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Immunology and Infection

रीसस मकाक में सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बहुरंगा प्रवाह cytometry विश्लेषण

Published: April 22, 2010 doi: 10.3791/1743
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Immunology, MD Anderson Cancer Center - University of Texas, 2Department of Medicine, University of Miami

Summary

हम कुल के रूप में अच्छी तरह के रूप में सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं, रीसस मकाक में एचआईवी / एड्स के टीके के अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल की स्मृति सबसेट का विस्तृत प्ररूपी और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए बहुरंगा प्रवाह cytometry की उपयोगिता प्रदर्शित करता है.

Abstract

रीसस मकाक मॉडल वर्तमान रोगजनन समझ करने के लिए सम्मान के साथ एचआईवी एड्स के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध टीकों और चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में मॉडल

Protocol

1) सेल तैयारी और प्रतिजनी उत्तेजना, 2) सतह मार्कर धुंधला हो जाना, 3) Intracellular साइटोकाइन धुंधला हो जाना और 4) प्रवाह cytometry के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टी कोशिकाओं की कुल स्मृति सबसेट का विस्तृत प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं को चार भागों में विभाजित किया जा सकता है विश्लेषण करती है.

1. सेल तैयार करने और प्रतिजनी उत्तेजना

  1. दोनों हौसले के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग क्रायो संरक्षित परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया. PBMC रीसस मकाक के heparinized या citrated शिरापरक रक्त के नमूनों से घनत्व ढाल Ficoll Hypaque (Histopaquen 1077, सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) का उपयोग कर अवसादन के द्वारा अलग किया गया. PBMC के Aliquots संग्रहीत थे, 90% FCS में तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और 10% DMSO.
  2. जब क्रायो - संरक्षित PBMC उपयोग कर, जमी PBMC की शीशियों को तरल नाइट्रोजन से हटा दिया गया और तेजी से एक 37 सी पानी के स्नान में thawed, धीरे मिश्रित RPMI - १,६४० (HyClone प्रयोगशालाओं, लोगान, केन्द्र शासित प्रदेशों) के साथ धोया ठंड मध्यम और हटाने पूरा मीडिया में फिर से निलंबित कर दिया [मुख्यमंत्री, RPMI 10% के साथ 1640 पूरक गर्मी निष्क्रिय FCS (HyClone प्रयोगशालाओं), एल glutamine 2mm (सिग्मा Aldrich), 100U/ml पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen), और 6 में सभ्य - अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें 37 पर रातोंरात ° सी humidified 5% सीओ 2 माहौल में. अगली सुबह, व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती trypan नीले डाई अपवर्जन विधि द्वारा निर्धारित किया गया है और मुख्यमंत्री में फिर से निलंबित कर दिया.
  3. कोशिकाओं को अलग गैर विशिष्ट प्रतिजन बनाम विशिष्ट साइटोकाइन विश्लेषण के बाद उत्तेजना के लिए इलाज किया गया: (क) phorbol 12 myristate के साथ गैर विशिष्ट उत्तेजना के लिए (पीएमए) 13 - एसीटेट और Ionomycin (मैं) (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO), 0.1ml के एक मात्रा में कोशिकाओं के aliquots (1.0 x 10 6 कोशिकाओं को अच्छी तरह /) 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें (बी.डी. बायोसाइंसेज, फ्रेंकलिन झील, न्यू जर्सी) के अलग - अलग कुओं में चढ़ाया गया. PMA और Ionomycin 50ng/ml और 500ng/ml के अंतिम एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया, क्रमशः. 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर की थाली के लिए अंतिम कुल मात्रा 0.2ml/well है: (ख) विशिष्ट प्रतिजन उत्तेजना के लिए, 1.0 x 10 6 कोशिकाओं एक मात्रा 1.0 मिलीलीटर में 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के अलग - अलग कुओं (बी.डी. बायोसाइंसेज में चढ़ाया गया फ्रेंकलिन झील, न्यू जर्सी), जहां कुओं पूर्व इलाज किया गया के रूप में पहले 9 संशोधन के साथ वर्णित है. संक्षेप में, 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें 2.5 μg / एमएल / अच्छी तरह से विरोधी माउस बकरी आईजीजी (एच एल +) 50mm Tris समाधान में (कियर्केगार्ड और पेरी प्रयोगशाला, Gaithersburg, एमडी) (पीएच 8.6) के साथ 4 के लिए लेपित किया गया डिग्री सेल्सियस रातोंरात. अगली सुबह प्लेटें बाँझ पीबीएस और सह stimulatory MAB CD49d, क्लोन 9F10 (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) के साथ दो बार धोया गया 10 μg / मिलीलीटर जोड़ा गया / 37 पर एक घंटे के लिए incubating द्वारा अच्छी तरह से पीछा डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के बाद, प्लेटें कमरे के तापमान पर दो बार बाँझ पीबीएस के साथ धोया गया. ब्याज की प्रतिजनों सहित छह एचआईवी लिफाफा 8 पेप्टाइड्स के कॉकटेल (प्रत्येक पेप्टाइड 10μg/ml के अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया था अकेले मुख्यमंत्री में कोशिकाओं के साथ अतिरिक्त कुओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तैयार किया गया. 24 में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह अंतिम कुल मात्रा अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट 1.0 मिलीलीटर था.
  4. कोशिकाओं 6 घंटे के लिए 37 सुसंस्कृत थे डिग्री सेल्सियस humidified 5% सीओ 2 माहौल में. Brefeldin एक 10μg/ml (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) में उत्तेजना की अंतिम 4.5 घंटे के लिए संस्कृति से जोड़ा गया है. बाद में, कोशिकाओं 5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया और साथ धोया ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) प्रवाह धोने बफर (Dulbecco पीबीएस (DPBS, 2 Ca / 2 मुक्त मिलीग्राम; जीवन प्रौद्योगिकियों के साथ, रॉकविल, एमडी) 2% गर्मी निष्क्रिय FCS), और फिर विभिन्न प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना करने के लिए कार्रवाई की.

