使用的视动反应研究斑马鱼的视觉功能

Summary

视动反应已被广泛用来评估幼虫斑马鱼的视觉功能。不过，仔鱼的标准协议尚未容易在成人适用

Abstract

视动反应（OKR）是一种行为，动物振动它的眼睛，按照围绕它旋转的光栅。它已被广泛用来评估幼虫斑马鱼^1-5的视觉功能。不过，仔鱼的标准协议尚未容易在成年zabrafish适用。在这里，我们介绍了如何来衡量我们简单的使用一个新的协议，它是建立在我们的实验室仪器定制的成年斑马鱼OKR。我们的设备和一步一步的在成年斑马鱼OKR的程序说明了这个视频。此外，幼虫OKR的测量，以及optomotor响应（OMR）成年斑马鱼的试验，也表明在这个视频。这OKR检测成年斑马鱼在我们的实验可能会持续长达4小时。这种OKR测试在成鱼中的应用，将有利于更有效的视觉功能调查时的成鱼的视觉系统操纵。

苏邹琦，吴吟本文同等贡献。

Protocol

第一部分：构建OKR仪器

详情载于视频演示。

第二部分：成年斑马鱼OKR

如果您的实验室已经构建了一个OKR仪器，成年斑马鱼OKR的关键是持有的鱼。在这一部分，我们将显示你一步一步。

我们的仪器组成类似其他人所说的以下部分。圆形鱼厅是在外径7.0厘米，内径6.5厘米和7.0厘米高。鼓鱼室周围是出直径8.5厘米，内径7.5厘米和7.0厘米高。它可以顺时针旋转和逆时针旋转速度从20〜70转每分钟（RPM）。 11黑色和白色条纹的周期绘制在描图纸上鼓外坚持。是由两个圆直径21厘米的光管照明系统。

图1。海绵模型 ，在这中间的悬崖，以确保不庇护视野。

1. 由两部分组成，如图1所示海绵。左边部分是长3厘米x宽3厘米x高2厘米。右边部分是长3厘米x宽3厘米x高3厘米。
2. 鱼腔底部的海绵和饲养水倒入约2厘米深度。气泡，隐藏在海绵，应该被扫地出门。
3. 海绵右侧部分的前面插入一根针，后面的悬崖约2毫米。
4. 麻醉在MS - 222的成年斑马鱼。
5. 斑马鱼放在海绵背起来，并允许第一脚前的胸鳍一侧。
6. 第二针插入落后于其他的胸鳍。它可避免斑马鱼萎缩机构合作的第一脚（还可以看到在图2）。
7. 动脉钳固定在一块橡皮（橡皮泥），这是鱼室坚持动脉钳钳它的尾巴。
8. 第三和第四针是种植在现场附近的鱼体内的泄殖腔孔。它可以防止强烈的波尾的斑马鱼。
9. 第五引脚之间的第一和第三针，然后第六针，它的另一侧是选址。他们可以防止晃动它的身体的斑马鱼。
10. 第七次和第八次针插在鱼鳃附近的站点，以保持头部方向。
11. 饲养水倒入鱼室。
12. 斑马鱼被唤醒后，让它适应5〜10分钟。
13. 打开该设备的光，让斑马鱼适应这种照明2分钟。
14. 开关电机驱动光栅，并允许斑马鱼为1分钟，以适应。
15. 打开相机，记录眼睛的运动。
16. 分析眼角⁶和扫视号码，在您的个人电脑（眼睛的角度分析的一个典型的例子是在图2所示）。

图2。轴眼和身体的纵轴之间的角度。

a）当光栅的方向是鼻时空，我们定义的角度，在鱼体内的未来是一种消极的角度，在鱼体内的角度是一个积极的角度来看，反之亦然（也见参考文献的简要回顾。 6）。在此图中的数字代表的引脚顺序。

B）OKR分析的例子从一个在正常对照组的鱼。一秒钟的电影被转移到了一系列帧，每帧的眼睛角度图像Plus软件测量。在这个数字中的每一个点代表我们测得的每一帧。

注：

1. 所有的引脚都只是用来防止摇晃其身体的斑马鱼，过紧将会对鱼类有害。
2. 动脉钳可能会损坏的尾巴，其接触面积小。一旦尾巴是免费的，它非常困难，为了解决这个问题的鱼。缠绕绷带是在一定条件下建议的尾巴。
3. 第七和第八的脚在鳃附近的站点种植不应住房从他们的视线光栅。

第三部分。 OKR斑马鱼的幼体

1。甲基纤维素

斑马鱼幼虫可固定在6％的甲基纤维素溶液，同时保持很长一段时间的活着。准备好如下甲基纤维素的解决方案。

1. 煮沸200毫升DDH ₂ O的微波烤箱约3分钟在较高水平。
2. 传输热水搅拌电热板，并大力搅拌。
3. 逐步添加到热水12克甲基纤维素。
4. 继续搅拌3分钟后，甲基分散。
5. 用冰水冷却，直到它变得清晰的解决方案，然后放置在4 ° C。

1. 两对男性和女性的成年斑马鱼在交配槽喂养17:00后。第二天早晨，他们转移到一个新的交配池，1小时后，收集胚胎。
2. 卵均保持在28.5 ± 0.5 ° C，孵化器与光在胚胎培养基：14:10暗周期。
3. 蛋会孵化出在受精后48小时内（HPF）和OKR将在72 HPF或稍后测试。在这段视频中，幼虫在5 DPF。

3。对OKR程序

1. 将根据配备这种仪器上的CCD相机和开关的立体的仪器。
2. 添加20毫升6％，在一个55毫米的培养皿methycellulose。
3. 将在这个菜排在中锋位置上的几个幼虫。
4. 放一下气泡体积1μL在相机领域，它可以作为镜子反射光栅的方向。
5. 电机开关，并记录他们的眼睛的运动。

第四部分。 OMR的成年斑马鱼

成年斑马鱼也可以用此设备进行OMR，只需将一列，为防止跨鱼游泳中心（显示在图3a，旋转速度为36 RPM，黑白的周期是11）中的鱼室。

1. 把在这种鱼室的鱼。
2. 站在一个2厘米，直径在这种鱼室的中心列。
3. 适应一分钟仍然光栅和旋转光栅。
4. 记录的斑马鱼的运动。
5. 分析您的个人计算机上的时间上的巧合率（一个例子是在图3b所示，旋转速度为36 RPM，黑白的周期是11）

图3。市值租金的成年斑马鱼 。 （一）一个白色的塑料列被放置在防止跨鱼游动的鱼室中心。 （二）以下的成年斑马鱼的符合率光栅。符合率被定义为以下光栅总录音时间的比例。 50％的价值，表明鱼是随机游动，而100％，表明鱼以下光栅很好。这两个视神经被击碎了约10秒钟珠宝钳。粉碎后作为一个随机游动的市值租金的行为出现。

Discussion

据OKR定义，它是一种现象，动物移动他们的眼睛，自发地追求旋转光栅。如果这种行为已经进行了很长一段时间（如在6小时以上），可能是累了，眼部肌肉会衰减OKR。

成年斑马鱼OMR已完全由其他^7。在这段视频中，我们只显示你这种行为与我们的仪器。视神经一旦被压碎，他们可以不遵循这个光栅很好。

我们已经完成OKR行为与我们的简单的定制的仪器测试，以评估对斑马鱼的视觉功能，在成年后，幼虫在成人中的斑马鱼和OMR。这在我们的实验成年斑马鱼的OKR检测，能保持在4小时内足够强大，没有伤害。这可能OKR在成鱼的功能研究的测试，更有效地开拓。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP