Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Summary

Risposta optocinetico è stato ampiamente utilizzato per valutare le funzioni visive di zebrafish larvale. Tuttavia, il protocollo standard per il pesce larvale non è ancora facile applicazione negli adulti

Abstract

Risposta optocinetico (okr) è un comportamento che un animale vibra i suoi occhi per seguire un reticolo di rotazione intorno ad esso. E 'stato ampiamente utilizzato per valutare la funzionalità visiva del larvale zebrafish ^1-5. Tuttavia, il protocollo standard per il pesce larvale non è ancora facilmente applicabile nel zabrafish adulti. Qui, vi presentiamo come misurare l'okr di zebrafish adulti con la nostra semplice custom-built apparecchi che utilizzano un nuovo protocollo che è stabilito nel nostro laboratorio. Entrambi i nostri apparecchi e passo-passo procedura di okr in zebrafish adulti sono illustrate in questo video. Inoltre, le misure del okr larvale, così come la risposta optomotor (OMR) prova di zebrafish adulti, sono anche dimostrato in questo video. Questo test okr di zebrafish adulti nel nostro esperimento può durare fino a 4 ore. Prova ad okr applicata nei pesci adulti potranno beneficiare di indagine funzione visiva in modo più efficiente quando il pesce sistema adulti visione è manipolata.

Su-Qi Zou e Wu Yin contribuito in maniera uguale a questo articolo.

Protocol

Parte I: Costruire l'apparato okr

I dettagli sono mostrati in video dimostrativo.

Parte II: okr di adulti Zebrafish

Se il vostro laboratorio ha costruito un apparato okr, la chiave di adulti zebrafish okr è quello di tenere il pesce. In questa parte, noi vi mostrerà passo dopo passo.

Il nostro apparato compone seguenti parti simili ad altri menzionati. La camera di pesce circolare è 7,0 cm di diametro esterno, 6,5 cm di diametro interno e 7,0 cm in alto. Il tamburo intorno camera di pesce è di 8,5 cm di diametro fuori, 7,5 cm di diametro interno e 7,0 cm in alto. Si potrebbe ruotare in senso orario e antiorario con la velocità da 20 ~ 70 rotazioni al minuto (rpm). Undici cicli di strisce bianche e nere sono disegnate su una carta da lucido che hanno aderito sulla parte esterna del tamburo. Il sistema di illuminazione è costituito da due tubi cerchio di luce in 21 cm di diametro.

Figura 1. Il modello di spugna. La scogliera fatti in questo centro è quello di assicurarsi che il campo visivo non era stato riparato.

1. Una spugna come mostrato in Fig.1 composto da due parti. La parte sinistra è lungo 3 cm x 3 cm x larghezza alta 2 cm. La parte destra è lungo 3 cm x 3 cm x larghezza alta 3 cm.
2. Metti questa spugna sul fondo della camera di pesce e versare acqua allevamento in circa 2 cm di profondità. Bolla d'aria che si nascondono nella spugna deve essere cacciati.
3. Inserire un perno nella parte anteriore della parte destra della spugna, a circa 2 mm dietro la scogliera.
4. Anestetizzare uno zebrafish adulto in MS-222.
5. Mettere il pesce zebra in spugna con un massimo dorsale e consentono un lato della sua pinna pettorale prima del primo pin.
6. Il perno è inserito il secondo dietro la pinna pettorale altri. Si potrebbe evitare di zebrafish corpo contrazione collaborando con il primo pin (vedi anche in fig. 2).
7. Pinza la coda con un'arteria morsetto e fissare il morsetto arteria in un pezzo di gomma (plastilina) che è aderito sulla camera di pesce.
8. Il perno terzo e il quarto è piantato nel sito vicino cloacali pori del corpo di pesce. Si potrebbe prevenire zebrafish ad agitare la coda intensamente.
9. Il perno quinto è situato tra il primo e il terzo pin e poi il perno sesto è dall'altra parte di esso. Si potrebbe impedire zebrafish di tremare il suo corpo.
10. Il perno di settimo e ottavo è inserito nei siti vicino la branchia per mantenere l'orientamento della testa.
11. Versare l'acqua nella camera di allevamento di pesce.
12. Dopo che il pesce zebra si sveglia, farla adattare per 5 ~ 10 minuti.
13. Accendere la luce di questo apparecchio e lasciare che zebrafish adattare questa illuminazione per 2 minuti.
14. Accendere il motore di guidare la grata e consentono di adattare zebrafish per 1 minuto.
15. Accendere la fotocamera e registrare i movimenti degli occhi.
16. Analizzare gli angoli degli occhi ⁶ e numeri saccade sul personal computer (un esempio rappresentativo delle analisi occhio angoli è mostrato in Fig.2).

Figura 2. L'angolo tra asse dell'occhio e l'asse del corpo.

a) Quando la direzione del reticolo è nasale-to-temporali, abbiamo definito l'angolo al davanti del corpo di pesce è un angolo negativo e l'angolo al corpo di pesce è un angolo positivo, viceversa (per breve rassegna anche vedere rif. 6). I numeri in questa figura rappresenta la sequenza di pin.

b) analisi okr esempio da un pesce in gruppo normale. Una di un secondo film è stato trasferito in una serie di cornici e gli angoli degli occhi di ogni frame è stata misurata con Image-Pro Plus software. Ogni punto in questa figura rappresenta ogni fotogramma abbiamo misurato.

