Summary
Wir wenden label-free-Protein-Interaktion Analyse mittels Biacore X100 für Struktur-Funktions-Analyse der Bindung von mehreren Cystatin B-Mutanten durch kinetische Charakterisierung Papain. Calibration-free-Konzentration Analyse (EUFA) misst die Konzentration des Proteins mit behielt bindende Aktivität, ohne die Notwendigkeit für eine Standard-Kurve. Wir zeigen, dass die Bestätigung der Konzentrationen mit EUFA erhöht die Zuverlässigkeit der kinetischen Analyse und die kinetischen Konstanten zuverlässig bestimmt, auch wenn die Aktivität eines rekombinanten Proteins reduziert wird.
Abstract
In dieser Studie untersuchen wir die Wechselwirkung zwischen den Rindern Cystein Protease-Inhibitor Cystatin B und ein katalytisch inaktiver Form von Papain (Abb. 1), eine Pflanze Cysteinprotease, durch Echtzeit-label-free-Analyse mit Biacore X100. Mehrere Cystatin B-Varianten mit Punktmutationen in Bereichen der Interaktion mit Papain, hergestellt werden. Für jede Cystatin B-Variante ermitteln wir ihre spezifische Bindung Konzentration mit Kalibrier-freie Konzentration Analyse (EUFA) und vergleichen die Werte mit Gesamt-Protein-Konzentration erhalten, wie durch A bestimmt
Protocol
Abbildung 1. Die dreidimensionale Struktur des Cystatin-B-Komplex (blau) mit Papain (gelb). Mutierte Cystatin B Rückstände werden in rot dargestellt.
1. Principles of Label-free Interaction Analysis mit Biacore Systeme
In einem typischen label-freien Bindungsstellen Experiment mit einem Biacore System mit der Bezeichnung ein Biomolekül die "Liganden" an die Oberfläche eines Sensorchips verbunden ist. Ein System von Flow-Kanäle bringt seinen Bindungspartner, so genannten "Analyt", in Kontakt mit der Chip-Oberfläche, wo Detektion erfolgt. Wenn der Analyt an den Liganden bindet, ist die daraus resultierende Veränderung in akkumulieren Masse an der Oberfläche von Surface Plasmon Resonance (SPR) nachgewiesen. Die SPR Reaktion ist proportional zur Menge der bindenden Analyten.
Da die Bindung in Echtzeit gemessen wird, kann die kinetische Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für eine spezifische Wechselwirkung bestimmt werden. Von dieser Konstanten ist es möglich, die Affinität als die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante zu berechnen. Es ist auch möglich, Affinität von steady state verbindliche Daten zu berechnen. Eine ähnliche Methode kann auch verwendet werden, um die Konzentration eines Proteins, das spezifisch an einen Liganden auf der Oberfläche zu bestimmen.
2. Analysieren kinetischen Eigenschaften eines Protein-Protein-Interaktion
In Biacore X100 kann kinetische Analyse unter Verwendung von Single-Cycle-Kinetik werden. In einem Single-Cycle-Kinetik-Experiment wird eine Konzentrationsreihe des Analyten in einer einzigen Analyse-Zyklus ohne Regeneration der Oberfläche in zwischen den Injektionen injiziert. Daher ermöglicht Single-Cycle-Kinetik kinetische Analyse, wenn es schwierig ist, geeignete Regeneration Bedingungen zu finden.
Sobald die Daten für eine kinetische Experiment gesammelt worden ist, erzeugt Biacore X100 Auswertesoftware die Werte von k a, k d und K D durch Anpassung der Daten an ein Interaktionsmodell.
3. Ansätze zur Bestimmung von Protein-Konzentration
Die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen ist für das Verständnis ihrer Funktion wichtig. Charakterisierung der Bindung von Proteinen an andere Proteine, Nukleinsäure-oder kleinen Molekülen ist von grundlegender Bedeutung für die biochemische Forschung, und findet Verwendung in vielen anderen Bereichen, einschließlich der Wirkstoffforschung.
Für eine genaue Messung der Wechselwirkung Kinetik zwischen zwei interagierenden Proteinen ist es wichtig, die Konzentration der spezifisch bindenden Proteins in der experimentellen Probe, die als Analyt verwendet wird wissen. Ein Spektralphotometer Lesen der A 280 oder kolorimetrischen Assays wie der Einsatz von Bradford-Reagenz wird häufig verwendet, um Gesamt-Protein-Konzentration bestimmen. Allerdings kann Proteinverunreinigungen das Ergebnis beeinflussen. Noch wichtiger ist, sind sowohl aktive als auch inaktive Formen des Proteins in der Gesamt-Protein-Konzentration enthalten. Besonders im Fall von rekombinanten Proteinen, die inaktiv sein können durch falsche Faltung, ist es wichtig, den Anteil der spezifisch bindenden Proteins in der Probe zu bestimmen.
In Biacore X100, kann die Konzentration in Bezug auf spezifische Bindungsaktivität entweder durch Vergleich der verbindliche Antwort Ebenen auf eine Eichkurve von einem bekannten Standard, oder indem Sie die in jüngerer Zeit eingeführt Methodik Calibration-Free Konzentration Analysis (EUFA) abgeleitet bestimmt werden. EUFA nicht auf einen Standard zu setzen. Daher ist EUFA besonders nützlich im Falle eines Studiums mutierte Formen von Proteinen, in denen Normen sind in der Regel nicht zur Verfügung.
In einem EUFA Experiment wird die anfängliche Bindung Rate bei verschiedenen Flussraten unter Bedingungen gemessen, wenn Diffusion der Probe auf der Chip-Oberfläche geschwindigkeitsbestimmend ist. Der Diffusionskoeffizient des Analyten sind die Abmessungen der Messzelle und die Strömungsgeschwindigkeiten berücksichtigt bei der Berechnung der spezifischen Bindung Konzentration von der anfänglichen Bindung Rate 1,2.
In einer Kinetik-Experiment wird die Konzentration des Analyten in die Berechnung der kinetischen Verein konstant gehalten und die Affinität aus den experimentellen Daten verwendet. EUFA und kinetische Messungen in Biacore-Systemen sowohl auf die gleiche Wechselwirkung Eigenschaften zurückgreifen. Daher ist die Verwendung der spezifischen Bindung Konzentration von Biacore-Analyse bestimmt, anstatt Gesamt-Protein-Konzentration, erhöht die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
4. Mit Biacore Analyse der Interaktion zwischen Cystatin B und Papain Charakterisieren
Mammalian Cystatin B ist eine reversible, wettbewerbsfähige und tight-binding Protein Inhibitor der Papain-ähnlichen Cystein-Proteinasen, vor allem Cathepsin B, H, K, L und S. Diese Proteine sind vor allem in nons beteiligtelektiven intrazellulären Proteinabbau. Cystatine sind davon ausgegangen, dass Zellen und Gewebe vor unangemessenen Proteolyse durch diese Enzyme zu schützen. Sie haben auch inaktivieren Cysteinproteinasen von Parasiten und Viren und können in der Verteidigung gegen eine Invasion von solchen Infektionserregern zu beteiligen. Darüber hinaus hemmen Cystatine mehrere Anlagen Cysteinproteinasen, wie Papain, die häufig als ein Modell-Enzym in Struktur-Funktions-Studien verwendet wird. Die dreidimensionale Struktur des Cystatin-B-Komplex mit Papain 3 zeigt, dass die Interaktion zwischen den beiden Proteinen durch hydrophobe Kontakte, die aus dem Inhibitor Seite, von der N-und C-terminalen Enden und zwei Haarnadelschleifen vorgesehen sind, dominiert wird ( Abbildung 1). In dieser Studie untersuchen wir die Bedeutung des C-terminalen Ende und der zweite Bindungspartner Schleife von Cystatin B für die Bindung an mit Rinder-Cystatin Papain B-Varianten mit Punktmutationen in Bereichen der Interaktion mit Papain. Wir bestimmen zunächst die spezifische Bindung Konzentration der vier Cystatin B-Varianten verwendet werden, sowie die des Wildtyp-Proteins. Sobald die spezifische Bindung Wirkstoffkonzentrationen Cystatin B bestimmt werden, sind die Geschwindigkeit und Affinitätskonstanten von Wildtyp und Mutante Varianten von Cystatin B Bindung an Papain gemessen Biacore X100.
5. Instrument und Reagenzien
- Die Cystatin B Varianten Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly sind Cys3Ser/Tyr97Ala und Cys3Ser hergestellt wie zuvor beschriebenen 4. Alle Mutanten enthalten eine zusätzliche Substitution von Cystein zu Serin an Position 3, um die Bildung von Disulfid-gebundene inaktive Dimere von Cystatin B. verhindern
- Das Papain Ziel ist auch bereit, wie zuvor 5 beschrieben. Es ist S-(Methylthio) Papain (MMTS-Papain) mit einem Methylthiogruppe an Cys25 im aktiven Spalt, wodurch die Protease katalytisch inaktiv.
- Biacore X100 mit Biacore X100-Plus-Paket dient zur Messung und Analyse der spezifischen Bindung Konzentrationen und Bindungskinetik.
- MMTS-Papain auf Sensor Chip CM5 mit Biacore Amine Coupling Kit immobilisiert.
- Die Pisten sind bei 25 ° C durchgeführt, und der Puffer 0,01 M Hepes pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,0034 M EDTA und 0,05% Polysorbat 20.
- Zwischen den einzelnen Variante des Cystatin B, ist die Sensoroberfläche mit 20 mM NaOH für 30 Sekunden bei einer Flussrate von 10 ml / min regeneriert.
6.Immobilization der Ligand MMTS-Papain
Kovalente Bindung von MMTS-Papain für EUFA Analyse
EUFA beruht auf Messung der Bindung Rate unter Bedingungen, wo die Rate durch Diffusion von Analyt-Moleküle an die Oberfläche (Stofftransport Begrenzung) begrenzt ist. Dies ist durch eine hohe Immobilisierung Ebenen des Liganden begünstigt. Immobilisierung von MMTS-Papain wurde eingerichtet und laufen über die Immobilisierung Assistent von Biacore X100-Control-Software.
- Aktivieren Sie die Oberfläche in Flow-Zelle 2 durch Injektion einer Mischung von Succinimid (NHS) und Carbodiimid (EDC) für 7 Minuten bei einer Flussrate von 10 ml / min. Flow-Zelle 1 ist unverändert bleiben, um als Bezugsfläche verwendet werden.
- Inject MMTS-Papain auf 50μg/ml in Natriumacetat-Puffer bei pH 4,5 für 15 Minuten bei einer Flussrate von 5 ml / min.
- Ethanolamine ist für 7 Minuten bei einer Flussrate von 10 ml / min, um die verbleibenden aktiven Estern deaktivieren injiziert.
Die gesamte Kupplung Verfahren sollte in Folge ~ 3000 RU MMTS-Papain in Flow-Zelle 2 immobilisiert.
Kovalente Bindung von MMTS-Papain für kinetische Analyse
Das gleiche Verfahren wird zur Immobilisierung von MMTS-Papain für kinetische Analyse, mit dem einzigen Unterschied, dass in kinetische Analyse, die Immobilisierung Ebene zu sein, um die Bindung Rate beschränkt wird durch Diffusion zu vermeiden geringen Anforderungen eingesetzt. Flow-Zelle 1 ist unverändert bleiben in diesem Schritt auch, um als Bezugsfläche verwendet werden.
- Nach Aktivierung der Oberfläche mit der Mischung von NHS und EDC als in 7.1 ist MMTS-Papain auf 1μg/ml für 50 Sekunden injiziert. Danach wird die Oberfläche mit einer Injektion von Ethanolamin als in Schritt 7.3 de-aktiviert.
Die Kopplung Ebene sollte ca. 50 RU werden nach diesem Verfahren.
7. Bestimmen Cystatin B-Konzentration mit der EUFA Test
- Die EUFA Experiment ist nach der EUFA Assistenten in Biacore X100-Plus-Paket gesetzt. Etwa 10 nM Protein ist bei Flussraten 10 und 100 ml / min in zweifacher Ausfertigung für 48 Sekunden injiziert. Die Oberfläche ist mit 20 mM NaOH zwischen jedem Zyklus regeneriert.
- Fügen Sie leere Spritzen für jeden Durchsatz.
- Die Proteinkonzentration wird dann aus der Bindung von Daten (Abbildung 3) mit th bestimmte EUFA Auswertung Merkmal der Biacore X100-Plus-Paket Auswertesoftware.
Abbildung 2. Die Ergebnisse der EUFA Analyse von Wildtyp-Cystatin B. Die spezifische Bindung Konzentration Daten wurden von der Sensorgrammen bei Flussraten von 10 und 100 ml / min erhalten extrahiert.
Abbildung 3. Konzentrationen der Mutanten ermittelt A 280-Messung (n = 3) und EUFA (n = 2). Die Standard-Fehler werden durch Fehlerbalken bezeichnet. Das molare Absorptionskoeffizienten wurden berechnet, wie in (6) beschrieben. Ein großer Unterschied in der Konzentration Werte Cys3Ser/Leu73Gly Mutante durch die beiden Methoden bestimmt werden können beobachtet werden. - Beim Vergleich der Konzentration von A 280-Messung mit, dass durch EUFA bestimmt wird, ist es klar, dass, während in den meisten Fällen wird das Protein vollständig aktiv, für die Cys3Ser/Leu73Gly Variante, der Anteil der aktiven Proteins sehr gering ist (Abbildung 3). Die folgende Tabelle zeigt die Aktivitäten des Cystatin B Varianten bezogen auf das Gesamtgewicht Konzentrationen von A 280.
Probe EUFA in Bezug auf A 280 (%) Wildtyp 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. Die Messung der Kinetik des Cystatin B Bindung an Papain
- Basierend auf der EUFA Messungen, bereiten eine zweifache Konzentration Serie reichen von 2,5 bis 40 nM für jeden der Cystatin B-Varianten.
- Die Kinetik Experiment wird mit Hilfe der Kinetik-Assistenten in Biacore X100 mit dem Single-Cycle-Ansatz aus. Die Oberfläche ist nicht zwischen den Injektionen regeneriert, aber nach dem Ende eines jeden Zyklus-Analyse unter Verwendung von 20 mM NaOH als Regenerations-Lösung.
- Der Versuchsaufbau ist so, dass jeder Zyklus haltige Probe durch ein Leerzeichen Zyklus, in dem Puffer anstelle von Probe injiziert wird flankiert wird.
- Verwenden Sie die Kinetik Auswertung Funktion in Biacore X100 um automatisch leere Subtraktionen Bezugspunkt abgezogen Daten vor dem Einbau einer 1:1-Interaktionsmodell.
- Die experimentellen Daten für die Bindung von Cystatin B-Varianten zu Papain erhalten ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Tabelle fasst die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten und das Gleichgewicht Dissoziationskonstanten in der kinetischen Analyse erhalten.
Probe k a (M -1 s -1) k d (s -1) K D (M) Wildtyp 1,8 x 10 6 0,41 x 10 -3 2,3 x 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1,1 x 10 6 1,7 x 10 -3 1,5 x 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1,1 x 10 6 23 x 10 -3 2,2 x 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1,7 x 10 6 12 x 10 -3 7,1 x 10 -9 Cys3Ser 0,9 x 10 6 0,53 x 10 -3 5,8 x 10 -10 
Abbildung 4. Kinetic-Profile für Cystatin B Varianten Bindung an MMTS-Papain ermittelt Single-Cycle-Kinetik. Sensorgramme zeigen blank-und Referenz abgezogen Daten mit kinetischen fit für den 1:1-Interaktion-Modell in Schwarz überlagert. - Während der Verband Preise der Mutanten vergleichbar mit der des Wildtyp-Proteins (Abbildung 5, oben), kann die Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten der Mutanten höher sein um fast zwei Größenordnungen, mit einer entsprechenden Erhöhung des Gleichgewichts Dissoziation konstant (Abbildung 5, unten).
Abbildung 5. Die Berechnungen der Geschwindigkeit und Affinitätskonstanten wurden die Konzentrationen von EUFA erzielt wurden. Die Änderungen von k a, k d und K D, mit der Mutationen sind in den Diagrammen dargestellt. - Da Probenkonzentration ist ein Parameter in die Berechnung des Vereins Geschwindigkeitskonstante aus den experimentellen Daten ist eswichtig, dass es korrekt ist. Mit der Konzentration auf die A 280 Messung statt EUFA basiert, würde zu dem Schluss führen, dass Leu73 ist wichtig für den Verein Rate, wo Ersatz scheint in etwa 10 mal langsamer als die anderen Verein Cystatin B-Varianten führen. Allerdings ist die spezifische Bindung Konzentration von EUFA gemessen nur etwa 10% des gesamten Proteins in diesem Fall. Wenn diese dies berücksichtigt wird deutlich, dass der Verein Rate für Leu73 ähnlich wie bei den anderen Varianten ist. Daher erlaubt EUFA für eine korrekte Beurteilung der k a und K D die damit die angemessene Interpretation der Wechselwirkung Mechanismus.
Discussion
In dieser Arbeit wurden vier Mutanten und Wildtyp Cystatin B produziert, um die Bedeutung der zweiten Schleife binden zu bewerten und C-terminalen Enden für die Interaktion zwischen Cystatin B und Papain. Diese Studie zeigt die Vorteile und die einfache Handhabung Biacore X100 um eine spezifische Bindung Konzentration zu bestimmen und die Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren, um Struktur-Funktions-Beziehungen zu verstehen. Wir haben gezeigt, dass die Messung insgesamt Proteinkonzentration offenbaren jedoch nicht die Protein-Varianten, die bindende Aktivität, die in diesem Fall führt eine signifikante Messfehler bei der Bestimmung der Bindungsaffinität und Kinetik reduziert haben. Die spezifische Bindung Konzentrationen des Cystatin B-Varianten wurden mittels EUFA mit Biacore X100. Mit Konzentration Messungen EUFA als Eingabe für die kinetische Analyse ergab zuverlässig bewerten und Affinitätskonstanten, so dass die richtige Interpretation der Wechselwirkung Mechanismus.
Die verminderte Affinität der Mutanten wurden fast ausschließlich wegen eines erhöhten k d-Wert, während k eine nur geringfügig betroffen war. Dieses Verhalten zeigt, dass sowohl die zweite Bindungsstelle Loop-Region und dem C-terminalen Ende nicht für die Bindung von Inhibitor zu Papain wichtig. Stattdessen tragen sie zur Bindungsaffinität in erster Linie, indem der Inhibitor an das Enzym gebunden, sobald der Komplex gebildet hat.
Disclosures
Der Autor wird von GE Healthcare, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Plastic Vials 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
References
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