Summary
Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.
Abstract
Die Rhesusaffen-Modell ist derzeit das beste verfügbare Modell für HIV-AIDS in Bezug auf das Verständnis der Pathogenese sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapeutika
Protocol
1) Zellpräparation und antigene Stimulation, 2) Surface Marker-Färbung, 3) Intrazelluläre Zytokinfärbung und 4) Durchflusszytometrie: Die Verfahren für die detaillierte phänotypische und funktionelle Analysen von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von T-Zellen lassen sich in vier Teile geteilt werden Analysen.
1. Handy Vorbereitung und Antigenstimulation
- Beide frisch isolierten als auch kryokonserviert peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) wurden in diesem Protokoll verwendet. Die PBMC wurden aus heparinisiertem oder Citrat-venöse Blutproben von Rhesusaffen durch Dichtegradientenzentrifugation Sedimentation mit Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) isoliert. Aliquots von PBMC wurden eingefroren gelagert in 90% FCS und 10% DMSO in flüssigem Stickstoff.
- Bei Verwendung der kryokonservierten PBMC wurden die Ampullen von gefrorenen PBMC aus flüssigem Stickstoff entnommen und schnell in einem 37 C Wasserbad aufgetaut, vorsichtig gemischt, gewaschen mit RPMI-1640 (HyClone Labors, Logan, UT), um die Einfriermedium und entfernen in komplettem Medium resuspendiert [CM; RPMI-1640 ergänzen mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS (HyClone Labors), 2 mM L-Glutamin (Sigma-Aldrich), 100U/ml Penicillin / Streptomycin (Invitrogen), und kultiviert in 6 - well-Zellkulturplatten über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre. Am nächsten Morgen wurden Anzahl der lebensfähigen Zellen durch den Trypan-Blau-Farbstoff Ausschluss-Verfahren ermittelt und in CM resuspendiert.
- Die Zellen wurden unterschiedlich für unspezifische gegen Antigen-spezifische Stimulation durch Zytokin-Analysen gefolgt behandelt: (a) Für nicht-spezifische Stimulation mit Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) und Ionomycin (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Aliquots von Zellen in einem Volumen von 0,1 ml (1,0 x 10 6 Zellen / well) wurden in die einzelnen Vertiefungen der 96-well-Zellkulturplatten (BD Biosciences, Franklin See, NJ) beschichtet. Die PMA und Ionomycin wurden bei einer Endkonzentration von 50ng/ml und 500ng/ml eingesetzt, bzw.. Die endgültige Gesamtvolumen für 96-Well-Zellkultur Platte 0.2ml/well: (b) zur Antigen-spezifischen Stimulation, 1,0 x 10 6 Zellen in einem Volumen von 1,0 ml wurden in einzelnen Vertiefungen der 24-well-Zellkulturplatten (BD Biosciences vernickelt , Franklin See, NJ), wo die Brunnen wurden vorbehandelt wie zuvor mit der Modifikation 9 beschrieben. Kurz gesagt, wurden die 24-well-Zellkulturplatten mit 2,5 pg / ml / well Ziege anti-Maus IgG (H + L) (Kierkegaard und Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) in 50 mM Tris-Lösung (pH 8,6) für 4 ° C Übernachtung. Am nächsten Morgen die Platten zweimal mit sterilem PBS und kostimulatorischen mAb CD49d, Klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) wurden gewaschen wurden bei 10 pg / ml / well, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach der Inkubation wurden die Platten zweimal mit sterilem PBS bei Raumtemperatur gewaschen. Die Antigene von Interesse (einschließlich Cocktail aus sechs HIV-Envelope-Peptiden 8 wurden bei einer Endkonzentration von 10μg/ml jedes Peptids aufgenommen. Zusätzliche Bohrungen mit Zellen in CM allein als negative Kontrolle wurden vorbereitet. Die endgültige Gesamtvolumen für jedes Well der 24 -Well-Platte wurden 1,0 ml.
- Die Zellen wurden für 6 Stunden bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Atmosphäre. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wurde die Kultur bei 10μg/ml für die letzten 4,5 Stunden Stimulation aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen in 5 ml Polypropylen-Röhrchen überführt und mit kaltem (4 ° C) fließen Waschpuffer (Dulbecco PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-frei; Life Technologies, Rockville, MD) mit 2% hitzeinaktiviertem FCS), und dann für die Färbung mit den verschiedenen Fluoreszenz-markierten Antikörpern verarbeitet.
2. Immunfluoreszenz Oberflächenmarker Färbung
- Stimulierten Zellen wurden zunächst mit 1UL Live / Dead fixierbar aqua fluoreszierenden Reaktivfarbstoff bei 4 ° C gefärbt im Dunkeln für 30 Minuten, wäscht einmal mit kalten Fluss Waschpuffer.
- Dann werden die folgenden entsprechend titriert Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern, die Zellen wurden hinzugefügt: anti-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28 PerCP-Cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) und anti CD4 Pacific Blue (OKT4), alle von BD Biosciences (Franklin See, NJ), außer CD4 Pacific Blue (OKT4) von eBioscience (San Diego, CA). Die Zellen wurden für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert.
- Für jedes Experiment sowohl Entschädigung Kontrollen und Fluoreszenz minus eins (FMO) steuert 10,11 ausgenutzt wurden. Compensation Kontrollen wurden verwendet, um das Übergreifen coeffecients der einzelnen Flecken in anderen Detektoren zu bestimmen. Für die Kompensation Kontrollen wurden ein kompletter Satz von Rohren mit Zellsuspensionen von einem Affen mit fluoreszierenden konjugierten mAb einzeln als einzigen Farbflecken gefärbt. FMO ist eine mehrfarbige Färbung Kombination, die alle Reagenzien, aber der eine von Interesse enthält, und wird verwendet, um die Grenze zwischen bestimmeneinen positiven und negativen Bevölkerung durch Duplizieren Autofluoreszenz Ebene und Daten in vollem Umfang gefärbten Probe.
- Gefärbte Zellen wurden dann mit kaltem Fluß Waschpuffer gewaschen und fixiert Fixierung / Permeabilisierung-Lösung (BD Biosciences, San Jose, CA) für mindestens 10 Minuten (in diesem Stadium können die Zellen über Nacht bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit) bevor intrazelluläre Zytokin-Färbung.
3. Intrazelluläre Zytokinfärbung
- Fixierten Zellen wurden mit Durchfluss-Waschpuffer gewaschen und dann Perm / Wash-Puffer (BD Biosciences, San Jose, CA) wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers aufgenommen. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 0,1 ml des 1X Perm / Wash-Puffer für 10 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln inkubiert.
- Anschließend wurden die Zellen mit inkubiert die entsprechend titriert FITC-markierten anti-IFN-γ (B27) und PE-markierten Anti-IL-2 (MQ1-17H12) für 60 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln.
- Anschließend wurden die Zellen zwei weitere Male mit der Permeabilisierung Lösung gewaschen
- Nach dem letzten Waschen wurden die Zellen in 1% Paraformaldehyd in DPBS re-suspendiert und Durchflusszytometrie-Analyse innerhalb von 24 Stunden.
4. Durchflusszytometrie
- Oder Cyan ADP (Dako, Carpinteria, CA); Die gefärbten Zellen wurden auf einem LSR II Durchflusszytometer (San Jose, CA BD Biosciences) erworben. FACS-Daten wurden mit Hilfe FlowJo Software (Tree Star, Ashland, OR) analysiert.
- Abbildung. 1 zeigt die Gating System für die Analyse der verschiedenen T-Zell-Subsets aus einer repräsentativen Tier eingesetzt. Die Lymphozyten wurden zunächst gated via forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC), und dann leben Lymphozyten wurden basierend auf SSC und Aqua-negative Population identifiziert. Die T-Zellen wurden dann positiv CD3-Expression durch den Nachweis der CD4 + CD8-(CD4 + T-Zellen), gefolgt identifiziert und CD4-CD8 + (CD8 + T-Zellen) Populationen innerhalb des CD3 + T-Zell-Population. Die CD4 + und CD8 + T-Zellen wurden weiter in verschiedene Untergruppen auf der Basis von CD28 und CD95 Expression als naiv (Tn, CD28 + CD95-), zentralen Speicher (TCM, CD28 + CD95 +) und Effektor-Memory-(TEM, CD28-CD95 +) Zellen unterschieden in der Literatur beschriebenen 5, 10.
- Abbildung. 2 zeigt, wie die verschiedenen Untergruppen der CD4 + und CD8 + T-Zellen für die funktionelle Kapazität in Bezug auf die Produktion von Zytokinen (INF-γ und / oder IL-2) in Reaktion auf die Stimulation mit PMA und Ionomycin (PMA + I) bewertet wurden.
5. Vertreter FACS-Daten
PBMC Zusammensetzung in Rhesusaffen wurde mittels FACS-Analyse. Abbildung 1 zeigt die Gating System für die Analyse der verschiedenen T-Zell-Subsets aus einer repräsentativen Tier eingesetzt. Die Lymphozyten wurden zunächst gated via forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC), und dann leben Lymphozyten wurden basierend auf SSC und Aqua-negative Population identifiziert. Die T-Zellen wurden dann durch CD3 Expression identifiziert. CD4 + CD8-(CD4 + T-Zellen) und CD4-CD8 + (CD8 + T-Zellen) Populationen innerhalb des CD3 + T-Zell-Population wurden ebenfalls bestimmt. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurden die CD4 + und CD8 + T-Zellen weiter in verschiedene Untergruppen auf der Basis von CD28 und CD95 Expression als naiv (Tn, CD28 + CD95-), zentralen Speicher (TCM, CD28 + CD95 +) und Effektor-Memory (Tem unterscheiden, CD28-CD95 +) Zellen. Abbildung 2A zeigt INF-γ und IL-2-Produktion in unstimulierten und PMA / Ionomycin stimuliert CD4 + T-Zellen und Teilmengen und 2B zeigt INF-γ und IL-2-Produktion in unstimulierten und PMA / Ionomycin stimuliert CD8 + T-Zellen und Teilmengen Beachten Sie die unterschiedlichen Zytokin-Profile, hervorgerufen durch Stimulation in jeder Teilmenge.
Abbildung 1. Gating-Strategie für die durchflusszytometrische Analyse von PBMC Zusammensetzung in Rhesusaffen verwendet macqaues
Abbildung 2. (A) Zytokin-Produktion Profil des gesamten CD4 + T-Zellen und Teilmengen. (B) Zytokin-Produktion Profil des gesamten CD8 + T-Zellen und Untergruppen.
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Acknowledgments
Dr. Pramod Nehete und Frau Bharti Nehete für Makaken Blut und PBMC-Proben; Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus NIH AI 46969 unterstützt, und alle Zellkulturmedien wurden von der Zentralen Media Laboratory hergestellt, die von NIH CA finanziert wird 16672.
Materials
Solution and Buffers |
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Activation agents |
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Cytokine secretion inhibitors |
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Antibodies |
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References
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