2. Immunofluorescence सतह धुंधला मार्करों

  1. प्रेरित कोशिकाओं को पहले 4 बजे 1ul / रहते मृत fixable एक्वा फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई के साथ दाग थे ° सी 30 मिनट के लिए अंधेरे में, ठंड प्रवाह धोने बफर के साथ एक बार धोया.
  2. फिर, निम्नलिखित उचित titrated प्रतिदीप्ति लेबल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कोशिकाओं को जोड़ा गया: विरोधी CD3 (SP34-2), Alexa700 विरोधी CD8 (RPA-T8), विरोधी CD28 PerCP cy5.5 (L293) Cy7 पीई विरोधी CD95 (DX2) APC और विरोधी CD4 प्रशांत (OKT4) नीले, eBioscience (सैन डिएगो, CA) से बी.डी. बायोसाइंसेज (फ्रेंकलिन झील, न्यू जर्सी) से CD4 छोड़कर, सभी प्रशांत नीले (OKT4). कोशिकाओं को 4 बजे 30 मिनट ° सी के लिए अंधेरे में incubated रहे थे.
  3. प्रत्येक प्रयोग के लिए दोनों मुआवजा और नियंत्रण प्रतिदीप्ति शून्य (FMO) नियंत्रण 10,11 उपयोग किया गया. मुआवजा को नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक व्यक्ति अन्य डिटेक्टरों में दाग के spillover coeffecients को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया. मुआवजा नियंत्रण के लिए, से एक बंदर की सेल निलंबन युक्त ट्यूबों का एक पूरा सेट फ्लोरोसेंट संयुग्मित MAB के साथ दाग थे व्यक्तिगत एकल रंग के धब्बे के रूप में. FMO एक बहुरंगा धुंधला संयोजन है कि सभी अभिकर्मकों लेकिन ब्याज की एक शामिल है और एक सकारात्मक के बीच सीमा का निर्धारण किया जाता हैएन डी ऑटो प्रतिदीप्ति स्तर और डेटा duplicating द्वारा नकारात्मक पूरी तरह से सना हुआ नमूना जनसंख्या में उपस्थित थे.
  4. सना हुआ कोशिकाओं तो ठंड प्रवाह धोने बफर के साथ धोया गया, और / निर्धारण permeabilization समाधान (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) में कम से कम 10 मिनट के लिए तय की है (इस स्तर पर कोशिकाओं 4 में रात भर संग्रहीत कर सकते हैं ° C अंधेरे में) intracellular साइटोकाइन धुंधला प्रदर्शन से पहले.

3. Intracellular साइटोकाइन धुंधला

  1. फिक्स्ड कोशिकाओं प्रवाह धोने बफर के साथ धोया गया, और फिर पेर्म / धो बफर (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार जोड़ा गया है. संक्षेप में, कोशिकाओं 0.1ml 1X पेर्म / 4 में 10 मिनट के लिए बफर धो ° सी अंधेरे में में incubated रहे थे.
  2. बाद में, कोशिकाओं के साथ incubated रहे थे उचित titrated FITC लेबल विरोधी IFN-γ (B27) और पीई लेबल 4 बजे 60 मिनट के लिए विरोधी आईएल 2 (MQ1 17H12) ° सी के अंधेरे में.
  3. तो कोशिकाओं permeabilization समाधान के साथ दो बार धोया गया
  4. अंतिम धोने के बाद, कोशिकाओं DPBS में 1% paraformaldehyde में फिर से निलंबित कर दिया और 24 घंटे के भीतर प्रवाह cytometry विश्लेषण के अधीन थे.

4. प्रवाह cytometry विश्लेषण

  1. या सियान ADP (Dako, Carpinteria, सीए), सना हुआ कोशिकाओं LSR द्वितीय प्रवाह (सैन जोस, CA बी.डी. बायोसाइंसेज) cytometer पर हासिल किया गया. FACS FlowJo सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार, Ashland, OR) का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया.
  2. चित्रा. 1 gating एक प्रतिनिधि जानवर से अलग टी सेल सबसेट के विश्लेषण के लिए उपयोग योजना से पता चलता है. लिम्फोसाइटों आगे तितर बितर (FSC) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) के माध्यम से पहली बार gated थे, और फिर जीना लिम्फोसाइटों एसएससी और एक्वा नकारात्मक जनसंख्या के आधार पर पहचान की गई. CD3 भीतर टी कोशिकाओं तो सकारात्मक थे CD3 + CD8 (सीडी 4 + टी कोशिकाओं CD4 के पता लगाने) द्वारा पीछा अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की और सीडी 4 सीडी 8 + (CD8 + टी कोशिकाओं) आबादी + टी सेल की आबादी. + CD4 और CD8 + टी कोशिकाओं आगे (तमिलनाडु, + CD28 CD95 -) अनुभवहीन, केंद्रीय स्मृति (TCM, CD28 + CD95 +) और effector स्मृति (मंदिर, CD28-CD95 +) कोशिकाओं के रूप में के रूप में CD28 और CD95 अभिव्यक्ति के आधार पर थे विभिन्न सबसेट में प्रतिष्ठित साहित्य 5, 10 में वर्णित है .
  3. चित्रा. 2 से पता चलता है कैसे सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं के विभिन्न सबसेट cytokine उत्पादन के मामले में PMA और ionomycin (PMA मैं +) के साथ उत्तेजना के जवाब में कार्यात्मक (INF-γ और / या आईएल -2) क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया.

5. प्रतिनिधि FACS डेटा

रीसस मकाक में PBMC संरचना FACS विश्लेषण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. चित्रा 1 gating एक प्रतिनिधि पशु से अलग टी सेल सबसेट के विश्लेषण के लिए उपयोग योजना से पता चलता है. लिम्फोसाइटों आगे तितर बितर (FSC) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) के माध्यम से पहली बार gated थे, और फिर जीना लिम्फोसाइटों एसएससी और एक्वा नकारात्मक जनसंख्या के आधार पर पहचान की गई. टी कोशिकाओं तो CD3 अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई. CD3 के भीतर आबादी सीडी 4 + CD8 (सीडी 4 + टी कोशिकाओं) और सीडी 4 सीडी 8 + (CD8 + टी कोशिकाओं) + टी सेल की आबादी भी निर्धारित किया गया है. जैसा चित्रा 2 में दिखाया गया है, + CD4 और CD8 + टी कोशिकाओं आगे भोले (तमिलनाडु, CD28 +-CD95), केंद्रीय (TCM, + + CD95 CD28) स्मृति और effector (स्मृति मंदिर के रूप में CD28 और CD95 अभिव्यक्ति के आधार पर थे विभिन्न सबसेट में प्रतिष्ठित, CD28-CD95 +) कोशिकाओं. चित्रा 2A INF-γ से पता चलता है और unstimulated और / PMA ionomycin उत्तेजित + CD4 टी कोशिकाओं, और सबसेट, और चित्रा 2B में उत्पादन आईएल - दो INF-γ और unstimulated और / PMA ionomycin CD8 उत्तेजित + टी कोशिकाओं में उत्पादन आईएल - 2 से पता चलता है, और सबसेट नोट: अलग cytokine प्रोफाइल प्रत्येक सबसेट में उत्तेजना द्वारा हासिल है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Gating रणनीति रीसस macqaues में PBMC संरचना के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 2a
चित्रा 2b
चित्रा 2. (ए) कुल सीडी 4 + टी कोशिकाओं और कैंपेन्स. Cytokine उत्पादन प्रोफ़ाइल (बी) कुल CD8 + टी कोशिकाओं और कैंपेन्स के cytokine उत्पादन प्रोफ़ाइल. कृपया यहाँ क्लिक 2a का एक बड़ा संस्करण, या यहाँ देख आंकड़ा 2b का एक बड़ा संस्करण के लिए .

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Acknowledgments

डॉ. प्रमोद Nehete और श्रीमती भारती Nehete मकाक रक्त और PBMC नमूने के लिए, इस काम आंशिक रूप से NIH अनुदान ऐ 46969 से धन द्वारा समर्थित किया गया, और सभी सेल संस्कृति मीडिया सेंट्रल मीडिया प्रयोगशाला द्वारा उत्पादित किए गए थे, जो NIH अनुदान CA द्वारा वित्त पोषित है 16672.

Materials

Solution and Buffers
  • Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
  • L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
  • 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4 °C
  • Dulbecco's PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
  • Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4 °C
  • BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)

Activation agents
  • Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
  • Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein

Cytokine secretion inhibitors
  • Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
  • Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)

Antibodies
  • Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
  • CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
  • CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
  • IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)

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References

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जौव इम्यूनोलॉजी 38 अंक इम्यून रिस्पांस cytokine उत्पादन फ्लो Cytometry एचआईवी रीसस मकाक टी कोशिकाओं intracellular cytokine धुंधला FACS
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He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., … More

He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J. Vis. Exp. (38), e1743, doi:10.3791/1743 (2010).

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