Note:

1. Tutti i pin sono solo utilizzati per prevenire zebrafish da scuotere il suo corpo, troppo stretto sarà dannoso per i pesci.
2. Morsetto arteria danneggiare la coda come area di contatto è piccola. Una volta che la coda è libera, s molto difficile risolvere questo pesce. Avvolgere una benda intorno alla coda è raccomandato in una certa condizione.
3. Il perno di settimo e ottavo, che sono piantate nel sito vicino branchie non dovrebbe essere al riparo da loro vista di reticolo.

Parte III. Okr larvali di Zebrafish

1. Metilcellulosa

Zebrafish larvale può essere immobilizzato in una soluzione di metilcellulosa al 6%, mentre tenere in vita per molto tempo. Preparare la soluzione di metilcellulosa come segue.

1. Fate bollire 200 ml DDH ₂ O nel forno a microonde circa 3 minuti ad alto livello.
2. Trasferire l'acqua calda ad una cottura mescolando e mescolate energicamente.
3. Aggiungere 12 g di metilcellulosa in acqua calda a poco a poco.
4. Continuare a mescolare per 3 minuti dopo la metilcellulosa è ben dispersa.
5. Raffreddare la soluzione con acqua ghiacciata fino a quando diventa chiaro, e poi posto a 4 ° C.

1. Coppie di due maschi e una femmina di pesce zebra adulta in un serbatoio di accoppiamento alle 17:00 dopo la poppata. La mattina dopo trasferirli ad un serbatoio di accoppiamento fresco e raccogliere embrioni dopo 1 ora.
2. Le uova sono mantenute nel terreno in un embrione 28,5 ± 0,5 ° C incubatore con la luce: buio ciclo di 14:10.
3. Le uova si schiudono dopo 48 ore dopo la fecondazione (HPF) e la okr sarà testato a 72 HPF o in seguito. In questo video, le larve sono solo a 5 dpf.

3. Procedura di okr

1. Mettere l'apparato sotto lo stereoscopio dotato di telecamera CCD e accendere la luce di questo apparato.
2. Aggiungere 20 ml methycellulose 6% in un 55 mm piastra di Petri.
3. Posto le larve in una riga al centro di questo piatto.
4. Mettete una bolla d'aria su un volume di 1 ml nel campo della telecamera, potrebbe essere come uno specchio per riflettere la direzione del reticolo.
5. Accendere il motore e registrare i movimenti dei loro occhi.

Parte IV. OMR di adulti Zebrafish

Adulto zebrafish OMR potrebbe anche essere condotta con questo apparecchio, è sufficiente posizionare una colonna nella camera di pesce per prevenire pesci che nuotano sul centro (mostrato in Fig.3a, la velocità di rotazione è di 36 giri al minuto, in bianco e nero cicli sono 11).

1. Mettere un pesce in questa camera di pesce.
2. Stare una colonna di 2 cm di diametro al centro di questa camera pesce.
3. Adattare per un minuto, sia in ancora grata e grata di rotazione.
4. Registrare il movimento del pesce zebra.
5. Analizzare il tasso di coincidenza del tempo sul proprio personal computer (un esempio è mostrato in Fig.3b, la velocità di rotazione è di 36 giri al minuto, in bianco e nero ciclo 11)

Figura 3. OMR di Zebrafish adulti. (A) Una colonna bianca di plastica è stato posto al centro della camera di pesce per prevenire pesci che nuotano attraverso di esso. (B) Il tasso di coincidenza di zebrafish adulti dopo la grata. Il tasso di coincidenza è stata definita come la percentuale di tempo reticolo di seguito per il tempo di registrazione totale. Il valore del 50% indica che il pesce nuota in modo casuale, mentre al 100% indica la griglia seguente pesce molto bene. Entrambi i nervi ottici sono stati schiacciati con una pinza gioielli circa 10 secondi. Il comportamento di OMR è apparso come una piscina casuale dopo cotta.

Discussion

Secondo la definizione di okr, è un fenomeno che gli animali muovere gli occhi di perseguire un reticolo rotante spontaneamente. Se questo comportamento è stato condotto per lungo tempo (per esempio oltre 6 ore), i muscoli oculari possono essere stanchi e la okr sarà attenuato.

Adulti zebrafish OMR è stato descritto completamente da altri ^7. In questo video, che abbiamo appena ti mostrano questo comportamento con il nostro apparato. Una volta che i nervi ottici sono schiacciati, non potevano seguire questo reticolo molto bene.

Abbiamo effettuato test di comportamento okr in adulti, larve e pesce zebra OMR in adulti con la nostra semplice custom-built apparato per valutare la funzione visiva di zebrafish. Questo test okr di zebrafish adulti nel nostro esperimento potrebbe mantenere abbastanza forte in un periodo di 4 ore senza fare del male esso. Questo potrebbe aprire okr prova in studio per adulti funzione pesce in modo più efficiente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP