Summary
Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.
Abstract
Резус-макаки модель в настоящее время наилучшие имеющиеся модели для ВИЧ-СПИД в отношении понимания патогенеза, а также для разработки вакцин и методов лечения
Protocol
Процедуры для подробного фенотипических и функциональных анализов от общего числа, а также памяти подмножества Т-клеток может быть разделена на четыре части: 1) подготовка клеток и антигенной стимуляции, 2) Поверхность маркер окрашивание, 3) внутриклеточные окрашивания цитокинов и 4) Проточная цитометрия анализы.
1. Подготовка клетки и антигенной стимуляции
- Оба свежевыделенных а также крио сохранившийся мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) были использованы в этом протоколе. РВМС были изолированы от гепаринизированной или цитратной венозной крови резус-макак от градиента плотности оседания использованием Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Луис, Миссури). Аликвоты РВМС хранились замороженными в 90% FCS и 10% ДМСО в жидком азоте.
- При использовании крио сохранившийся РВМС, флаконы замороженных РВМС были сняты с жидким азотом и быстро талых в водяной бане 37 С, осторожно перемешивают, промывают RPMI-1640 (Hyclone лабораторий, Логан, Юта), чтобы удалить замораживанием средних и ресуспендировали в полной СМИ [CM; RPMI-1640 добавка с 10% тепла инактивированной FCS (Hyclone лабораторий), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 100U/ml пенициллина / стрептомицина (Invitrogen), и культивировали в 6 - луночных культуры ткани в течение ночи при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 атмосферы. Следующим утром, жизнеспособного-клеток были определены трипанового-синего красителя методом исключения и повторно приостановлено в CM.
- Клетки обрабатывали по-разному для неспецифической против антиген-специфической стимуляции следует цитокинов анализа: (а) для неспецифической стимуляции форбол 12-миристат-13-ацетат (PMA) и иономицина (I) (Sigma-Aldrich, Санкт- Луис, Миссури), аликвоты клеток в объеме 0,1 мл (1,0 х 10 6 клеток / лунку) высевали в отдельных скважинах 96-луночного культуре ткани пластин (BD Biosciences, Франклину озеро, Нью-Джерси). PMA и иономицина использовались в конечной концентрации 50ng/ml и 500ng/ml, соответственно. Окончательный общий объем для 96-луночного планшета для культуры ткани 0.2ml/well: (б) Для антиген специфической стимуляции, 1,0 х 10 6 клеток в объеме 1,0 мл помещали в отдельных скважинах 24-луночного культуре ткани (BD Biosciences , Франклин озеро, Нью-Джерси), где скважины были предварительно обработаны, как описано выше с модификацией 9. Одним словом, 24-луночного культуры ткани были покрыты 2,5 мкг / мл / лунку антимышиного IgG (H + L) (Кьеркегор и Перри лаборатории, Gaithersburg, MD) в 50 мМ Трис решение (PH 8,6) на 4 ° C за одну ночь. На следующее утро пластины дважды промывают стерильной PBS и костимулирующих мАт CD49d, клон 9F10 (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния) были добавлены в 10 мкг / мл / лунку следуют путем инкубирования в течение одного часа при температуре 37 ° C. После инкубации планшеты дважды промывают стерильной PBS при комнатной температуре. Антигены, представляющие интерес (в том числе коктейль шести ВИЧ конверт пептидов 8 были добавлены в конечной концентрации 10μg/ml каждого пептида. Дополнительная скважин с ячейками в СМ только были подготовлены в качестве отрицательного контроля. Окончательный общий объем для каждой скважины из 24 -хорошо культуре ткани пластины 1,0 мл.
- Клетки культивировали в течение 6 часов при температуре 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 атмосферы. Brefeldin (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) добавляют к культуре в 10μg/ml для окончательного 4,5 часа стимуляции. Затем клетки переносили в 5 мл пробирок полипропилена и промывают холодной (4 ° С) поток промывочного буфера (PBS Дульбеко (DPBS, Ca 2 / Mg 2-бесплатно; Жизнь технологий, Роквилл, штат Мэриленд) с 2% тепла инактивированной ФТС), а затем обрабатываются для окрашивания различных флуоресценции меченых антител.
2. Иммунофлуоресценции маркеров поверхности окрашивание
- Вынужденное клетки были впервые окрашивали 1UL живых / мертвых поправимо аква флуоресцентных красителей реактивной при 4 ° С в темноте в течение 30 минут, один раз промывали холодной промывочный буфер потока.
- Затем, следующие надлежащим титруют флуоресценции меченых моноклональных антител были добавлены к клеткам: анти-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), анти-CD8 Alexa700 (РПА-T8), анти-CD28-PerCP cy5.5 (L293) , анти-CD95 APC (DX2) и анти CD4 Pacific Blue (OKT4), все из BD Biosciences (Franklin озеро, Нью-Джерси), за исключением CD4 Pacific Blue (OKT4) от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния). Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4 ° С в темноте.
- Для каждого эксперимента как компенсацию управления и флуоресценции минус один (FMO) контролирует 10,11 были использованы. Компенсация контроля были использованы для определения распространения coeffecients каждого отдельного пятна в других детекторов. Для компенсации управления, полный набор пробирки, содержащие клеточные суспензии, от одного из обезьяны были окрашены флуоресцентной сопряженных мАт индивидуально, как одного цветового пятна. FMO является сочетание многоцветная окраска, которая содержит все реагенты, но один из интереса и используется для определения границы между положительнымиго отрицательного населения путем дублирования автоматического уровень флуоресценции и данные присутствуют в полном окрашенных образцов.
- Витражи клетки затем промывают холодной промывочный буфер потока, и фиксируется в фиксации / пермеабилизации решение (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), по крайней мере, 10 минут (на данном этапе клетки могут храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте) Перед выполнением внутриклеточного окрашивания цитокинов.
3. Внутриклеточного окрашивания цитокинов
- Фиксированные клетки промывали поток промывочного буфера, а затем Пермь / промывочного буфера (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния) была добавлена в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, клетки инкубировали в 0,1 мл из 1X Пермь / промывочного буфера в течение 10 минут при температуре 4 ° С в темноте.
- Затем клетки инкубировали с надлежащим титруют FITC-меченого анти-IFN-γ (B27) и ПЭ-меченых анти-IL-2 (MQ1-17H12) в течение 60 минут при 4 ° С в темноте.
- Затем клетки промывали два раза с пермеабилизации решение
- После последней промывки, клетки были вновь приостановлены в 1% параформальдегида в DPBS и подвергнуты анализу потока цитометрии в течение 24 часов.
4. Анализ проточной цитометрии
- Окрашенных клеток были приобретены на LSR II потока цитометр (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) или голубой ADP (Dako, Карпинтерия, Калифорния). FACS данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
- Рис. 1 показана схема стробирования используются для анализа различных Т-клеток подмножеств из представителей животного. Лимфоцитов были впервые закрытого через рассеяния вперед (FSC) по сравнению стороне рассеяния (SSC), а затем жить лимфоциты были определены на основе сотрудничества Юг-Юг и аква-отрицательных населения. Т-клетки затем были идентифицированы по CD3 выражение с последующей точкой обнаружения CD4 + CD8-(CD4 + Т-клеток) и CD4-CD8 + (CD8 + Т-клеток) в популяции CD3 + Т-клеточной популяции. CD4 + и CD8 + Т-клеток были дополнительно разделены на различные подмножества на основе CD28 и CD95 выражения наивных (Тп, CD28 + CD95-), центральной памяти (TCM, CD28 + CD95 +) и эффекторных памяти (Tem, CD28-CD95 +) клеток описанные в литературе 5, 10.
- Рис. 2 показано, как различные подмножества CD4 + и CD8 + Т-клеток была проведена оценка функционального потенциала с точки зрения продукции цитокинов (INF-γ и / или IL-2) в ответ на стимуляцию с РМА и иономицина (PMA + I).
5. Представитель FACS данных
РВМС состава макак-резус определяли с помощью анализа FACS. На рисунке 1 показана схема стробирования используются для анализа различных Т-клеток подмножеств из представителей животного. Лимфоцитов были впервые закрытого через рассеяния вперед (FSC) по сравнению стороне рассеяния (SSC), а затем жить лимфоциты были определены на основе сотрудничества Юг-Юг и аква-отрицательных населения. Т-клетки затем были определенные CD3 выражения. CD4 + CD8-(CD4 + Т-клеток) и CD4-CD8 + (CD8 + Т-клеток) в популяции CD3 + Т-клеточной популяции были также определены. Как показано на рисунке 2, CD4 + и CD8 + Т-клеток были дополнительно разделены на различные подмножества на основе CD28 и CD95 выражения наивных (Тп, CD28 + CD95-), центральной памяти (TCM, CD28 + CD95 +) и эффекторных памяти (Tem, CD28-CD95 +) клеток. Рисунок 2А показывает, INF-γ и ИЛ-2 производства в нестимулированных и PMA / иономицина стимулировали CD4 + T-клеток, а подмножества, а на рисунке 2B показывает, INF-γ и ИЛ-2 производства в нестимулированных и PMA / иономицина стимулировали CD8 + Т-клеток, и подмножества Обратите внимание на различных профилей цитокинов, вызванные стимуляцией в каждом подмножестве.
Рисунок 1. Память стратегия для проточной цитометрии анализа РВМС состава резус macqaues. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2. (А), продукция цитокинов профиля от общего числа CD4 + Т-клеток и множества. (B) продукции цитокинов профиля от общего числа CD8 + Т-клеток и подмножества. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию 2а, или здесь для увеличения фигуры 2b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Доктор Прамод Nehete и миссис Bharti Nehete для макаки крови и РВМС образцов; Эта работа была частично поддержана за счет средств гранта NIH А.И. 46969, и все средства массовой информации культуре клеток были произведены Центральной Media Laboratory, которая финансируется за счет гранта NIH CA 16672.
Materials
Solution and Buffers |
|||
|
|||
Activation agents |
|||
|
|||
Cytokine secretion inhibitors |
|||
|
|||
Antibodies |
|||
|
References
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
