Summary
Vi tillämpar etikett-fri analys av proteininteraktioner använda Biacore X100 för struktur och funktion analys av bindning av flera mutanter cystatin B till papain genom kinetiska karakterisering. Kalibrering-fria koncentrationen analys (CFCA) mäter koncentrationen av protein med bibehållen bindande aktivitet utan behov av en standardkurva. Vi visar att en bekräftelse av koncentrationer med CFCA ökar tillförlitligheten i den kinetiska analysen och att kinetiska konstanter tillförlitligt kan bestämmas, även om aktiviteten av ett rekombinant protein minskar.
Abstract
I denna studie utforskar vi samspelet mellan nötkreatur cystein proteashämmare cystatin B och en katalytiskt inaktiv form av papain (Fig. 1), en växt cystein proteas, genom realtid etikett-fri analys med Biacore X100. Flera cystatin B varianter med punktmutationer inom områden av interaktion med papain, produceras. För varje cystatin B variant vi bestämma dess specifika bindande koncentration med hjälp av kalibrerings-fria koncentrationen analys (fiske) och jämföra de värden som erhålls med total proteinkoncentration som bestämts med en
Protocol
Figur 1. Den tredimensionella strukturen av cystatin B-komplex (blå) med papain (gul). Muterade cystatin B rester visas i rött.
1. Principer för Label-fri Interaktion Analys med hjälp av Biacores system
I en typisk etikett utan bindande experiment med en Biacores system, kallas en biomolekyl den "liganden" är fäst på ytan av en sensor chip. Ett system för flödes-kanaler ger sitt bindande partner, kallat "analyten", i kontakt med chip yta, där detektion sker. När analyt binder till ligand, är den resulterande förändringen i ackumulera massa på ytan upptäckts av ytplasmonresonans (SPR). SPR svar är proportionell mot mängden av bindande analyt.
Eftersom bindningen mäts i realtid, kan den kinetiska föreningen och dissociation hastighetskonstanterna för en specifik interaktion bestämmas. Från dessa konstanter, är det möjligt att beräkna den samhörighet som jämvikt dissociationskonstanten. Det är också möjligt att beräkna affinitet från steady state bindande data. En liknande metod kan också användas för att bestämma koncentrationen av ett protein som specifikt binder till en ligand på ytan.
2. Analysera kinetiska egenskaper hos ett protein-protein interaktion
I Biacore X100 kan kinetisk analys bör göras med hjälp av en enda cykel kinetik. I en singel-cykel kinetik experiment, är en koncentration serie av analyten injiceras i en enda analys cykel utan regenerering av ytan mellan injektionerna. Därför gör Singel-cykel kinetik kinetisk analys när det är svårt att hitta lämpliga förnyelse förhållanden.
När data för en kinetisk experiment har samlats in, genererar Biacore X100 utvärderingsprogramvaran värden av k A, K D och K D genom att montera data till en modell för samverkan.
3. Metoder för att bestämma proteinkoncentration
Analysera samspelet mellan biomolekyler är viktig för att förstå deras funktion. Karakteriserar bindning av proteiner till andra proteiner, till nukleinsyra eller små molekyler är grundläggande för biokemisk forskning, och finner användning inom många andra områden, bland annat läkemedelsutveckling.
För exakt mätning av samspelet kinetik mellan två samverkande proteiner är det viktigt att veta koncentrationen av att binda specifikt protein i den experimentella prov som används som analyt. En spektrofotometer läsning av A 280 eller kolorimetriska analyser som den anställer Bradford reagens används ofta för att bestämma total proteinkoncentration. Däremot kan protein föroreningar påverkar resultatet. Ännu viktigare är både aktiva och inaktiva former av proteinet som ingår i den totala proteinkoncentration. Särskilt när det gäller av rekombinanta proteiner, som kan vara inaktiv på grund av felaktig vikning är det viktigt att bestämma den andel av specifikt protein i provet.
I Biacore X100 kan koncentrationen relaterad till specifika bindande aktivitet antingen fastställas genom jämförelse av bindande svar nivåer för att en kalibreringskurva som kommer från en känd standard, eller genom att använda den mer nyligen introducerade metoden Kalibreringsfri Koncentration analys (fiske). Fiske är inte beroende av att en standard. Därför är CFCA särskilt användbart när det gäller att studera muterade former av proteiner, där standarden är vanligtvis inte tillgängliga.
I ett kontrollorgan för fiske experiment, är det första bindande hastighet mäts vid olika flöden under förhållanden då spridning av provet med en chip ytan är hastighetsbestämmande. Den diffusionskoefficient av analyten, är måtten på flödet cellen och flöden beaktas vid beräkningen av den specifika bindningen koncentration från den första bindande kurs 1,2.
I ett kinetik experiment är koncentrationen för analyten som används vid beräkningen av den kinetiska föreningen konstanten och affiniteten från den experimentella data. Fiske och kinetiska mätning i Biacores system både beroende av samma interaktion egenskaper. Därför, med hjälp av den specifika bindningen koncentrationen bestäms av Biacore analys, snarare än total proteinkoncentration, ökar tillförlitligheten av resultaten.
4. Använda Biacore analys för att karakterisera samspelet mellan Cystatin B och Papain
Däggdjur cystatin B är en reversibel, konkurrenskraftig och tight-binding protein hämmare av papain-liknande cystein proteinaser, främst cathepsin B, H, K, L och S. Dessa proteiner är främst involverade i NONSelektiva intracellulärt protein nedbrytning. Cystatins antas för att skydda celler och vävnader från olämpligt proteolys av dessa enzymer. De inaktivera också cystein proteinaser från parasiter och virus och kan delta i försvaret mot invasion av sådana smittämnen. Dessutom cystatins hämma flera proteinaser växt cystein, som papain, som ofta används som modell enzym i struktur och funktion studier. Den tredimensionella strukturen av cystatin B-komplex med papain 3 visar att samspelet mellan de två proteinerna domineras av hydrofoba kontakter, som från hämmare sidan tillhandahålls av N-och C-terminal ändarna och två slingor hårnål ( Figur 1). I denna studie undersöker vi betydelsen av den C-terminala änden och den andra bindande slinga av cystatin B för att binda till papain med nötkreatur cystatin B varianterna innehåller punktmutationer i områden av interaktion med papain. Vi bestämmer först specifik bindning koncentrationen av fyra cystatin används B-varianter, såväl som för den vilda typen protein. När den specifika bindningen koncentrationer av aktiva cystatin B bestäms, är räntan och affinitet konstanter vildtyp och muterade varianter av cystatin B bindning till papain mäts med hjälp av Biacores X100.
5. Instrument och reagenser
- Den cystatin B-varianterna Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly är Cys3Ser/Tyr97Ala och Cys3Ser produceras som tidigare beskrivits 4. Alla mutanter innehåller ytterligare ett utbyte av cystein till serin i position 3, för att förhindra bildandet av disulfide kopplade inaktiva dimers av cystatin B.
- Det papain Målet är också beredd som tidigare beskrivits 5. Det är S-(metyltio) papain (MMTS-papain) med en metyltio grupp fäst Cys25 i den aktiva kluven, vilket gör att proteas katalytiskt inaktiv.
- Biacore X100 med Biacore X100 Plus paketet används för att mäta och analysera specifika bindningen koncentrationer och bindande kinetik.
- MMTS-papain är immobiliserade på Sensorchipet CM5 använda Biacore Amine Koppling Kit.
- Den körs utförs vid 25 ° C, och bufferten är 0,01 M Hepes vid pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA, och 0,05% polysorbat 20.
- Mellan varje variant av cystatin B, givaren ytan regenereras med 20 mM NaOH i 30 sekunder vid ett flöde på 10 l / min.
6.Immobilization av Ligand MMTS-papain
Kovalent bindning av MMTS-papain för fiske analys
CFCA bygger på mätning av bindande takt under förhållanden där andelen är begränsad av diffusion av analyt molekyler till ytan (masstransport begränsning). Detta gynnas av immobilisering nivåer av liganden. Fixering av MMTS-papain bildades och drivs enligt immobilisering Trollkarlen från Biacore X100 Control.
- Aktivera ytan i flödescellen 2 genom injektion av en blandning av succinimide (NHS) och carbodiimide (EDC) för 7 minuter med en flödeshastighet av 10 l / min. Flödescell 1 lämnas oförändrad för att kunna användas som en referens yta.
- Injicera MMTS-papain på 50μg/ml i natriumacetat buffert vid pH 4,5 i 15 minuter vid ett flöde på 5 l / min.
- Etanolamin injiceras under 7 minuter med en flödeshastighet av 10 l / min för att avaktivera återstående aktiva estrar.
Hela kopplingen förfarande bör leda till ~ 3000 RU MMTS-papain immobiliseras i flödescellen 2.
Kovalent bindning av MMTS-papain för kinetisk analys
Samma procedur används för att immobilisera MMTS-papain för kinetisk analys, med den enda skillnaden är att i kinetisk analys behöver immobilisering nivån vara låg för att undvika den bindande räntan blir begränsad av diffusion. Flödescell 1 finns kvar oförändrat i det här steget och för att kunna användas som en referens yta.
- Efter aktivering av ytan med en blandning av NHS och EDC som i 7,1, är MMTS-papain injiceras på 1μg/ml i 50 sekunder. Efter att ytan är de-aktiveras med en injektion av etanolamin som i steg 7,3.
Kopplingen nivå bör vara ca 50 RU efter denna procedur.
7. Fastställande Cystatin B koncentration med fiske analys
- Kontrollorganet experimentet är inrättat i enlighet med fiske guiden i Biacore X100 Plus Package. Cirka 10 nm protein injiceras vid flöden 10 och 100 l / min i två exemplar i 48 sekunder. Ytan är regenereras med 20 mM NaOH mellan varje cykel.
- Inkludera tom injektioner för varje flöde.
- Proteinkoncentrationen bestäms sedan från bindande data (Figur 3) med hjälp av ee CFCA utvärdering inslag i Biacore X100 Plus paketet utvärdering programvara.
Figur 2. Resultat från fiske analys av vildtyp cystatin B. Specifika bindande koncentrationen data ur sensorgrams erhålls vid flödeshastigheter på 10 och 100 l / min.
Figur 3. Koncentrationer av mutanter bestäms med en 280 mätningar (n = 3) och CFCA (n = 2). Standarden fel betecknas felstaplar. Det molar absorptionskoefficienterna beräknades enligt (6). En stor skillnad i koncentrationen värden Cys3Ser/Leu73Gly mutant bestäms av de två metoderna kan observeras. - När man jämför koncentrationen bestäms av en 280 mätning med att genom att kontrollorganet är det tydligt att även i de flesta fall proteinet är fullt aktiv, för Cys3Ser/Leu73Gly varianten, är den fraktion av aktiv protein mycket låg (Figur 3). Tabellen nedan visar verksamheten varianter cystatin B relaterad till den totala koncentrationen av A 280.
Exempel på CFCA i förhållande till A 280 (%) Vildtyp 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. Att mäta kinetiken av Cystatin B bindning till Papain
- Baserat på fiske mätningar, förbereda en dubbel koncentration serien från 2,5 till 40 Nm för varje varianter cystatin B.
- Kinetiken experiment konfigureras med kinetik guiden i Biacore X100 med den enda cykel strategi. Ytan är inte regenereras mellan injektionerna, men efter slutet av varje analys cykel med 20 mM NaOH som förnyelse lösning.
- Ställ upp experimentet så att varje cykel innehåller prov flankeras av en tom cykel, där bufferten sprutas istället för prov.
- Använd kinetik utvärdering funktionen i Biacore X100 för att automatiskt utföra tomt subtraktioner hänvisning subtraheras data innan montering av en 1:01-modell för samverkan.
- Den experimentella data inhämtas för bindning av varianter cystatin B till papain visas i Figur 4. I tabellen nedan sammanfattas föreningen och dissociation hastighetskonstanterna och jämviktskonstanter dissociation erhållits i den kinetiska analysen.
Exempel på k en (M -1 s -1) K d (n -1) K D (M) Vildtyp 1,8 x 10 6 0,41 x 10 -3 2,3 x 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1,1 x 10 6 1,7 x 10 -3 1,5 x 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1,1 x 10 6 23 x 10 -3 2,2 x 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1,7 x 10 6 12 x 10 -3 7,1 x 10 -9 Cys3Ser 0,9 x 10 6 0,53 x 10 -3 5,8 x 10 -10 
Figur 4. Kinetic profiler för varianter cystatin B bindning till MMTS-papain bestämmas med hjälp av cykel kinetik. Sensorgrams visa tomt-och referens dras data med kinetiska passar för 1:1-modell för samverkan överlagrade i svart. - Medan föreningen satser av mutanter är jämförbar med den vilda typen protein (Figur 5, övre panelen) kan dissociation hastighetskonstanter av mutanter vara högre med närmare två storleksordningar, med en motsvarande ökning i jämviktsläget dissociation konstant (Figur 5, nedre panelen).
Figur 5. Beräkningarna av ränta och samhörighet konstanterna var baserade på koncentrationer från fiske. De förändringar av k A, K D och K D, i samband med mutationer skildras i grafer. - Eftersom prov koncentrationen är en parameter i beräkningen av föreningens hastighetskonstanten från den experimentella data, är detviktigt att det är korrekt. Använda koncentrationen baserat på en 280 mätningen istället för fiske skulle leda till slutsatsen att Leu73 är viktigt för föreningen ränta, där utbyte verkar resultera i cirka 10 gånger långsammare förening än de andra varianterna cystatin B. Dock är den specifika bindningen koncentration mäts genom CFCA endast cirka 10% av det totala proteinet i detta fall. När detta tas hänsyn till detta blir det tydligt att föreningen skattesats för Leu73 är liknande till det av de andra varianterna. Därför tillåter fiske för korrekt bedömning av k en och K D vilket gör det möjligt att lämplig tolkning av interaktionen mekanism.
Discussion
I detta arbete har fyra mutanter och vildtyp cystatin B fram för att bedöma betydelsen av andra bindande slinga och C-terminala ändar för samspelet mellan cystatin B och papain. Denna studie visade fördelen och enkel att använda Biacore X100 att bestämma specifik bindning koncentration och att analysera kinetik av protein-protein interaktioner i för att förstå struktur-funktionssamband. Vi visade att mäta total proteinkoncentration inte avslöjar det protein varianter som har nedsatt bindande aktivitet, vilket i detta fall introducerar ett betydande mätfel vid bestämning av affinitet och kinetik. Den specifika bindningen koncentrationer av de varianter cystatin B har fastställts med hjälp av fiske med Biacore X100. Använda koncentration mätningar av CFCA som input till den kinetiska Analysen resulterade i pålitliga takt och konstanter samhörighet, vilket gör att rätt tolkning av interaktionen mekanism.
Den minskade tillhörighet av mutanterna var nästan uteslutande beror på en ökad K D-värde, medan k ett påverkades endast marginellt. Detta beteende tyder på att både andra bindande slingan regionen och den C-terminala änden inte är viktiga för bindningen graden av hämmare till papain. Istället bidrar de till affinitet främst genom att hålla hämmaren bifogas enzymet när komplexet har bildats.
Disclosures
Författaren är anställd av GE Healthcare som tillverkar reagens och instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Plastic Vials 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
References
- Christensen, L. L. H. Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation. Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).
- Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification. Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).
- Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).
- Pol, E., Björk, I. Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases. Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).
- Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219-225 (1994).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).
