Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Summary

Optokinetik yanıt larva zebrafish görsel işlevlerini değerlendirmek için yaygın kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, larva balık için standart bir protokol henüz yetişkinler kolayca uygulanabilir değildir

Abstract

Optokinetik yanıt (okr), bir hayvan, kendi ekseni etrafında dönen ızgara takip gözlerini titreme bir davranış biçimidir. Bu yaygın olarak larva zebrafish ^1-5 görme fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, larva balık için standart bir protokol henüz yetişkin zabrafish kolayca uygulanabilir değildir. Burada, yetişkin zebrafish okr laboratuarımızda yılında kurulan yeni bir protokol kullanarak basit inşa edilen özel bir aparat ile nasıl ölçüleceği tanıtmak. Aparat ve yetişkin zebrafish okr adım adım prosedürü her ikisi de bu video gösterilmiştir. Buna ek olarak, larva okr ölçümleri yanı sıra optomotor yanıt (OMR) yetişkin zebrafish test, aynı zamanda bu video gösterilmektedir. Okr deneyde yetişkin zebrafish Bu tahlil, 4 saate kadar sürebilir. Yetişkin balık görme sistemi manipüle zaman yetişkin balık uygulanan bu okr testi daha verimli bir şekilde görme fonksiyonu soruşturma yararlanacaktır.

Su-Qi Zou ve Wu Yin bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

Protocol

Bölüm I: okr aparat Construct

Detayları video gösterimi gösterilmiştir.

Bölüm II: Yetişkin Zebra balığı okr

Laboratuar okr aparat inşa varsa, yetişkin zebrafish okr anahtar balık tutmak için. Bu bölümde, size adım adım gösterecektir.

Bizim cihaz belirtilen başkalarının benzer aşağıdaki bölümleri oluşturur. Dairesel balık odasının dış çapı 7.0 cm, iç çapı 6.5 cm ve 7.0 cm yüksek. Balık odasının etrafında davul çıkış çapı 8,5 cm, iç çapı 7,5 cm ve 7,0 cm yüksek. ~ 70 dakikada rotasyonlar (rpm) saat yönünde ve saat yönünün 20 ila hızı ile saat yönünün tersine döndürmek. Siyah ve beyaz çizgili Eleven döngüleri davul dışında yapıştırılır aydınger çizilir. Işık sistemi, 21 cm çapında iki daire ışık tüpleri oluşur.

Şekil 1. Sünger modeli. Uçurum bu orta yapılan görme alanı korunaklı olmadığını emin olun.

1. Şekil 1'de gösterildiği gibi bir sünger iki bölümden oluşmaktadır. Sol kısmında 3 cm x genişlik 3 cm x 2 cm yüksekliğinde uzunluğu. Sağ kısmı uzunluk x genişlik 3 cm 3 cm x 3 cm yüksekliğinde.
2. Balık odasının altındaki bu sünger koyun ve yaklaşık 2 cm derinliğinde yetiştirme su dökün. Sünger gizlemek Hava kabarcığı sürülen olmalıdır.
3. Uçurumun arkasında yaklaşık 2 mm, sünger sağ kısmının önünde bir iğne takın.
4. MS-222 yetişkin bir zebrafish anestezisi.
5. Dorsal kadar sünger Zebra balığı koyun ve göğüs yüzgeci bir tarafında ilk pin önce izin.
6. İkinci pin diğer göğüs yüzgeci arkasında eklenir. Bu ilk pin (ayrıca bkz Şekil 2) ile işbirliği yaparak zebrafish küçülen vücut kaçınabilirsiniz.
7. Bir arter balık odasının üzerine yapıştığı kauçuk bir parça (modelleme kil) arter kelepçe kelepçe ve düzeltmek kuyruğunu sıkıştırın.
8. Üçüncü ve dördüncü pin balık vücudun kloakal gözenek yakın site dikilir. Bu yoğun kuyruk dalga zebrafish önleyebilir.
9. Altıncı pin diğer tarafta, daha sonra birinci ve üçüncü pin ve beşinci pin arasındaki oturtulmuş. Vücudu sallayarak zebrafish önleyebilir.
10. Yedinci ve sekizinci pin başkanı yönünü tutmak için solungaç yakın siteler eklenir.
11. Balık odasında yetiştirme su dökün.
12. Zebrafish uyanır sonra, 5 ~ 10 dakika boyunca uyum sağlar.
13. Bu cihazların ışık açın ve zebrafish 2 dakika boyunca bu aydınlatma uyum sağlar.
14. Izgara sürücü ve 1 dakika boyunca adapte zebrafish izin motor açın.
15. Kamerayı açın ve gözleri hareket kayıt.
16. Kişisel bilgisayar (göz açıları analiz temsili bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir) göz açıları ⁶ ve sakkaddan numaraları analiz edin.

Şekil 2 göz ekseni ve vücut ekseni arasındaki açı.

a) ızgara yönünde burun-temporal, negatif bir açı balık vücudun öncesi açı tanımlanmış ve balık vücut açısı, tam tersi olumlu bir açı (kısaca gözden geçirilmesi için de Ref. 6). Bu rakam sayılar pim dizisi temsil eder.

b) normal grupta bir balık okr analiz örneğidir. Bir saniyelik bir film serisi çerçeveler transfer edildi ve her kare göz açıları Image-Pro Plus yazılımı ile ölçüldü. Bu rakam her noktasında ölçülen her kareyi temsil eder.

Notlar:

1. Tüm pinler sadece vücudu sallayarak zebrafish önlemek için kullanılan, çok sıkı balıklar için zararlı olacaktır.
2. Arter kelepçe temas alanı küçük olduğu gibi kuyruk zarar verebilir. Kuyruk sonra, bu balığın düzeltmek için çok zor bu. Bazı koşulların tavsiye kuyruk etrafında bir bandaj sarın.
3. Solungaç yakın site ekilir yedinci ve sekizinci pin ızgara kendi görüş sığınak olmamalıdır.

Bölüm III. Larvaların Zebra balığı, okr

1. Metilselüloz

Uzun bir süre canlı tutmak Larvaların zebrafish% 6 metilselüloz çözüm immobilize edilebilir. Metilselüloz çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın.

1. Mikrodalga fırında yüksek düzeyde yaklaşık 3 dakika kaynatın 200 ml GKD ₂ Ç.
2. Coşkulu bir ocak sıcak su transferi ve kuvvetlice karıştırın.
3. Yavaş yavaş sıcak su içine 12 g metilselüloz ekleyin.
4. Metilselüloz iyi dağınık sonra 3 dakika boyunca karıştırmaya devam edin.
5. Buz su ile çözümler açık hale gelinceye kadar soğutun ve ardından 4 ° C

1. Çiftleri iki erkek ve emzirmeden sonra saat 17:00 'de, yetişkin zebrafish bir çiftleşme tankı bir kadın. Ertesi sabah taze bir çiftleşme tankı aktarabilir ve 1 saat sonra embriyolar toplamak.
2. 14:10, karanlık döngüsü: yumurta ışığı ile 28.5 ± 0.5 ° C inkübatör embriyo ortamda tutulur.
3. Yumurta 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) dışarı yumurtadan olacak ve okr hpf 72 ya da daha sonra test edilecektir. Bu video larvaes 5 dpf'e.

3. Okr, Prosedürü

1. CCD kamera ve bu cihazların ışık anahtarı ile donatılmıştır Stereoskop altında aparat yerleştirin.
2. 55 mm petri 20 ml% 6 methycellulose ekleyin.
3. Bu çanak merkezi bir satır birkaç larvaes yerleştirin.
4. Kamera alanında 1 ul hacmi hakkında bir hava kabarcığı koyun, ızgara yönünü yansıtacak şekilde bir ayna olabilir.
5. Motor açın ve gözlerini hareket kayıt.

Bölüm IV. Yetişkin Zebra balığı, OMR

Yetişkin zebrafish OMR bu aparatı ile de yapılabileceğine, (hız dönen siyah-beyaz döngüsü 11 36 rpm, Fig.3a gösterdi) merkezi arasında balık yüzme önlemek için balık odasında bir sütun.

1. Bu balık odasında bir balık koyun.
2. Bu balığın odanın merkezinde 2 cm çapında bir sütun durun.
3. Bir dakika boyunca her iki hala ızgara ve rotasyon ızgara uyarlayın.
4. Zebrafish hareketi kaydedin.
5. Kişisel bilgisayar zaman tesadüf oranı analiz (bir örnek Fig.3b olarak gösterilir, döner hızı 36 rpm, siyah-beyaz döngüsü 11)

Şekil 3. Yetişkin Zebra balığı OMR. (A), beyaz plastik sütun üzerinde yüzen balıklar önlenmesi için balık odasının ortasına yerleştirildi. (B) yetişkin zebrafish tesadüf oranı ızgara. Tesadüf hızı, toplam kayıt süresi aşağıdaki ızgara zaman oranı olarak tanımlanmıştır. % 50 değer% 100 çok iyi, balık, balık Aşağıdaki ızgara gösterir rastgele yüzme olduğunu gösterir. Her ikisi de yaklaşık 10 saniye bir mücevher forseps ile optik sinirler ezildi. OMR davranışı ezmek sonra rastgele bir yüzme gibi göründü.

Discussion

Okr tanımına göre, hayvanlar, kendiliğinden dönen bir ızgara takip gözlerini hareket ettiğini bir olgudur. Bu davranışı, uzun bir süre (örneğin 6 saat üzerinde) için yapılmıştır varsa, göz kaslarının yorgun olabilir ve okr zayıflatılmış olacaktır.

Yetişkin zebrafish OMR diğerleri ⁷ tamamen tarif edilmiştir. Bu video, biz sadece bizim aparatı ile bu davranışı göstermek. Optik sinirler ezildi sonra, onlar çok iyi bu ızgara olamazdı.

Biz zebrafish görme fonksiyonunu değerlendirmek için basit, özel olarak inşa edilen aparatı ile yetişkin yetişkin, larva, Zebra balığı ve OMR okr davranış testi yapıldı. Bizim deney yetişkin zebrafish Bu okr tahlil zarar vermeden 4 saatlik bir süre içinde yeterince güçlü tutmak. Bu daha verimli yetişkin balık fonksiyon çalışmada okr test açabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP