Summary
식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다
Protocol
1. 세포 벽 절연
- iWall를 사용하여 2 ML Sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공과 함께 약 60 70mg 공기 또는 동결 건조 식물 소재를 갈아, 분쇄 및 분배 로봇 (30 S). 볼 - 밀 (retschmill)를 사용하여 대안이 아닌 로봇 낮은 처리량 절차는 2 부 2 제공됩니다.
- 적절 지상 소재, 그리고 철저하게 소용돌이 70 % 에탄올 수용액의 1.5 ML를 추가합니다.
- 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기.
- 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다.
- 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들.
- 10,000 10 분에 대한 RPM 및 표면에 뜨는를 대기음 또는 가만히 따르다에서 원심 분리기.
- 아세톤 500 μl에 Resuspend 펠릿.
- 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발.
필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. - 샘플에서 전분의 제거를 시작하려면 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼 산도 5.0 1.5 ML의 펠렛을 resuspend.
- 20 분 대한 Sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에.
- 얼음에 정지를 쿨.
- 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 0.01 % 나트륨 azide (NaN3) 35 μl, 35 μl 아밀라아제 (50 μg / ML H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 17.8 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡.
- 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상.
- 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분.
- 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분)와 뜨는 포함 solubilized 전분을 삭제.
- , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centrifuging 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오.
- 아세톤 500 μl에 Resuspend 펠릿.
- 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다.
마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면.
2. 리그닌 함량
이 방법은 후쿠시마와 하트 3보고 방식을 기반으로합니다.
- 1 무게 - 준비 세포 벽 재료의 1.5 MG (1 참조) 빈에 대한 빈 튜브를 떠나는 두 ML의 판매량 플라스크에 있습니다.
- 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 μl와 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발.
- 부드럽게 물 튀기지을 방지하기 위해 튜브 벽을 따라 신선한 만든 아세틸 브로마이드 솔루션 100 μl (25 % 빙초산에 V / V 아세틸 브로마이드)를 추가합니다.
- 50 캡 판매량의 술병과 열 ° 2 시간을위한 C
- 매 15 분 vortexing과 추가 시간 동안 가열.
- 상온에 얼음 쿨.
- 2M 수산화 나트륨과 신선한 0.5 M 히드록 실 아민 염산염의 70 μl 400 μl를 추가합니다. 와동 용적의 flasks.
- 빙초산, 모자와 정확히 2.0 ML 표시 용적 플라스크를 입력하고 혼합을 여러 번 반전.
- 피펫 200 UV 특정 96 잘 판에 솔루션의 μl와 280nm에서 엘리사 Reader에서 읽어보세요.
- (; 풀밭 = 17.75; 포플러 = 18.21 Arabidopsis = 15.69) 적절한 계수를 사용하는 아세틸 브로마이드 가용성 리그닌 (% ABSL)의 비율을 결정하는 다음 수식과 :
% ABSL CALC :
UG / MG 세포 벽 단위에서 10 %의 결과와 함께 ABSL의 증식
그것은 적어도 3 판은 입자가 흡광도 값에서 약간의 변화를 일으킬 수 있기 때문에 흡광도 (ABS)을 평균 읽습 할 수 있도록 도와줍니다. 참고 : 0.539 cm가 pathlength를 나타내고 있지만, 플레이트에 따라이 결정해야 할 수도 있습니다.
3. 리그닌 성분
이 방법은 로빈슨과 맨스필드 5 발표된 최근 메서드에서 채택됩니다.
- thioacidolysis위한 나사 덮인 유리관에 세포 벽 재료의 약 2 MG (1을 참조하십시오.) 전송합니다.
- 조심스럽게 2.5 % 붕소 trifluoride 디에틸 etherate (BF 3) 10 % 에탄티올 (EtSH) 솔루션을 준비합니다. 당신은 질소와 dioxane 병에 잃어버린 볼륨을 치환하기 위해 질소 가스로 가득 풍선을 사용해야합니다. Dioxane 매우 위험한이며, 후드 밖으로 샘플이나 장비를하지 않습니다. 20 μl EtSH,, 5 μl BF 3 175 μl dioxane : 볼륨 샘플 당 솔루션의 준비했습니다.
- EtSH, BF 3, 각 샘플에 dioxane 솔루션을 200 μl를 추가합니다.
- 바로 질소 가스와 모자와 퍼지 유리 상부.
- 100 히트 ° 부드러운 혼합 매 시간과 4 시간 동안은 C.
- 5 분 얼음에 냉각하여 최종 반응.
- 0.4M 나트륨 중탄산염 150 μl, 소용돌이 추가
- 청소 물 1 ML과 에틸 아세테이트, 소용돌이 0.5 ML를 추가하고 (아래에서 위로, 물, 에틸 아세테이트에) 단계 분리하게하십시오.
- 2 ML Sarstedt 튜브에 에틸 아세테이트 층 150 μl을 전송합니다. 물이 전송이되지 있는지 확인하십시오.
- 공기와 농축기로 용매를 증발.
- (두 번 총 반복 초과하는 물을 제거) 200 μl 아세톤을 추가하고 증발.
- TMS의 derivatization에 대한 에틸 아세테이트 500 μl, 피리딘 20 μl, 그리고 N 100 μl, O - BIS (trimethylsilyl) 각 튜브에 acetamide를 추가합니다.
- 25 2 시간 동안 품어 ° C.
- GC / MS 유리병에 반응 100 μl를 전송하고 아세톤 100 μl를 추가합니다.
- quadrupole 대량 분광계 또는 불꽃 이온화 검출기가 장착된 GC로 샘플을 분석할 수 있습니다. 애질런트 HP - 5MS 컬럼은 (X 0.25 mm X 0.25 μm의 필름 두께 30mm)으로 설치됩니다. 다음 온도 기울기는 30 분 용매 지연과 1.1 ML / 분 유량과 함께 사용됩니다 : 130에서 초기 개최 · 3 분 C, 3 ° 250 C / 분 램프 ° C 1 분 만요, 수 130 ° C.의 초기 온도 평형
- 봉우리는 tetracosane 내부 표준 (옵션)를 사용하여 상대 유지 시간 또는 299의 특성 질량 스펙트럼 이온에 의해 식별 M / Z, 269m / Z, 그리고 239m / S, G에 대한 Z와 H 단량체, 각각 (그림을 참조하십시오. 2). 리그닌 구성 요소의 구성은 100 %로 총 피크 영역을 설정하여 계량입니다
4. 대표 결과
벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. thioacidolysis 및 TMS - derivatization 후 리그닌 - 구성 요소의 분리 예제 크로마토 그램이 표시됩니다. 분명의 상대적 풍부한 syringyl - (S), guaiacyl - (G) 및 P - hydroxyphenol - (H) 단위가 결정하실 수 있습니다. 아세틸 브로마이드 가용성 리그닌의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 하나는 아세틸 브로마이드는 벽에 리그닌 현재의 모든 solubilize하고, solubilization의 정도는 물질에 따라 달라질 수 있습니다하지 않습니다한다. 그러나,이 방법은 비교적 수행하는 간단하고 신속하고 리그노셀룰로오스성 물질의 리그닌 내용의 훌륭한 근사치를 제공합니다.
그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 월 자료는 아세틸 브로마이드와 UV - 분광하여 계량 solubilized 리그닌과 함께 처리됩니다. 리그닌 성분의 결정에 대한, 벽면 소재는 thioacidolysis를 받게됩니다. solubilized phenolics는 TMS의 derivatization를 받아야하고 분리 및 GC - MS 분석에 의해 계량하실 수 있습니다. 매트릭스 다당류 성분과 결정 셀룰로스 컨텐츠 프로토콜 2 부 2 설명되어 있습니다.
그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜을 받게되었습니다.
Ligin 조성, H P - 히드록시 페닐, G guaiacyl, S syringyl 단위.
Discussion
설명 방법은 리그닌 함량과 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. iWall 로봇을 사용하여 약 350 샘플은 지상과 하루에 적절하게 사용하실 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 사용 프로토콜은 여기에 설명된 30 샘플은 리그닌 함량에 대한 처리하고, 하루 리그닌 성분 15 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.
Acknowledgments
우리는 최고의 기술 서비스와 존 랄프 귀중한 조언, 토론 및 포플러 나무 샘플에 대해 위스콘신 대학의 매튜 로버트 웨더에게 감사하고 있습니다. 이 작품은 과학의 오피스 에너지의 미국학과 (DOE) 대호 Bioenergy 연구 센터 (과학 DE - FC02 - 07ER64494의 DOE BER 사무소)와 화학 과학 Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학 사무소에 의해 재정 지원되었다 에너지 미국학과 (보너스 번호. DE - FG02 - 91ER20021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | |
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | |
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | |
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
