Summary
אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.
Abstract
במחקר זה, אנו חוקרים את האינטראקציה בין B שור ציסטאין פרוטאז cystatin מעכב וטופס פעיל catalytically של papain (איור 1), ציסטאין פרוטאז המפעל, על ידי ניתוח בזמן אמת בחינם התווית באמצעות X100 Biacore. מספר B cystatin וריאנטים עם מוטציות נקודתיות בתחומים של אינטראקציה עם papain, מיוצרים. עבור כל חלופה B cystatin אנו קובעים ריכוז מחייב ספציפית שלה באמצעות כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) ולהשוות את הערכים המתקבלים עם ריכוז חלבון הכולל כפי שנקבע על ידי
Protocol
באיור 1. מבנה תלת ממדי של cystatin B קומפלקס (כחול) עם papain (צהוב). מוטציה ב שאריות cystatin מוצגים באדום.
1. עקרונות של ניתוח, לייבל חינם אינטראקציה באמצעות Biacore מערכות
בניסוי טיפוסי ללא תווית מחייב באמצעות מערכת Biacore, biomolecule שמכונה "ליגנד" מחוברת אל פני השטח של שבב החיישן. מערכת של תעלות זרימה מביא שותף מחייב שלה, שמכונה "אנליטי", במגע עם פני השטח שבב, שם מתרחש זיהוי. כאשר אנליטי נקשר ליגנד, לשנות את וכתוצאה מכך צבירת מסה על פני השטח הוא זוהה על ידי plasmon משטח תהודה (SPR). התגובה SPR הוא יחסי לכמות אנליטי מחייב.
מאז מחייב נמדדת בזמן אמת, העמותה הקינטית וקבועים דיסוציאציה שיעור עבור אינטראקציה מסוימת ניתן לקבוע. מתוך קבועים אלה, ניתן לחשב את הזיקה כמו ניתוק שיווי משקל קבוע. אפשר גם לחשב זיקה מנתונים מצב יציב מחייב. מתודולוגיה דומה יכול לשמש גם כדי לקבוע את הריכוז של חלבון זה נקשר ליגנד ספציפי על פני השטח.
2. ניתוח מאפייני הקינטית של אינטראקציה בין חלבונים
ב X100 Biacore, ניתוח הקינטית יכול להתבצע באמצעות אחת מחזור קינטיקה. בניסוי קינטיקה מחזור יחיד, סדרת ריכוז אנליטי מוזרק במחזור ניתוח יחיד ללא התחדשות של פני השטח בין זריקות. לפיכך, יחיד מחזור קינטיקה מאפשר ניתוח הקינטית כאשר קשה למצוא תנאים מתאימים התחדשות.
לאחר נתונים עבור ניסוי הקינטית כבר נאסף, הערכה Biacore תוכנה X100 יוצרת את הערכים של k, k d, D ו-K על ידי התאמת הנתונים למודל אינטראקציה.
3. גישות קביעת ריכוז חלבון
ניתוח אינטראקציות בין ביומולקולות חשוב להבנת תפקידם. אפיון מחייב של חלבונים לחלבונים אחרים, חומצות גרעין, או מולקולות קטנות חיונית מחקר ביוכימי, ומוצא להשתמש בתחומים רבים אחרים, כולל גילוי תרופות.
עבור מדידה מדויקת של קינטיקה אינטראקציה בין שני חלבונים אינטראקציה זה חיוני לדעת את הריכוז של חלבון מחייב במיוחד במדגם ניסיוני המשמש אנליטי. קריאה של ספקטרופוטומטר 280 או מבחני colorimetric כמו זו של העסקת מגיב ברדפורד משמש בדרך כלל כדי לקבוע ריכוז החלבון הכולל. עם זאת, זיהומים חלבון יכול להשפיע על התוצאה. וחשוב יותר, הן צורות פעיל פעיל של החלבון כלולים בריכוז החלבון הכולל. במיוחד במקרה של חלבונים רקומביננטי, אשר עשוי להיות פעיל עקב קיפול לא נכון, חשוב לקבוע את אחוז חלבון מחייב במיוחד במדגם.
ב X100 Biacore, ריכוז הקשורים לפעילות מחייב ספציפית יכול להיות נקבע על ידי השוואה של רמות בתגובה מחייב עקומת כיול נגזר תקן ידוע, או באמצעות כיול ללא מתודולוגיה הציג לאחרונה ניתוח ריכוז (CFCA). CFCA אינו מסתמך על סטנדרט. לכן, CFCA שימושי במיוחד במקרה של מוטציה לומדים צורות של חלבונים, שבו הסטנדרטים הם בדרך כלל אינו זמין.
בניסוי CFCA, שיעור מחייב הראשונית נמדד ברמות ספיקה שונה בתנאים כאשר דיפוזיה של המדגם על פני השבב הוא שער הגבלת. מקדם דיפוזיה של אנליטי, מידות התא זרימה ספיקה נלקחים בחשבון בעת חישוב ריכוז מחייב ספציפיות 1,2 שיעור הראשונית מחייב.
בניסוי קינטיקה, ריכוז אנליטי משמש בחישוב שיעור העמותה הקינטית קבוע את הזיקה בין נתונים ניסיוניים. CFCA ומדידה הקינטית במערכות Biacore שניהם מסתמכים על מאפייני האינטראקציה אותה. לכן, באמצעות ריכוז מחייב ספציפיות שנקבעו על ידי ניתוח Biacore, במקום ריכוז החלבון הכולל, מגבירה את האמינות של התוצאות.
4. באמצעות ניתוח Biacore לאפיין את האינטראקציה בין Cystatin B ו Papain
B cystatin היונקים הוא מעכב הפיך, חלבון תחרותי חזק מחייב של papain כמו proteinases ציסטאין, בעיקר cathepsin B, H, K, L ו ס חלבונים אלה מעורבים בעיקר nonsבחירה חלבון תאיים השפלה. Cystatins הם המשוער כדי להגן על התאים והרקמות מפני proteolysis הולם על ידי אנזימים אלה. הם גם להשבית proteinases ציסטאין מן טפילים ווירוסים יכולים להשתתף בהגנה מפני פלישה של גורמים מדבקים כאלה. בנוסף, cystatins לעכב כמה ציסטאין צמח proteinases, כגון papain, המשמש לעתים קרובות כמו אנזים מודל במבנה תפקודי מחקרים. מבנה תלת ממדי של המתחם ב cystatin עם papain 3 מראה כי אינטראקציה בין שני חלבונים הוא נשלט על ידי אנשי קשר הידרופובי, אשר, מן הצד מעכב, ניתנים על ידי N-ו-C-הטרמינל מסתיים שתי לולאות מכבנה ( איור 1). במחקר זה, אנו בוחנים את החשיבות של סוף בטרמינל C-ו מחייב את הלולאה השנייה של B cystatin עבור מחייב papain באמצעות cystatin שור B וריאנטים המכילים מוטציות נקודתיות בתחומים של אינטראקציה עם papain. אנו לקבוע תחילה את הריכוז מחייב ספציפית של ארבעת B וריאנטים cystatin בשימוש, כמו גם זה של החלבון סוג בר. לאחר ריכוז מסוים של מחייבת B cystatin פעיל נחושים, שיעור הזיקה קבועים של סוג בר וריאנטים מוטנטיים של B cystatin מחייב papain נמדדים באמצעות X100 Biacore.
5. מכשיר ריאגנטים
- ב וריאנטים cystatin Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala ו Cys3Ser מיוצרים כפי שתואר קודם לכן 4. מוטנטים כל מכילים החלפה נוספת של ציסטאין על סרין בעמדה 3, כדי למנוע היווצרות של דיסולפיד צמודות הדימרים פעיל של cystatin B.
- היעד papain מוכן גם כפי שתואר לעיל 5. זה S-(methylthio) papain (MMTS-papain) שיש קבוצה methylthio המצורפת Cys25 בתוך הבקע פעיל, עיבוד פרוטאז פעיל catalytically.
- X100 Biacore עם X100 Biacore פלוס חבילה משמש כדי למדוד ולנתח את ריכוזי מחייב ספציפית קינטיקה מחייב.
- MMTS-papain היא משותקת על CM5 שבב חיישן באמצעות Biacore ערכת אמין זיווגים.
- פועל מבוצעות במהירות של 25 ° C, ו - חיץ היא 0.01 Hepes M ב-pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.0034 M EDTA, ו 0.05 polysorbate 20%.
- בין כל גרסה של cystatin B, משטח החיישן מחדש עם 20 mM NaOH למשך 30 שניות בקצב הזרימה של μl 10 / min.
6.Immobilization של ליגנד MMTS-papain
מצורף קוולנטיים של MMTS-papain עבור ניתוח CFCA
CFCA מסתמך על מדידת קצב מחייב בתנאים שבהם שיעור מוגבל על ידי דיפוזיה של מולקולות אנליטי על פני השטח (תחבורה המונית הגבלה). זה הוא המועדף על ידי רמות גבוהות של immobilization ליגנד. Immobilization של MMTS-papain היה להגדיר ולהפעיל באמצעות אשף immobilization של תוכנות שליטה Biacore X100.
- הפעל את פני השטח של התא זרימה 2 בזריקה תערובת של succinimide (NHS) ו carbodiimide (EDC) עבור 7 דקות בקצב הזרימה של μl 10 / min. התא זרימה 1 נותר ללא שינוי על מנת לשמש משטח התייחסות.
- הזרק MMTS-papain ב 50μg/ml במאגר נתרן אצטט ב-pH 4.5 במשך 15 דקות בקצב הזרימה של μl 5 / min.
- Ethanolamine מוזרק במשך 7 דקות בקצב הזרימה של μl 10 / min לבטל אסטרים פעיל הנותרים.
ההליך צימוד שלם צריך לגרום ~ 3000 RU-MMTS papain משותקת בתא זרימה 2.
מצורף קוולנטיים של MMTS-papain לניתוח הקינטית
ההליך אותו משמש משתק MMTS-papain לניתוח קינטי, עם ההבדל היחיד הוא בכך בניתוח קינטי, רמת immobilization צריך להיות נמוך כדי למנוע את קצב מחייב להיות מוגבל על ידי דיפוזיה. התא זרימה 1 נותר ללא שינוי בשלב זה, כמו גם על מנת לשמש משטח התייחסות.
- לאחר הפעלה של פני השטח עם תערובת של NHS ו EDC כמו 7.1, MMTS-papain מוזרק על 1μg/ml עבור 50 שניות. אחרי זה על פני השטח הוא דה מופעל עם הזרקה של ethanolamine כמו בשלב 7.3.
רמת הצימוד צריכה להיות כ 50 RU לאחר הליך זה.
7. קביעת B Cystatin ריכוז באמצעות assay CFCA
- הניסוי CFCA מוגדר על פי האשף CFCA ב X100 Biacore פלוס חבילה. כ 10 חלבון nM מוזרק ברמות ספיקה 10 ל 100 μl / min בשני עותקים עבור 48 שניות. פני השטח מחדש עם 20 mM NaOH בין כל מחזור.
- כלול זריקות ריק עבור כל קצב הזרימה.
- ריכוז החלבון נקבע אז מהנתונים מחייב (איור 3) באמצעות הדואר CFCA תכונה הערכה של X100 Biacore פלוס הערכה חבילת תוכנה.
איור 2. תוצאות מניתוח CFCA של ב wild-type cystatin נתונים ספציפיים ריכוז מחייב היה שחולצו מן sensorgrams להשיג ברמות ספיקה של 10 ו - 100 μl / min.
איור 3. ריכוזים של מוטנטים נקבע באמצעות מדידת 280 (n = 3) ו - CFCA (n = 2). שגיאות תקן מסומנים על ידי מוטות שגיאה. מקדמי הספיגה טוחנת חושבו כמתואר (6). הבדל גדול בערכים ריכוז Cys3Ser/Leu73Gly מוטציה נקבע על ידי שתי השיטות ניתן לצפות. - כאשר משווים את ריכוז נקבע על ידי מדידה 280 עם זה על ידי CFCA, ברור, כי בעוד ברוב המקרים חלבון פעיל לחלוטין, עבור הגרסה Cys3Ser/Leu73Gly, את החלק היחסי של חלבון פעיל היא נמוכה מאוד (איור 3). הטבלה שלהלן מציגה את פעילות B וריאנטים cystatin הקשורים הריכוזים סך של 280.
מדגם CFCA ביחס 280 (%) Wild סוג 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. מדידת קינטיקה של B Cystatin מחייב Papain
- בהתבסס על המדידות CFCA, להכין סדרה כפולה ריכוז החל 2.5 ל nM 40 עבור כל אחד גרסאות B cystatin.
- הניסוי קינטיקה מוגדר באמצעות אשף קינטיקה ב X100 Biacore עם הגישה מחזור אחד. פני השטח לא נוצר מחדש בין זריקות, אבל לאחר תום כל מחזור ניתוח באמצעות 20 mM NaOH כפתרון התחדשות.
- הגדרת הניסוי, כך שכל מעגל המכיל מדגם מוקף מחזור ריקה, שם חיץ מוזרק במקום מדגם.
- השתמש בתכונת הערכה קינטיקה ב X100 Biacore באופן אוטומטי לבצע גריעות ריק התייחסות מחוסר נתונים לפני הולם מודל האינטראקציה 01:01.
- נתוני הניסוי שהתקבלו המחייב של וריאנטים B cystatin כדי papain מוצג באיור 4. הטבלה שלהלן מסכמת את הקשר וקבועים דיסוציאציה קצב לבין דיסוציאציה קבועי שיווי המשקל שהושג בניתוח קינטי.
מדגם k (M -1 s -1) k d (s -1) K D (M) Wild סוג 1.8 x 10 6 0.41 x 10 -3 2.3 x 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1.1 x 10 6 1.7 x 10 -3 1.5 x 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1.1 x 10 6 23 x 10 -3 2.2 x 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1.7 x 10 6 12 x 10 -3 7.1 x 10 -9 Cys3Ser 0.9 x 10 6 0.53 x 10 -3 5.8 x 10 -10 
איור 4. פרופילים קינטי עבור B וריאנטים cystatin מחייב MMTS-papain נקבע באמצעות קינטיקה מחזור אחד. Sensorgrams להראות ריק, התייחסות לחסר עם נתונים מתאימים עבור מודל קינטי 01:01 האינטראקציה מעולף בשחור. - בעוד שיעורי ההתאגדות של מוטנטים הם דומה לזו של חלבון מסוג בר (איור 5, הפאנל העליון), את קבועי קצב דיסוציאציה של מוטנטים יכול להיות גבוה יותר על ידי קרוב בשני סדרי גודל, עם גידול מקביל את שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע (איור 5, הפאנל התחתון).
איור 5. החישובים של קבועי קצב זיקה התבססו על ריכוזים המתקבל CFCA. השינויים של k, k ד D ו-K, הקשורים המוטציות מתוארים הגרפים. - מאז ריכוז המדגם הוא פרמטר בחישוב של שיעור קבוע של העמותה נתונים ניסיוניים, הואחשוב כי היא נכונה. באמצעות ריכוז המבוססת על מדידת 280 במקום CFCA יוביל למסקנה Leu73 חשוב שיעור העמותה, שבו החלפת נראה תוצאה בשיתוף בערך 10 פעמים איטי יותר מאשר ב וריאנטים אחרים cystatin. עם זאת, מחייב ריכוז מסוים נמדדת CFCA רק כ -10% חלבון מסך במקרה זה. כאשר נלקחת בחשבון זה מתברר כי שיעור העמותה Leu73 דומה לזה של גרסאות אחרות. לכן, CFCA מאפשרת הערכה נכונה של k ו-K D ובכך פרשנות אפשרית המתאימה של מנגנון האינטראקציה.
Discussion
בעבודה זו, ארבעה מוטנטים ו-B בר cystatin סוג הופקו על מנת להעריך את החשיבות של לולאת קשירה השני בטרמינל C-מסתיים עבור האינטראקציה בין cystatin B ו papain. מחקר זה הוכיח את היתרון וקלות שימוש X100 Biacore כדי לקבוע ריכוז מחייב ספציפית לנתח את קינטיקה של חלבונים אינטראקציות על מנת להבין מבנה, תפקוד מערכות יחסים. הראינו כי מדידת ריכוז החלבון הכוללת לא לחשוף את גרסאות חלבון צמצמו פעילות מחייב, אשר במקרה זה מציג שגיאה מדידה משמעותי בקביעת הזיקה ואת קינטיקה מחייב. ריכוזי המחייב הספציפי של וריאנטים B cystatin נקבעו באמצעות CFCA עם X100 Biacore. בעזרת מדידות ריכוז ידי CFCA כקלט ניתוח הקינטית הביא קצב אמין וקבועים זיקה, ובכך מאפשר את הפירוש הנכון של מנגנון האינטראקציה.
זיקות ירידה של מוטנטים היו כמעט אך ורק עקב ערך מוגבר k-d, ואילו k הושפע רק במעט. התנהגות זו מעידה כי גם האזור הנוסף לולאה מחייב סוף בטרמינל C-אינם חשובים עבור שיעור המחייב של מעכב papain. במקום זאת, הם תורמים זיקה מחייבת בראש ובראשונה על ידי שמירה על מעכבי האנזים המצורף פעם אחת מורכבת כבר נוצרו.
Disclosures
הכותב הוא מועסק על ידי GE Healthcare המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Plastic Vials 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
References
- Christensen, L. L. H. Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation. Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).
- Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification. Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).
- Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).
- Pol, E., Björk, I. Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases. Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).
- Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219-225 (1994).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).
