summary
ويمكن استخدام أجهزة ميكروفلويديك لتصور العمليات الطبيعية المعقدة في الوقت الحقيقي ، وعلى المستويات المادية المناسبة. قمنا بتطوير جهاز بسيط ميكروفلويديك الذي يحاكي السمات الرئيسية من وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها لدراسة النمو الطبيعي ونقل البكتيريا الموجودة في باطن الأرض.
Abstract
نمو الجراثيم والنقل في وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها لها انعكاسات هامة على جودة المياه الجوفية والسطحية ، وإعادة تدوير المواد الغذائية في البيئة ، وكذلك مباشرة لنقل مسببات الأمراض إلى إمدادات المياه الصالحة للشرب. وتتكون وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها من طوبولوجيا الطبيعية و الجسدية معقدة ، كيمياء السطح متنوعة ، التدرجات دينامية من المواد المغذية ويقبلون الإلكترون ، والتوزيع غير مكتمل من الميكروبات. هذه الميزات تختلف إلى حد كبير على مقياس طول ميكرون ، مما يجعل النتائج الكلي على نطاق التحقيقات في نقل الجراثيم من الصعب تفسير ، وتطعن في التحقق من النماذج الميكانيكية. هنا علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام أجهزة ميكروفلويديك بسيطة لتصور التفاعلات الميكروبية الدقيقة مع منظم الموائل ، وتحديد العمليات الأساسية التي تؤثر في الظواهر المرئية ، وبشكل منتظم للتحقق من صحة النماذج التنبؤية. شيدت بسيطة ، وخلايا تدفق سهلة الاستخدام من الشفافية ، وبولي المواد حيويا والأكسجين نفاذية - (ثنائي ميثيل siloxane). واستخدمت الطرق المعيارية لجعل ضوئيه متناهية الصغر المهيكلة الماجستير ، وكانت تستخدم قوالب متماثلة للادلاء تدفق الخلايا الصغيرة منظم من سادة. التصميم المادي للغرفة تدفق خلية قابلة للتكيف مع متطلبات التجريبية : microchannels يمكن أن تختلف من اتصالات خطية بسيطة إلى المعقدة والغامضة مع أحجام صغيرة مثل ميزة 2 ميكرون. لدينا مجموعة وحدات تدفق EcoChip الخلية ميزات متطابقة عشرات الغرف والتحكم في التدفق من قبل وحدة تدفق الجاذبية يحركها. علينا أن نظهر ذلك من خلال استخدام أجهزة EcoChip ، ويمكن عقد رؤساء الهياكل المادية والضغط المستمر أو تباينت بشكل منهجي بينما يتم التحقيق في تأثير الكيمياء السطحية ، خواص السوائل ، أو خصائص السكان الميكروبية. من خلال التجارب باستخدام النقل غير المسببة للمرض ، والأخضر ، معربا عن بروتين فلوري
Protocol
أولا تصنيع الأجهزة ميكروفلويديك
- الخطوة الأولى في إنشاء جهاز ميكروفلويديك هو رسم تخطيط ثنائي الأبعاد لجهاز الكمبيوتر في برنامج المساعدة (CAD) الرسم. وقد استخدمنا أوتوكاد ، ولكن غيرها من برامج الرسم وتتوفر أيضا ، مثل CleWin ، أو برنامج CorelDRAW.
- الخطوة التالية هي لافتعال قناع الطباعة بصفائح معدة ضوئيا. اعتمادا على أبعاد الجهاز ، والميزانية المطلوبة القرار ، يمكن أن تكون ملفقة هذه الأقنعة في الكروم (أعلى دقة ، وارتفاع تكلفة) ، التي تم إنشاؤها على الأفلام الفوتوغرافية ، أو حتى طباعتها مباشرة على الشفافية الحمل باستخدام طابعة دقة عالية. هنا ، وقد استخدمنا أقنعة الكروم المصنعة من قبل شركة النسخ المقدمة ، شمال اندوفر ، ماجستير.
- الخطوة التالية هي تحويل نمط من قناع في الصعود إلى الايبوكسي حساس لإنشاء قالب لتخفيف أثارها.
- الأول ، هو نسج طبقة من مقاوم الضوء SU8 السلبية على رقاقة السيليكون لسمك المطلوب ، ويخبز لتطيير المذيبات الزائدة. مقاوم الضوء صياغة وتدور بسرعة السيطرة على سماكة طبقة المودعة.
- ثم ، ما يتعرض له نمط لجرعة محددة مسبقا من الأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع. وبعد التعرض خبز عبر وصلات في المناطق المعرضة للضوء للطلاء مقاوم الضوء ، مما يجعلها غير قابلة للذوبان.
- القادم هو الخطوة تتم إزالة التنمية ، حيث لم يتعرضوا مقاومة مع مطور الكيميائية ، وترك أثار إيجابية لتخفيف هيكل يسمى الرئيسي.
- دعا خطوة خطوة الخبز ثلث خبز الثابت هو اختياري لإصلاح هياكل أخرى.
- صب PDMS
- نستخدم السيليكون بولي الاستومر (ثنائي ميثيل siloxane) لصب طبق الأصل من الأجهزة ميكروفلويديك 1. أولا ، يتم خلط المواد الأساسية في 10:01 نسبة الوزن مع وكيل علاج ، وسكب على مدى العفن في وعاء الضحلة مثل طبق بتري ، وdegassed تحت الفراغ حتى تختفي جميع الفقاعات مرئية.
- ثم يتم وضع الربان مع PDMS غير مخمر في فرن الموجهة بعناية لمدة لا تقل 4H عند 65 درجة مئوية لمدة عبر ربط من البوليمر تحدث.
- بعد توطد PDMS ، هو قطع الجزء مصبوب من طبق بتري. واللكم من خلال ثقوب في أعلى الجهاز للوصول إلى الأماكن ميكروفلويديك في الجهاز الانتهاء.
- التعلق الزجاج
- وبشكل لا رجعة فيه الرهينة نظيفة لتنظيف الزجاج PDMS عن التعرض للبلازما الأوكسجين. أولا ، يتم وضع PDMS مقولب واللكم وشريحة زجاجية نظيفة سطح الرابطة تصل الى نظافة البلازما. استخدمنا PDC - 32G نظافة Harrick البلازما.
- بعد إغلاق الغرفة ، المشغل بتشغيل مضخة فراغ ثم تردد الراديو RF أو مصدر. والبلازما اشعال النفس في الغرفة ، يتضح من توهج ارجواني قليلا في الغرفة.
- بعد التعرض للالبلازما لمدة 30 ثانية ، يتم تشغيل مصدر RF ثم إيقاف ضخ فراغ.
- بسرعة ، ويتم إزالة شريحة زجاجية وجهاز PDMS من الغرفة ، وجلبت الى الاتصال المباشر (مصبوب الجانب سطح PDMS لأسفل). وسوف تشكل هذه السندات لا رجعة فيه ، وستجعل أيضا خصائص سطح ماء.
- إذا رغبت في ذلك ، لا يمكن تحقيق كيمياء مختلفة مع سطح PDMS من خلال تجميد البروتينات على السطح بواسطة الامتزاز أو الرابطة التساهمية.
- ويمكن عندئذ أن يكون الجهاز مملوءة بسائل مثل الماء منزوع الأيونات ، وسائط النمو ، أو المياه الجوفية الاصطناعية من قبل قوات الشعرية أو استخدام الضغط لطيف مع حقنة.
II. الكمي تدفق الأجهزة ميكروفلويديك تحليل بواسطة الجاذبية
- لمعايرة ضغط يحركها تدفق في الجهاز ، وكانت محملة first الخلايا الصغيرة تدفق المياه منظم مع دي.
- تحتوي على خزان السائل ، مثل حقنة بلاستيكية أو وحدة التدفق (كما هو موضح في الشكل 1) متصلة مدخل المنبع جيدا ، والحفاظ على ارتفاع السائل في الخزان فوق ارتفاع في اتجاه مجرى النهر بشكل جيد.
- يتم جمع عينات النفايات في البئر على فترات منتظمة وزنه على ميزان التحليلية.
- ميل منحنى إجمالي حجم التآمر ضد الزمن الكلي يعطي متوسط معدل التدفق الحجمي (الشكل 2). لقد وجدنا ، وخطي استنساخه متوسط السرعات لمجموعة واسعة من رؤساء والضغط من أجل الحفاظ على أنظمة الضغط المختلفة.
III. تدفق التصور ورسم الخرائط السرعة ، والتفاعل ماء / مسعور
- لمعايرة النموذج ، تم الحصول على 3 ميكرومتر الخرز اللاتكس الفلورية في كل السطوح كربوكسي YG YG وسهل من Polysciences ، Inc. وكانت مخففة في الماء DI إلى تركيز المواد الصلبة 0.01 ٪.
- والخرز الذي ينساب من خلال تصور الموائل على مجهر زايس 25 Axiovert مضان مجهزة بكاميرا BCE - B013 - U Mightex أحادية اللون.
- تم القبض على إطارات الفردية في تعاقب سريع وتجميعها في الأفلام مع حزمة البرامج ImageJ (الشكل 3).
رابعا. ميكروفلويديك الأجهزة (EcoChip) للنمذجة نمو البكتيريا والنقل
- ضمة س. كان يزرع GFP اساسه ، وهي غير ممرضة الفلورية الخضراء البروتين معربا عن الحي لمدة 14 ساعة في لوريا ، Bertani المتوسطة لتركيز ما يقرب من 10 9 خلايا / مل.
- أدخلت البكتيريا في وسط النمو في أجهزة EcoChip وسمح لاستعمار ، وإنشاء جهاز flocs والأفلام بين عشية وضحاها لمدة 19 ساعة.
- ثم أزيل وسائط النمو من الآبار وكان مسح جميع الموائل مع مياه البحر الاصطناعي (يرجى الاطلاع على وانغ وآخرون 2 لصفة ASW) بحيث كثافات مختلفة من البكتيريا والمتبقية في بيئات مختلفة.
- وظل أحد الموائل مختومة مع عدم وجود التدفق ، في حين تم الابقاء على ظروف التدفق البطيء في الموائل الأخرى 3.
- تم التقاط الصور وضوء الفلورسنت الأبيض من نمو البكتيريا كل ساعة 15-20 لمدة عدة أيام (الشكل 4).
خامسا نتائج الممثل
وحدة التدفق يوفر وسيلة بسيطة لتنظيم وتوزيع التدفقات من خلال البيئات المتعددة. أثبت تحليل وزني ليكون وسيلة سهلة وبسيطة لتحديد معدلات التدفق من خلال هياكل الموائل ، والتي تعتمد على المقاومة الهيدروليكية للموائل والفروق بين ضغط الإدخال والإخراج الآبار. لتدفق التجارب حبة لاحظنا تراكم حبة أكبر من ذلك بكثير في الجهاز للأسطح الخرز uncarboxylated (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، كانت حبات أكبر قطر و 6 و 10 ملم ، من المحتمل جدا أن يصبح مجرور في فتحات المسام الصغيرة وتبدأ تتراكم في الجهاز. خفض معدلات أسرع تدفق الجسيمات والاحتفاظ entrainment.
خلال تجارب نمو البكتيريا ، وتأثير الظروف تدفق حقيقة جلية. قوى القص المستمر تسبب البكتيريا لتجميع معا وflocs النموذج ، وليس أن تكون كما وجدت الخلايا الفردية. نقل flocs الجرثومية الكبيرة هي عملية هامة البيئية التي من الصعب للغاية للدراسة في النظام العيانية.
الشكل 1. تخطيطي ميزات عرض وتشغيل وحدة التدفق.
الشكل 2. معدل التدفق من خلال الموائل منظم وفقا لما يحدده التحليل الوزني للارتفاعات مختلفة العمود. العمود نسبة الارتفاع : 60 / 40 = 1.5 ، ومعدل تدفق تحديد النسبة : 1.04 / 0.71 = 1.46. معدلات تدفق أسفرت عن 40 مم = هو V = 0.71 ميكرولتر / دقيقة وH = 60 مم هو V = 1.04 μ L / دقيقة. يقدر متوسط السرعات الخطية هي 3.1 ملم / ثانية و 4.6 مم / ثانية على التوالي.
الشكل 3. النقل من الخرز اللاتكس 3um مع وبدون كرسلة الموائل التي تتدفق من خلال منظم.
الشكل 4. التغيير في نمو البكتيريا وتشكيل بيوفيلم بوصفها وظيفة من كثافة البذور في وجود تدفق بطيء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EcoChip النظام قابل للتكيف مع احتياجات تجربة فردية. يمكن إنشاء الأسياد الجدد بسهولة نسبيا ، وبمجرد ملفقة الماجستير ، ويمكن تكرارها يلقي إضافية الأجهزة بالضبط حسب الحاجة. وحدة تدفق سهلة الاستعمال ، لا تحتاج الى معدات خاصة أو اتصالات معقدة ، ويمكن أن تكون على غرار كرئيس بسيطة هبوط ضغط يحركها نظام التدفق. ملحقات اضافية لهذا العمل هي مستمرة ، وتشمل إنشاء قنوات حمض الدبالية المغلفة ، ومتفاوتة بشكل منهجي الكيمياء المائية من السوائل المتدفقة. باستخدام هذا النهج ، يمكن ملاحظة التفاعلات الصغيرة الحجم من البكتيريا مع السطوح والظواهر النمو والنقل في وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها ومباشرة التحقيق فيها بشكل منتظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل # 0649883 منحة من مؤسسة العلوم الوطنية ، من قبل معهد بحوث النظم البيولوجية لفاندربيلت التكاملية والتعليم (VIIBRE) ، ونظم من قبل الأحياء سيرل الهندسة الحيوية والخبرة للبحوث الجامعية (سيرل SyBBURE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | ||
| SU8-2025 | MicroChem Corp. | ||
| Fluorescent Beads | Polysciences, Inc. |
References
- Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).
