Summary
نحن نطبق التسمية خالية من تحليل التفاعل البروتين باستخدام X100 Biacore للهيكل وظيفة تحليل الربط العديد من المسوخ B cystatin إلى غراء من خلال توصيف الحركية. المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) يقيس تركيز البروتين مع النشاط ملزم الاحتفاظ دون الحاجة إلى منحنى القياسية. نظهر أن تأكيد باستخدام تركيزات CFCA يزيد من مصداقية هذا التحليل الحركي ويمكن أن يعتمد عليه أن يحدد الثوابت الحركية حتى إذا تم خفض نشاط بروتين المؤتلف.
Abstract
في هذه الدراسة ، ونحن استكشاف التفاعل بين الابقار البروتيني السيستين باء cystatin المانع وشكل غير نشط من غراء حفاز (الشكل 1) ، وهو الأنزيم البروتيني السيستين النباتية ، في الوقت الحقيقي من خلال تحليل التسمية خالية باستخدام X100 Biacore. ويتم إنتاج العديد من المتغيرات B cystatin مع الطفرات نقطة في مجالات التفاعل مع غراء. لكل cystatin الخيار باء نحدد تركيزه ملزمة محددة باستخدام المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) وقارن بين القيم التي تم الحصول عليها مع تركيز البروتين الكلي وفقا لما يقرره
Protocol
الشكل 1. الهيكل ثلاثي الأبعاد للمجمع cystatin B (الأزرق) مع غراء (الصفراء). وتظهر بقايا باء تحور cystatin باللون الأحمر.
1. مبادئ التحليل تسمية خالية من التفاعل باستخدام نظم Biacore
في تجربة نموذجية خالية من التسمية ملزمة باستخدام نظام Biacore ، تسميته جزيء حيوي هو تعلق "يجند" على سطح رقاقة الاستشعار. نظام لقنوات تدفق يجلب شريكتها ملزمة ، يسمى 'الحليلة ، في اتصال مع سطح الرقاقة ، حيث كشف تأخذ مكان. عندما الحليلة بربط يجند ، يتم الكشف عن التغيير الشامل مما أدى إلى تراكم على سطح سطح مأكل بواسطة الرنين (SPR). استجابة SPR يتناسب مع كمية الحليلة ملزمة.
منذ يقاس ملزمة في الوقت الحقيقي ، يمكن تحديد الجمعية الحركية والثوابت معدل تفارق لتفاعل معين. من هذه الثوابت ، فمن الممكن لحساب النسب كما تفارق توازن ثابت. ومن الممكن أيضا لحساب النسب من بيانات حالة ثابتة ملزمة. ويمكن أيضا أن تستخدم منهجية مماثلة لتحديد تركيز البروتين الذي يربط خصيصا ليجند على السطح.
2. تحليل الخصائص الحركية للتفاعل البروتين البروتين
في Biacore X100 ، يمكن إجراء التحليل الحركي باستخدام دورة واحدة حركية. في تجربة واحدة دورة حركية ، ويتم حقن سلسلة تركيز الحليلة في تحليل دورة واحدة دون تجديد السطح في بين الحقن. لذلك ، واحد يمكن تحليل دورة حركية الحركية عندما يكون من الصعب العثور على شروط التجديد مناسبة.
مرة واحدة وقد تم جمع البيانات عن التجربة الحركية ، Biacore برامج التقييم X100 يولد قيم ك ، د ك ، K و D عن طريق تركيب البيانات لنموذج التفاعل.
3. نهج لتحديد تركيز البروتين
تحليل التفاعلات بين الجزيئات الحيوية أمر مهم لفهم وظيفتها. تميز ملزم للبروتينات للبروتينات أخرى ، الحمض النووي ، أو الجزيئات الصغيرة هو أمر أساسي للبحوث الكيمياء الحيوية ، ويرى استخدامها في العديد من المجالات الأخرى بما في ذلك اكتشاف المخدرات.
لقياس دقيق لحركية التفاعل بين اثنين من البروتينات المتفاعلة من الضروري معرفة تركيز بروتين ملزمة على وجه التحديد في العينة التجريبية التي تستخدم في تحليلها. قراءة معمل من 280 ألف أو المقايسات اللونية مثل شائع واحد يعمل كاشف برادفورد لتحديد مجموع تركيز البروتين. ومع ذلك ، يمكن الشوائب البروتين يؤثر على النتيجة. الأهم من ذلك ، يتم تضمين كل من أشكال نشطة وغير نشطة من البروتين في تركيز البروتين الكلي. لا سيما في حالة من البروتينات المؤتلف ، والتي قد تكون خاملة بسبب لطي غير صحيحة ، فمن المهم تحديد نسبة البروتين ملزمة على وجه التحديد في العينة.
في X100 Biacore يمكن ، إما تركيز المتعلقة بالنشاط ملزمة محددة يحددها مقارنة مستويات استجابة ملزمة لمنحنى المعايرة المستمدة من معيار معروف ، أو باستخدام معايرة خالية منهجية تحليل وعرض في الآونة الأخيرة التركيز (CFCA). CFCA لا تعتمد على لمعيار. لذلك ، CFCA مفيد بشكل خاص في حالة دراسة أشكال متحولة من البروتينات ، حيث المعايير هي عادة ليست متوفرة.
في تجربة CFCA ، ويقاس معدل الأولي ملزم في معدلات التدفق في ظل ظروف مختلفة عندما نشر العينة على سطح الرقاقة هو معدل الحد. معامل نشر في الحليلة ، تؤخذ الأبعاد للخلية تدفق ومعدلات التدفق في الاعتبار عند حساب تركيز محددة وملزمة من معدل 1،2 ملزمة الأولي.
في تجربة حركية ، يتم استخدام تركيز الحليلة في حساب معدل جمعية حركية مستمرة والتقارب من البيانات التجريبية. CFCA والحركية في نظم القياس Biacore كلا تعتمد على خصائص التفاعل نفسه. لذا ، وذلك باستخدام تركيز محددة وملزمة يحددها التحليل Biacore ، بدلا من تركيز البروتين الكلي ، وزيادة موثوقية النتائج.
4. باستخدام التحليل Biacore لوصف التفاعل بين B Cystatin وغراء
الثدييات B cystatin هو عكسها ، مثبط البروتين تنافسية وضيق ملزم للproteinases غراء مثل السيستين ، وفي المقام الأول كاتيبسين B ، H ، K ، L S. وتشارك بشكل رئيسي في هذه البروتينات nonsاختيارية تدهور البروتين داخل الخلايا. يفترض Cystatins لحماية الخلايا والأنسجة من التحلل البروتيني غير لائقة من هذه الأنزيمات. كما أنها تعطيل proteinases السيستين من الطفيليات والفيروسات ويمكن أن تشارك في الدفاع ضد غزو من هذه العوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تمنع عدة cystatins proteinases السيستين النبات ، مثل غراء ، والتي كثيرا ما يستخدم باعتباره نموذجا الانزيم في بنية وظيفة الدراسات. البنية الثلاثية الأبعاد للcystatin ب معقدة مع معارض 3 غراء التي تهيمن على التفاعل بين اثنين من البروتينات الاتصالات مسعور ، والتي ، من الجانب المانع ، يتم توفيرها من قبل N - C - وتنتهي الحلقات النهائية والقاسي اثنين ( الشكل 1). في هذه الدراسة ، ندرس أهمية انتهاء محطة C - second وحلقة ربط للB cystatin ملزمة باستخدام غراء cystatin البقري B المتغيرات التي تحتوي على الطفرات نقطة في مجالات التفاعل مع غراء. علينا أولا تحديد تركيز محددة وملزمة من المتغيرات cystatin B الأربع المستخدمة ، فضلا عن أنه نوع من البروتين البرية. مرة واحدة يتم تحديد تركيزات محددة وملزمة باء cystatin نشطة ، يتم قياس معدل والثوابت تقارب من نوع البرية والمتغيرات الطافرة باء cystatin ملزمة باستخدام غراء Biacore X100.
5. الصك والكواشف
- المتغيرات B cystatin Cys3Ser/His75Gly ، Cys3Ser/Leu73Gly ، ويتم إنتاج Cys3Ser/Tyr97Ala Cys3Ser سابقا كما هو موضح 4. جميع المسوخ تحتوي على بدائل إضافية من السيستين لسيرين في الموضع 3 ، لمنع تشكيل ثاني كبريتيد مرتبطة dimers نشط باء cystatin
- مستعد أيضا هدفا غراء كما هو موضح سابقا 5. فمن S - (methylthio) غراء (MMTS - غراء) وجود مجموعة methylthio المرفقة Cys25 في الشق نشطة ، مما يجعل البروتيني حفاز نشط.
- يستخدم مع Biacore X100 X100 Biacore بلس باقة لقياس وتحليل تركيزات محددة وملزمة ملزمة وحركية.
- ويجمد MMTS - غراء على CM5 باستخدام رقاقة الاستشعار Biacore كيت توصيلات أمين.
- يتم تنفيذ يقام في 25 درجة مئوية ، والعازلة 0.01 Hepes M عند pH 7.4 ، 0.15 M كلوريد الصوديوم ، 0.0034 M EDTA ، و 0.05 بوليسوربات 20 ٪.
- بين كل متغير من cystatin B ، يتم إعادة إنشاء سطح الاستشعار مع هيدروكسيد الصوديوم 20 ملي لمدة 30 ثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة.
6.Immobilization ليجند MMTS - غراء
التساهمية تعلق MMTS - غراء للتحليل CFCA
CFCA يعتمد على قياس معدل ملزم في ظل ظروف محدودة حيث معدل انتشار الجزيئات التي كتبها حليلة الى السطح (كتلة الحد من النقل). هو اختار هذا الشلل من مستويات عالية من يجند. تم تعيين تجميد MMTS - غراء صعودا وتشغيل باستخدام المعالج تجميد X100 Biacore برامج التحكم.
- تنشيط تدفق الخلايا السطحية في 2 عن طريق الحقن من خليط من succinimide (NHS) وcarbodiimide (EDC) لمدة 7 دقائق في معدل التدفق من 10 ميكرولتر / دقيقة. ترك معدلة خلية تدفق 1 من أجل أن تستخدم على سطح المرجعية.
- حقن MMTS - غراء في 50μg/ml العازلة في أسيتات الصوديوم عند أس هيدروجيني 4.5 لمدة 15 دقيقة بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة.
- يتم حقن إيثانولامين لمدة 7 دقائق في معدل التدفق من 10 ميكرولتر / دقيقة لتنشيط استرات النشطة المتبقية.
وينبغي إجراء اقتران بأكمله نتيجة في ~ 3000 RU - MMTS غراء ثبتوا في الخلية التدفق 2.
التساهمية تعلق MMTS - غراء للتحليل الحركي
يتم استخدام نفس الإجراء شل حركة MMTS - غراء للتحليل الحركي ، مع الفارق الوحيد هو أنه في التحليل الحركي ، ومستوى الشلل يجب أن يكون منخفضة من أجل تجنب معدل تصبح ملزمة محدودة الانتشار. ترك الخلية تدفق 1 معدلة في هذه الخطوة وكذلك من أجل أن تستخدم على سطح المرجعية.
- بعد تفعيل السطح مع خليط من NHS EDC وكما هو الحال في 7.1 ، يتم حقن MMTS - غراء في 1μg/ml لمدة 50 ثانية. بعد ذلك هو سطح دي تفعيلها مع حقنة من إيثانولامين كما في الخطوة 7.3.
وينبغي أن يكون على مستوى ما يقرب من 50 اقتران RU بعد هذا الإجراء.
7. تحديد تركيز B Cystatin باستخدام مقايسة CFCA
- تم تعيين التجربة CFCA تصل وفقا لالمعالج CFCA في X100 Biacore زائد حزمة. يتم حقن البروتين حوالي 10 نيوتن متر عند معدلات تدفق 10 و 100 ميكرولتر / دقيقة في مكررة لمدة 48 ثانية. يتم إعادة السطح مع هيدروكسيد الصوديوم 20 ملي بين كل دورة.
- وتشمل الحقن فارغة لكل معدل التدفق.
- ثم يتم تحديد تركيز البروتين من ربط البيانات (الشكل 3) استخدام اله ميزة التقييم CFCA من X100 Biacore زائد حزمة برامج التقييم.
الشكل 2. تم استخراج النتائج من تحليل CFCA باء cystatin البرية من نوع وتركيز البيانات الخاصة ملزمة من sensorgrams الحصول على معدلات تدفق 10 و 100 ميكرولتر / دقيقة.
يحدد الشكل 3. تركيزات من المسوخ باستخدام قياس 280 ألف (ن = 3) و CFCA (ن = 2). يتم الرمز الأخطاء القياسية بواسطة أشرطة الخطأ. وحسبت معاملات امتصاص المولي كما هو موضح في (6). ويمكن ملاحظة الفارق الكبير في قيم تركيز متحولة Cys3Ser/Leu73Gly يحددها طريقتين. - عند مقارنة تركيز يحددها قياس 280 ألف مع تلك التي CFCA ، فمن الواضح أنه ، في معظم الحالات ، في حين أن البروتين نشط بشكل كامل ، لCys3Ser/Leu73Gly متغير ، وجزء من البروتين النشط هو منخفضة جدا (الشكل 3). ويبين الجدول أدناه أنشطة B cystatin المتغيرات المتصلة تركيزات مجموع 280 ألف.
عينة CFCA بالنسبة إلى 280 (٪) نوع البرية 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. قياس حركية ب Cystatin ملزمة للغراء
- على أساس القياسات CFCA ، وإعداد سلسلة تركيز شقين تتراوح 2،5 حتي 40 نانومتر لكل من الخيارين باء cystatin.
- تم تعيين تجربة حركية حتى استخدام المعالج في حركية X100 Biacore مع اقتراب دورة واحدة. لم يتم إعادة إنشاء السطح بين الحقن ، ولكن بعد نهاية كل دورة التحليل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 20 ملم كما حل التجدد.
- إعداد التجربة بحيث يحيط كل دورة تحتوي على عينة من حلقة فارغة ، حيث يتم حقن المخزن بدلا من العينة.
- طرح استخدام ميزة تقييم حركية في X100 Biacore لتنفيذ تلقائيا الطرح فارغة من البيانات قبل تركيب إشارة نموذج التفاعل 1:1.
- وأظهرت البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها لربط المتغيرات B cystatin إلى غراء في الشكل 4. الجدول أدناه يلخص تكوين الجمعيات وثوابت معدل التفكك والثوابت التي تم الحصول عليها التفكك التوازن في التحليل الحركي.
عينة ك A (M -1 ق -1) ك د (ق -1) K D (M) نوع البرية 1.8 × 10 6 0.41 × 10 -3 2.3 × 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1.1 × 10 6 1.7 × 10 -3 1.5 × 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1.1 × 10 6 23 × 10 -3 2.2 × 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1.7 × 10 6 12 × 10 -3 7.1 × 10 -9 Cys3Ser 0.9 × 10 6 0.53 × 10 -3 5.8 × 10 -10 
الشكل 4. التشكيلات الحركية لتحديد المتغيرات cystatin B - MMTS ملزم باستخدام غراء حركية دورة واحدة. Sensorgrams تظهر فارغة والبيانات مع الإشارة طرح تناسب الحركية لنموذج التفاعل 01:01 مضافين في الأسود. - في حين أن معدلات تكوين الجمعيات من المسوخ التي هي مماثلة لنوع من البروتين البرية (الشكل 5 ، اللوحة العليا) ، يمكن للثوابت معدل تفارق من المسوخ تكون أعلى بنسبة قريبة لاثنين من حيث الحجم ، مع زيادة مماثلة في التفكك التوازن ثابت (الشكل رقم 5 ، اللوحة السفلى).
الشكل 5. واستندت حسابات ثوابت معدل وتقارب على تركيزات تم الحصول عليها من CFCA. وصفت التغييرات لك ، د ك K و D ، ويرتبط مع الطفرات في الرسوم البيانية. - منذ تركيز العينة معلمة في حساب معدل الجمعيات مستمر من البيانات التجريبية ، فإنهالمهم أنه هو الصحيح. وباستخدام تركيز على أساس قياس 280 ألف بدلا من CFCA يؤدي الى استنتاج مفاده ان من المهم بالنسبة Leu73 معدل تكوين الجمعيات ، حيث يبدو أن استبدال ينتج حوالي 10 مرات أبطأ من الجمعيات المتغيرات cystatin باء أخرى. ومع ذلك ، فإن تركيز محددة وملزمة تقاس CFCA ليست سوى حوالي 10 ٪ من البروتين الكلي في هذه الحالة. عندما يؤخذ هذا بعين الاعتبار هذا يصبح من الواضح أن معدل رابطة لLeu73 مماثلة لتلك التي من المتغيرات الأخرى. لذلك ، CFCA يسمح لتقييم الصحيح لك K و D مما يجعل من الممكن تفسير مناسب لآلية التفاعل.
Discussion
في هذا العمل ، وأنتج أربعة المسوخ البرية وباء cystatin نوع من أجل تقييم أهمية حلقة الربط الثاني وتنتهي C - محطة للتفاعل بين B cystatin وغراء. أظهرت هذه الدراسة الميزة وسهولة استخدام X100 Biacore لتحديد تركيز محددة ملزمة ، وتحليل حركية من البروتين البروتين التفاعلات من أجل فهم بنية وظيفة العلاقات. أثبتنا أن مجموع قياس تركيز البروتين لا تكشف المتغيرات البروتين التي خفضت النشاط ملزم ، وهو في هذه الحالة يقدم الخطأ قياس كبير في تحديد تقارب ملزمة وحركية. وتحددت تركيزات محددة وملزمة من المتغيرات B cystatin باستخدام CFCA مع X100 Biacore. أدى تركيز باستخدام القياسات التي CFCA كمدخل لتحليل الحركية في معدل موثوق بها والثوابت تقارب ، مما يسمح للالتفسير الصحيح لآلية التفاعل.
كانت الانتماءات انخفض من المسوخ على وجه الحصر تقريبا بسبب القيمة د ك زيادة ، في حين كان ك تتأثر إلا قليلا. هذا السلوك يشير إلى أن كلا من المنطقة الثانية حلقة الربط ونهاية C - المحطة ليست مهمة بالنسبة لمعدل ربط المانع للغراء. بدلا من ذلك ، أنها تسهم في تقارب ملزمة في المقام الأول عن طريق الحفاظ على مثبطات الانزيم تعلق على مرة واحدة وقد تم تشكيل المجمع.
Disclosures
يعمل مقدم البلاغ للرعاية الصحية GE التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Plastic Vials 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
References
- Christensen, L. L. H. Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation. Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).
- Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification. Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).
- Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).
- Pol, E., Björk, I. Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases. Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).
- Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219-225 (1994).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).
