Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Summary

Optokinetischen Reaktionen waren weit verbreitet, um die visuellen Funktionen von Larven Zebrafisch zu beurteilen. Dennoch ist das Standardprotokoll für die Fischlarven noch nicht ohne weiteres anwendbar bei Erwachsenen

Abstract

Optokinetischen Antwort (OKR) ist ein Verhalten, dass ein Tier schwingt seine Augen auf eine rotierende Gitter um ihm zu folgen. Es wurde weithin verwendet, um die visuellen Funktionen von Larven Zebrafisch ^1-5 zu bewerten. Dennoch ist das Standardprotokoll für die Fischlarven noch nicht ohne weiteres anwendbar bei erwachsenen zabrafish. Hier stellen wir Ihnen, wie Sie die OKR der erwachsenen Zebrafisch mit unserem einfachen custom-built Gerät mit einem neuen Protokoll, das in unserem Labor etabliert ist, zu messen. Sowohl unsere Apparate-und Schritt-für-Schritt-Verfahren der OKR bei erwachsenen Zebrafisch sind in diesem Video dargestellt. Darüber hinaus sind die Messungen der Larven OKR, sowie die optomotorischen Ansprechen (OMR) Test der erwachsenen Zebrafisch, auch in diesem Video demonstriert. Diese OKR-Assay von erwachsenen Zebrafisch in unserem Experiment kann für bis zu 4 Stunden dauern. Solche OKR-Test bei erwachsenen Fischen angewendet werden, um die Sehfunktion Untersuchung effizienter nutzen, wenn die erwachsenen Fische Vision-System manipuliert wird.

Su-Qi Zou und Wu Yin trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

Protocol

Teil I: Konstruieren Sie die OKR Apparat

Details sind in Video-Demonstration gezeigt.

Teil II: OKR of Adult Zebrafisch

Wenn Ihr Lab einen OKR Apparat konstruiert hat, ist der Schlüssel der erwachsenen Zebrafisch OKR, um die Fische zu halten. In diesem Teil zeigen wir Ihnen Schritt für Schritt.

Unsere Geräte komponiert folgenden Teilen ähnlich zu anderen erwähnt. Die runde Fisch Kammer ist 7,0 cm Außendurchmesser, 6,5 cm Innendurchmesser und 7,0 cm in der Höhe. Die Trommel um Fisch Kammer ist 8,5 cm in Durchmesser, 7,5 cm Innendurchmesser und 7,0 cm in der Höhe. Es könnte im Uhrzeigersinn drehen und gegen den Uhrzeigersinn mit der Geschwindigkeit von 20 ~ 70 Umdrehungen pro Minute (rpm). Elf Zyklen von schwarzen und weißen Streifen auf einem Transparentpapier, die auf der Außenseite der Trommel eingehalten gezogen. Das Lichtsystem besteht aus zwei Kreis Leuchtstoffröhren in 21 cm Durchmesser bestehen.

Abbildung 1. Das Modell der Schwamm. Die Klippe in dieser Mitte aus ist, um sicherzustellen, dass das Gesichtsfeld nicht Geborgenheit.

1. Ein Schwamm wie in Abb.1 dargestellt durch zwei Teilen zusammengesetzt. Der linke Teil ist die Länge 3 cm x Breite 3 cm x 2 cm hoch. Der rechte Teil ist die Länge 3 cm x Breite 3 cm x 3 cm hoch.
2. Diesen Schwamm in der unteren Kammer und Fisch gießen Aufzucht Wasser in ca. 2 cm Tiefe. Luftblase, die in den Schwamm zu verbergen sollten vertrieben werden.
3. Legen Sie einen Stift in der Vorderseite des rechten Teil der Schwamm, ca. 2 mm hinter der Klippe.
4. Anesthetize ein Erwachsener Zebrafisch in MS-222.
5. Setzen Sie den Zebrafisch auf den Schwamm mit dorsaler und ermöglichen einen Seite seiner Brustflosse vor dem ersten Pin.
6. Der zweite Stift befindet sich hinter dem anderen Brustflosse eingefügt. Es könnte Zebrafisch schrumpfenden Körper durch die Zusammenarbeit mit dem ersten Pin (siehe auch in Abb. 2). Zu vermeiden.
7. Clamp seinen Schwanz mit einer Arterienklemme und fixieren die Arterienklemme in einem Stück Gummi (Knetmasse), die auf die Fische Kammer eingehalten wird.
8. Die dritte und vierte Pin ist auf der Website der Nähe cloacal Pore Fischkörper gepflanzt. Es könnte verhindern, Zebrafische, um seinen Schwanz intensiv Welle.
9. Der fünfte Pin ist zwischen dem ersten und dem dritten Pin und dann die sechste Pin ist auf der anderen Seite davon gelegen. Sie könnten Zebrafische aus Schütteln seines Körpers zu verhindern.
10. Die siebte und achte Pin wird an den Standorten in der Nähe der Kiemen eingefügt, um den Kopf Orientierung zu behalten.
11. Gießen Sie Wasser in die Aufzucht der Fische Kammer.
12. Nach dem Zebrafisch aufwacht, lassen Sie es für 5 bis 10 Minuten anzupassen.
13. Schalten Sie das Licht an dieser Vorrichtung und lassen Zebrafisch anzupassen diese Beleuchtung für 2 Minuten.
14. Schalten Sie den Motor mit dem Gitter-Laufwerk und ermöglicht Zebrafisch für 1 Minute anzupassen.
15. Schalten Sie die Kamera und Aufzeichnung der Bewegung der Augen.
16. Analysieren Sie den Augenwinkeln ⁶ und Sakkade Nummern auf Ihrem PC (Ein repräsentatives Beispiel für den Augenwinkeln Analyse ist in Abb. 2 dargestellt).

Abbildung 2. Der Winkel zwischen Auge Achse und Körper-Achse.

a) Wenn die Richtung der Gitter nasal-to-zeitlich ist, definiert man den Winkel, in dem vor der Fische Körper ist ein negativer Winkel und der Winkel, in dem Fische Körper ist ein positiver Winkel, umgekehrt (für kurze Übersicht siehe auch Lit.. 6). Die Zahlen in dieser Abbildung stellen die Reihenfolge der Pins.

b) OKR Analyse beispielsweise von einem Fisch in normalen Gruppe. Eine Ein-Sekunden-Film wurde zu einer Reihe Frames übertragen und den Augenwinkeln jedes Rahmens wurde mit Image-Pro Plus-Software gemessen. Jeder Punkt in dieser Abbildung repräsentiert jedes Bild haben wir gemessen.

Notes:

1. Alle Stifte sind einfach zur Zebrafisch aus Schütteln seines Körpers zu verhindern, zu eng wird als schädlich für Fische.
2. Arterienklemme beschädigen könnte der Schwanz als Kontaktfläche klein ist. Sobald der Schwanz ist frei, s es sehr schwierig, diesen Fisch zu beheben. Wrap einen Verband um den Schwanz ist in eine bestimmte Bedingung empfohlen.
3. Die siebte und achte Stift, der in der Website in der Nähe gill gepflanzt werden, sollten keine Zuflucht sein vor ihren Augen von Gitterrosten.

Teil III. OKR der Larven Zebrafisch

1. Methylcellulose

Larven Zebrafisch kann in 6% Methylcellulose-Lösung immobilisiert werden, während für eine lange Zeit lebendig. Bereiten Methylcellulose-Lösung wie folgt.

1. Kochen 200 ml ddH ₂ O in der Mikrowelle ca. 3 Minuten auf hohem Niveau.
2. Übertragen Sie die heißen Wasser zu einer Heizplatte und rühren kräftig.
3. Fügen Sie 12 g Methylcellulose in das heiße Wasser nach und nach.
4. Keep Rühren 3 Minuten nach Methylcellulose ist gut verteilt.
5. Kühlen Sie die Lösungen mit Eiswasser, bis es klar wird, und dann legen Sie sie bei 4 ° C.

1. Paare zwei männliche und eine weibliche erwachsener Zebrafisch in einem passenden Behälter um 17:00 Uhr nach der Fütterung. Am nächsten Morgen übertragen Sie sie auf eine frische Paarung Tank sammeln und Embryonen nach 1 Stunde.
2. Dunkel-Zyklus von 14:10: Die Eier werden in Embryo-Medium in einem 28,5 ± 0,5 ° C-Inkubator mit dem Licht erhalten.
3. Eier werden bei 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ausgebrütet werden und die OKR wird bei 72 hpf oder später geprüft werden. In diesem Video werden die Larven bei 5 dpf.

3. Vorgehensweise des OKR

1. Setzen Sie das Gerät unter dem Stereoskop mit CCD-Kamera und schalten Sie das Licht dieser Apparat ausgestattet.
2. 20 ml 6% methycellulose in einer 55-mm-Petrischale.
3. Legen Sie mehrere Larven in einer Reihe in der Mitte von diesem Gericht.
4. Legen Sie eine Luftblase über ein Volumen von 1 ul in die Kamera Feld, könnte es als ein Spiegel sein, um die Richtung des Gitters zu reflektieren.
5. Schalten Sie den Motor und notieren Sie die Bewegung ihrer Augen.

Teil IV. OMR of Adult Zebrafisch

Adult Zebrafisch OMR konnte auch mit diesem Gerät durchgeführt werden, sondern wird einfach eine Spalte in der Fisch-Kammer zur Vermeidung Fische schwimmen über Mitte (gezeigt in Abb. 3a, Drehgeschwindigkeit beträgt 36 min, schwarz-weiß-Zyklen sind 11).

1. Setzen Sie einen Fisch in dieser Fisch Kammer.
2. Stand eine Säule von 2 cm Durchmesser in der Mitte dieses Fisches Kammer.
3. Passen Sie für eine Minute sowohl in noch Gitter und Rotation Gitter.
4. Notieren Sie sich die Bewegung der Zebrafisch.
5. Analysieren Sie die Koinzidenz von Zeit auf Ihrem PC (ein Beispiel ist in Abb. 3b gezeigt, Drehgeschwindigkeit 36 ​​rpm ist, ist schwarz-weiß-Zyklus 11)

Abbildung 3. OMR of Adult Zebrafisch. (A) Eine weiße Kunststoff-Säule wurde in der Mitte des Fisches Kammer zur Vermeidung Fische schwimmen über sie gelegt. (B) Das Zusammentreffen von erwachsenen Zebrafisch im Anschluss an die Gitter. Der Zufall lag der Anteil der folgenden Gitter Zeit, um die gesamte Aufnahmezeit definiert. Der Wert von 50% zeigt an, dass der Fisch nach dem Zufallsprinzip schwimmen, während 100% zeigt die Fische folgenden Gitter sehr gut. Beide Sehnerven wurden mit einem Schmuck Pinzette ca. 10 Sekunden zerkleinert. Das Verhalten der OMR erschien als eine zufällige Schwimmen nach zu vernichten.

Discussion

Nach der Definition des OKR, ist es ein Phänomen, dass die Tiere ihre Augen bewegen, um ein rotierendes Gitter spontan zu verfolgen. Wenn dieses Verhalten für eine lange Zeit (zB über 6 Stunden) durchgeführt, kann das Auge Muskeln müde werden und der OKR werden gedämpft.

Adult Zebrafisch OMR wurde komplett von anderen ⁷ beschrieben. In diesem Video zeigen wir Ihnen nur dieses Verhalten mit unserem Gerät. Sobald die Sehnerven zerkleinert sind, könnten sie sich nicht an diese Gitter sehr gut.

Wir haben OKR Verhalten zu testen in der Erwachsenenbildung, Larven Zebrafisch und OMR bei Erwachsenen durchgeführt mit unserem einfachen custom-built Apparat, um die visuelle Funktion des Zebrafisch zu bewerten. Diese OKR-Assay von erwachsenen Zebrafisch in unserem Experiment halten konnte stark genug, innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden, ohne zu schaden. Dies kann eröffnen OKR-Test bei erwachsenen Fischen Funktion Studie effizienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP