ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Summary

視運動性応答は、広く幼虫ゼブラフィッシュの視覚機能を評価するために使用されています。それにもかかわらず、仔魚のための標準プロトコルは、まだ大人に容易に​​適用されていません

Abstract

視運動反応（OKR）は、動物がその周りに回転する格子に従うことに目を振動する動作です。それは広く幼虫ゼブラフィッシュ^1-5の視覚機能を評価するために使用されています。それにもかかわらず、仔魚のための標準プロトコルは、まだ成人zabrafishに容易に適用されません。ここで、我々の研究室で確立される新しいプロトコルを使用して簡単な特注の装置を成人ゼブラフィッシュのOKRを測定する方法を紹介します。私たちの装置と成人のゼブラフィッシュのOKRのステップバイステップの手順の両方がこのビデオに示されています。さらに、幼虫のOKRの測定だけでなく、大人のゼブラフィッシュの微細運動応答（OMR）試験は、またこのビデオでは実証されています。我々の実験における成人のゼブラフィッシュのこのOKRアッセイは、最大4時間まで続くことがある。成魚のビジョンシステムが操作されると、成魚に適用されるようなOKRのテストは、より効率的に視覚機能を調査するために利益になる。

蘇チーゾウと呉陰はこの論文にも同様に貢献した。

Protocol

パートI：OKRの装置を構築

詳細は、ビデオのデモで示されています。

パートII：大人ゼブラフィッシュのOKR

ラボがOKR装置を構​​築している場合は、成人ゼブラフィッシュOKRの鍵は、魚を保持することです。このパートでは、私たちは、あなたがステップバイステップで紹介します。

私たちの装置は、前述の他の人と同様の以下の部分を構成している。円形の魚槽が外径7.0センチ、内径は6.5センチ、高7.0 cmです。魚槽の周りドラムは外直径は8.5センチ、内径は7.5センチ、高7.0 cmです。それは時計回りに20〜スピード〜分当たり70回転（rpm）と反時計回りに回転させることができます。黒と白のストライプの11サイクルは、ドラムの外側に付着したトレーシングペーパーに描かれています。光システムは、21 cmの直径の2つの円形の光のチューブで構成されています。

図1。スポンジのモデルは、この真ん中に作られた崖は、視野が守られていなかったことを確認することです。

1. 図1に示すようにスポンジは二つの部分により構成。左側の部分は長さ3センチメートル×幅3センチ× HIGH 2 cmです。右側の部分は長さ3センチメートル×幅3センチ× 3上位cmです。
2. 魚槽の底にこのスポンジを入れ、約2 cmの深さで飼育水を注ぐ。スポンジで非表示の気泡が追い出されるはず。
3. 崖の背後にある約2mm、スポンジの右側の部分の前にピンを挿入します。
4. MS - 222の大人のゼブラフィッシュを麻酔。
5. 背上にスポンジにゼブラフィッシュを入れて、最初のピンの前にその胸びれの片側を許可する。
6. つ目のピンは、他の胸びれの後ろに挿入されます。それは、最初のピン（これも図2参照）との連携によりゼブラフィッシュ縮小ボディを避けることができます。
7. 動脈と尾をクランプし、魚槽に付着しているゴムの部分（粘土）の動脈のクランプをクランプして固定する。
8. 3番目と4番目のピンは、魚の体の総排泄孔の近くのサイトに植えられている。それは、激しく尾を振ってゼブラフィッシュを防ぐことができる。
9. 番ピンが6番目のピンはそれの反対側にあるし1番目と3番目のピンとの間で土地を選定される。彼らは、その本体を振ってからゼブラフィッシュを防ぐことができます。
10. 7番目と8番目のピンはヘッドの向きを保つために鰓に近い部位に挿入されます。
11. 魚室内の飼育水を注ぐ。
12. ゼブラフィッシュは、ウェイクアップ後に、それは5〜10分間に適応できます。
13. この装置の光のスイッチを入れ、ゼブラフィッシュは、2分間この照明を適応させることができます。
14. 回折格子を駆動し、1分間に適応するためにゼブラフィッシュを許可するモーターのスイッチをオンにします。
15. カメラの電源をオンにし、目の動きを記録。
16. パーソナルコンピュータ（眼角の解析の代表的な例を図2に示されている）で目の角を⁶とサッカードの数字を分析する。

図2。眼軸と体軸との間の角度。

a）は格子の方向は、鼻から頭の場合は、我々は、魚の体の前方に角度を定義し、負の角度であり、魚の体の角度は、正の角度、その逆（簡単なレビューのためにも文献を参照してくださいです。 6）。この図中の数字はピンのシーケンスを表します。

通常のグループ内の1つの魚からb）のOKRの解析例。一第2作は、シリーズのフレームに移し、各フレームの目の角度はイメージ- PRO Plusソフトウェアを用いて測定した。この図の各点は、我々が測定した各フレームを表します。

注意事項：

1. すべてのピンは単にその本体を振ってからゼブラフィッシュを防止するために使用されている、あまりにもタイトな魚に有害になります。
2. その接触面積は小さいものですので動脈のクランプは、尾を損傷する恐れがあります。尾がフリーになると、それはこの魚を修正することは非常に困難S。いくつかの条件で推奨されている尾の周り包帯を巻きます。
3. 鰓に近いサイトに植えられている7番目と8番ピンは格子の彼らの姿から避難すべきではない。

パートIII。幼生ゼブラフィッシュのOKR

1。メチルセルロース

長い間生き続ける間、幼虫のゼブラフィッシュは6％メチルセルロース溶液で固定化することができる。次のようにメチルセルロース溶液を準備します。

1. ハイレベルで約3分電子レンジで沸騰200ミリリットルのddH ₂ O。
2. 攪拌しながらホットプレートにお湯を移し、精力的にそれをかき混ぜる。
3. 徐々にお湯に12gのメチルセルロースを追加。
4. メチルセルロースはよく分散された後、3分間攪拌してください。
5. それが透明になるまで氷水でソリューションを冷却し、4℃に置きます℃に

1. ペア二人の男性と授乳後の17:00交配タンク内の成人ゼブラフィッシュのメス。翌朝は、新鮮な交配のタンクにそれらを転送し、1時間後に胚を収集する。
2. 14時10分の暗サイクル：卵を光で28.5 ± 0.5℃のインキュベーターで胚の培地中に維持されています。
3. 卵は48時間後に受精（HPF）で行わ孵化され、OKRは後で72 HPFまたはでテストされます。このビデオでは、larvaes 5 DPFにあります。

3。 OKRの手順

1. この装置の光をCCDカメラとスイッチを装備したステレオスコープの下に装置を置く。
2. 55 mmのペトリ皿に20ミリリットル6％methycelluloseを追加。
3. この皿の中央にある行でいくつかのlarvaesを置きます。
4. カメラのフィールドに1μlの約気泡を入れて、それは格子の方向を反​​映する鏡として可能性があります。
5. モーターのスイッチを入れ、彼らの目の動きを記録。

パートIV。アダルトゼブラフィッシュのOMR

成人ゼブラフィッシュOMRもこの装置で実施することが、ちょうど（回転速度は黒 - 白のサイクルが11の36回転、つまり、Fig.3aに示した）センター全体で泳ぐ魚を防止するために魚のチャンバー内に列を配置します。

1. この魚のチャンバー内の魚を置く。
2. この魚室の中央に2cmの直径のカラムをスタンド。
3. 両方まだ格子と回転格子で1分のために適合させる。
4. ゼブラフィッシュの動きを記録します。
5. パーソナルコンピュータの時間の一致率を分析する（例は図3bに示されている、回転速度は36 rpmの場合、白黒サイクルは11です）

図3。アダルトゼブラフィッシュのOMR。 （a）の白のプラスチックの列は、それ全体で泳ぐ魚を防止するための魚室の中央に置かれた。 （b）の成人ゼブラフィッシュの一致率は格子に続く。偶然の一致率は、総録音時間は以下の格子の時間の割合と定義した。 50％の値は100％が非常に良く魚の以下の格子を示しながら、魚がランダムに泳いでいることを示しています。両方の視神経が約10秒の宝石鉗子で粉砕された。 OMRの動作は、クラッシュ後にランダム水泳として登場。

Discussion

OKRの定義によれば、それは動物が自発的に回転する格子を追求する彼らの目を移動する現象である。この動作は長い時間（6時間上記の例）のために実施されている場合は、目の筋肉が疲れてかもしれないとOKRは減衰されます。

成人のゼブラフィッシュOMRは他人⁷によって完全に記述されている。このビデオでは、私達はちょうど私達の装置を使用して、この動作を示しています。視神経が潰されると、彼らは非常によくこの回折格子に従っていない可能性があります。

我々は、ゼブラフィッシュの視覚機能を評価するために私たちのシンプルな特注の装置を持つ大人の大人、幼生ゼブラフィッシュとOMRのOKRの動作テストを実施している。我々の実験における成人のゼブラフィッシュのこのOKRアッセイは、それを害することなく、4時間の期間内に十分に強い保つことができる。これにより、より効率的に成魚の機能の研究ではOKRテストを開くことができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP