Summary
Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Polyphenol-Lignin.
Abstract
Der Bedarf an erneuerbaren, klimaneutralen und nachwachsenden Rohstoffen für die Industrie und die Gesellschaft hat sich zu einem der drängendsten Probleme des 21. Jahrhunderts. Dies hat das Interesse an der Verwendung von pflanzlichen Erzeugnissen als industrielle Rohstoffe für die Produktion von flüssigen Kraftstoffen für den Transport neu entfacht
Protocol
1. Zellwand Isolation
- Grind etwa 60-70mg von Luft-oder gefriergetrocknete Pflanzenmaterial mit 5,5 mm Edelstahl-Kugeln in einem 2 ml Sarstedt Schraubverschluss Röhrchen mit einem iWall, ein Mahlen und Abfüllen Roboter (30 s). Eine Alternative nicht-Roboter-low-Durchsatz-Verfahren unter Anwendung einer Kugelmühle (retschmill) ist in Teil II 2 dargestellt.
- Fügen Sie 1,5 ml 70% wässrigem Ethanol auf die verzichtet Mahlgut und gründlich vortexen.
- Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min zur Pelletierung der Alkohol unlöslichen Rückstand.
- Verwerfen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 1,5 ml Chloroform / Methanol (1:1 v / v) Lösung des Rückstandes und schütteln Rohr gründlich, um das Pellet zu resuspendieren.
- Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min und Verwerfen des Überstandes.
- Pellet in 500 ul Aceton.
- Das Lösungsmittel wird mit einem Luftstrom bei 35 ° C, bis es trocken.
Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden. - Zur Einleitung der Entfernung von Stärke aus der Probe das Pellet in 1,5 ml einer 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 5,0.
- Cap der Sarstedtröhrchen und Wärme für 20 min. bei 80 ° C in einem Heizblock.
- Kühlen Sie die Suspension auf Eis.
- Fügen Sie die folgenden Substanzen, um das Pellet: 35 ul von 0,01% Natriumazid (NaN 3), 35 ul Amylase (50 ug / mL H 2 O, von Bacillus-Arten, Sigma), 17 ul Pullulanase (17,8 Einheiten aus Bacillus acidopullulyticus; Sigma) . Cap der Röhre und gründlich vortexen.
- Die Suspension wird über Nacht bei 37 ° C in den Shaker. Die Ausrichtung der Rohre horizontal Helfer eine bessere Durchmischung.
- Hitze Suspension bei 100 ° C für 10 min in einem Heizblock, um die Verdauung zu kündigen.
- Zentrifuge (10.000 rpm, 10 min) und Überstand verwerfen, die solubilisierten Stärke.
- Waschen Sie die verbleibende Pellet dreimal durch Zugabe von 1,5 ml Wasser, Vortexen, Zentrifugieren und Dekantieren des Waschwassers.
- Pellet in 500 ul Aceton.
- Das Lösungsmittel wird mit einem Luftstrom bei 35 ° C, bis es trocken. Es kann notwendig sein auch zu brechen das Material in der Röhre mit einem Spatel für eine bessere Trocknung.
Das getrocknete Material präsentiert isoliert Zellwand (Lignocellulose). Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden.
2. Ligningehalt
Diese Methode basiert auf einem gemeldeten Methode Fukushima und Hatfield 3.
- Wiegen Sie 1 bis 1,5 mg vorbereitet Zellwandmaterial (siehe 1) in 2 ml-Messkolben der Ausfahrt aus einer Tube leer für einen Rohling.
- Spülen Rohrwandungen mit 250 ul Aceton an die Zellwand Material auf den Boden des Röhrchens zu sammeln und verdampft das Aceton sehr sanft unter Luftstrom.
- Vorsichtig mit 100 ul frisch gemacht Acetylbromid-Lösung (25% v / v Acetylbromid in Eisessig) entlang der Rohrwände um Spritzer zu vermeiden.
- Cap-Messkolben und Wärme bei 50 ° C für 2 Stunden
- Wärme für eine zusätzliche Stunde mit Vortexen alle 15 Minuten.
- Cool auf Eis auf Raumtemperatur.
- Add 400 ul 2M Natronlauge und 70 ul frisch zubereitete 0,5 M Hydroxylaminhydrochlorid. Vortex-Messkolben.
- Füllen Sie Messkolben genau auf die 2,0 ml Marke mit Eisessig, verschließen und mehrmals zu mischen.
- Je 200 ul der Lösung in eine UV spezifischen 96-Well-Platte und las in einem ELISA-Reader bei 280nm.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der Acetylbromid Lignin (% ABSL) unter Verwendung eines geeigneten Koeffizienten (Pappel = 18.21; Grasses = 17,75; Arabidopsis = 15,69) mit folgender Formel:
% ABSL Calc:
Multiplikation% ABSL mit 10 Treffern in der ug / mg Zellwand-Einheit
Es hilft zu tun mindestens 3 Platte liest die Absorption (abs), da Partikel können eine leichte Variation in Extinktionswerte Ursache Durchschnitt. Hinweis: 0,539 cm stellt die Schichtdicke, sondern in Abhängigkeit von der Platte könnte dies müssen bestimmt werden.
3. Ligninzusammensetzung
Diese Methode ist aus einer neueren Methode von Robinson und Mansfield 5 veröffentlicht hat.
- Etwa 2 mg der Zellwand-Material (siehe 1.) In einer Schraube verschlossen Glasrohr für thioacidolysis.
- sorgfältig vorbereiten 2,5% Bortrifluoriddiethyletherat (BF 3), 10% Ethanthiol (EtSH)-Lösung. Sie müssen einen Luftballon mit Stickstoff gefüllt, um die verlorenen Volumens im Dioxan Flasche mit Stickstoff zu verdrängen. Dioxan ist sehr gefährlich, nicht nehmen Proben oder Geräte aus der Haube. 20 pl EtSH;; 5 pl BF 3 175 ul Dioxan: Volumes für die Vorbereitung der Lösung pro Probe benötigt.
- Add 200 ul EtSH, BF 3, Dioxanlösung zu jeder Probe.
- Purge Vial Kopfraum mit Stickstoffgas und sofort wieder aufsetzen.
- Hitze auf 100 ° C für 4 Stunden unter leichtem Mischen jede Stunde.
- End Reaktion durch Kühlen auf Eis für 5 Minuten.
- Add 150 ul 0,4 M Natriumbicarbonat, Wirbel
- Für den Clean-up 1 ml Wasser und 0,5 ml Ethylacetat, Wirbel und lassen Phasen zu trennen (Ethylacetat auf, Wasser auf der Unterseite).
- Transfer 150 ul des Ethylacetatschicht in ein 2 ml Sarstedt Röhrchen. Achten Sie darauf, kein Wasser übertragen wird.
- Dampft Lösungsmittel durch einen Konzentrator mit Luft.
- Geben Sie 200 ul Aceton und verdampft (Wiederholung für insgesamt zwei Mal zu entfernen überschüssiges Wasser).
- Für die TMS-Derivatisierung add 500 ul Ethylacetat, 20 ul Pyridin, und 100 ul N, O-Bis (trimethylsilyl) acetamid in jedes Röhrchen.
- inkubieren für 2 Stunden bei 25 ° C.
- Transfer-100 ul der Reaktion in ein GC / MS Fläschchen und 100 ul Aceton.
- Analysieren Sie die Proben durch GC mit einem Quadrupol-Massenspektrometer oder Flammenionisationsdetektor ausgestattet. Ein Agilent HP-5ms-Säule installiert ist (30 mm x 0,25 mm X 0,25 um Filmdicke). Die folgenden Temperaturgefälle ist mit einem 30 min Lösungsmittel Verzögerung und einem 1,1 ml / min Durchfluss verwendet: Initial halten bei 130 ° C für 3 min; 3 ° C / min Rampe zu einer 250 ° C und für 1 min halten; ermöglichen Equilibrierung auf die ursprüngliche Temperatur von 130 ° C.
- Peaks werden von relativen Retentionszeiten mit Tetracosan interner Standard (optional) oder durch charakteristische Massenspektrum Ionen von 299 identifizierten m / z, 269 m / z und 239 m / z für S, G, H und Monomere sind (siehe Abb.. 2). Die Zusammensetzung des Lignin-Komponenten wird durch die Einstellung der gesamten Peakfläche um 100% quantifiziert
4. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für eine Wand-Analyse ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Fall Pappel Stamm (Holz) wurde durch die verschiedenen Verfahren in das Protokoll Abschnitt beschrieben analysiert. Ein Beispiel-Chromatogramm der Trennung von Lignin-Komponenten nach thioacidolysis und TMS-Derivatisierung wird angezeigt. Offensichtlich ist die relative Häufigkeit von Syringyl-(S), Guaiacyl-(G) und p-hydroxyphenol-(H)-Einheiten bestimmt werden kann. Für den Inhalt der Acetylbromid Lignin ist selbsterklärend, kann man erwarten, Werte zwischen 20-50% der Wand Trockengewicht. Man sollte beachten, dass Acetylbromid nicht lösen alle das Lignin in der Wand, und dass der Grad der Solubilisierung kann variieren je nach Material. Allerdings ist dieses Verfahren relativ einfach durchzuführen und eine schnelle und gibt einen hervorragenden Angleichung der Ligningehalt in einer Lignocellulose-Material.
Abbildung 1:. Übersicht von Lignocellulose-Analyse Zellwände (Lignocellulose) werden aus Rohöl getrocknetes Pflanzenmaterial isoliert. Die Wand wird anschließend in Aliquots gewichtet und unterteilt für die verschiedenen Tests. Das Wandmaterial ist mit Acetylbromid und das gelöste Lignin durch UV-Spektroskopie quantifiziert behandelt. Für die Bestimmung der Ligninzusammensetzung ist Wandmaterial thioacidolysis unterzogen. Die solubilisierten Phenole unterziehen TMS-Derivatisierung und kann dann getrennt und quantifiziert werden durch GC-MS-Analyse. Die Matrix Polysaccharid Zusammensetzung und kristalline Cellulose-Gehalt Protokoll wird in Teil II 2 diskutiert.
Abbildung 2:. Umfassende lignocellulosischen Analyse von Pappelholz Hackschnitzel aus Pappel (Populus tremoloides) wurden zu den beschriebenen Protokollen unterzogen.
Ligin Zusammensetzung; H p-hydroxyphenyl; G Guaiacyl; S Syringyleinheiten.
Discussion
Die beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle quantitative Beurteilung der Ligningehalt und Zusammensetzung von Lignocellulose-Biomasse-Anlage. Mit dem iWall Roboter ca. 350 Proben können Boden und abgegeben werden pro Tag. Der Durchsatz der verschiedenen analytischen Methoden pro Person variiert. Mit der beschriebenen Protokolle hier aus können 30 Proben für Ligningehalt verarbeitet werden, und 15 für Ligninzusammensetzung pro Tag. Durch die quantitative Natur der Daten optimal Rohstoff Getreide können Sorte oder Genotypen in Bezug auf ihre Eignung für die Produktion von Biokraftstoffen bewertet werden.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass Matthew Robert Weatherhead für einen exzellenten technischen Service und John Ralph, University of Wisconsin für wertvolle Ratschläge, Diskussionen und die Pappel Probe. Diese Arbeit wurde vom US Department of Energy (DOE) Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) und von der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science finanziert , US Department of Energy (Preis-Nr. DE-FG02-91ER20021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydroxylamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 255580 | |
| Acetyl Bromide | Aldrich | 135968 | |
| Ethanethiol | Sigma-Aldrich | E3708 | |
| Borontrifluoride diethyl etherate | Fluka | 15719 | |
| N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide | Fluka | 15241 | |
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 296309 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 6890 GC/5975B MSD | (lignin composition) |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates. J Vis Exp. , (2010).
- Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method. J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Robinson, A. R., Mansfield, S. D. Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling. Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
