Summary
Мы применяем без наклеек анализа взаимодействия белков использованием Biacore X100 для структуры и функции анализа связывания нескольких мутантов B цистатина к папаин через кинетические характеристики. Калибровка без анализа концентрации (ЦАФД) измеряет концентрацию белка с сохраненными связывающей активностью без необходимости использования стандартной кривой. Мы покажем, что подтверждение концентраций с использованием ЦАФД повышает надежность кинетического анализа и кинетических констант может надежно определить, даже если активность рекомбинантного белка снижается.
Abstract
В данном исследовании мы рассматриваем взаимодействие между бычьим цистеина ингибитор протеазы B цистатина и каталитически неактивной формы папаина (рис. 1), протеазы завод цистеин, в режиме реального времени без наклеек анализ с использованием Biacore X100. Несколько цистатина В вариантах с точечными мутациями в области взаимодействия с папаин, производятся. Для каждого варианта B цистатина мы определить его концентрацию специфического связывания с использованием калибровочных без анализа концентрации (ЦАФД) и сравнить полученные значения с общей концентрации белка, как это определено
Protocol
Рисунок 1. Трехмерную структуру цистатина группы В (синий) с папаин (желтый). Мутировавший остатков цистатина B отображаются красным цветом.
1. Принципы этикетки без анализа взаимодействия с использованием Системы Biacore
В типичной без наклеек обязательным эксперимент с использованием системы Biacore, биомолекулы называют "лиганд" прикреплен к поверхности датчика чип. Система потока каналов приносит его связывания партнера, называются "аналита, в контакт с поверхности чипа, где обнаружения. Когда аналита связывается с лигандом, в результате изменений в накоплении массы на поверхности обнаруживается поверхностных плазмонов резонанса (SPR). Ответ SPR пропорциональное количество обязательных аналита.
С обязательным измеряется в режиме реального времени, кинетическая ассоциации и диссоциации констант скоростей специфического взаимодействия может быть определен. Исходя из этих констант, можно рассчитать, как близость равновесия константы диссоциации. Кроме того, можно рассчитать близости от стационарного состояния привязки данных. Аналогичная методика может быть использована для определения концентрации белка, который специфически связывается с лигандом на поверхности.
2. Анализ кинетических свойств белок-белковых взаимодействий
В X100 Biacore, кинетический анализ можно выполнить с помощью одного цикла кинетики. В один цикл эксперимента кинетики концентрации серии аналита вводят в одном цикле анализа без регенерации поверхности между инъекциями. Таким образом, за один цикл кинетики позволяет кинетического анализа, когда трудно найти подходящие условия регенерации.
После того как данные по кинетической эксперимента была собрана, Biacore X100 оценку ПО генерирует значения к, к D, K и D путем подбора данных для модели взаимодействия.
3. Подходы к определению концентрации белка
Анализ взаимодействия биомолекул важно для понимания их функций. Характеризуя связывания белков с другими белками, на нуклеиновые кислоты, или малых молекул имеет основополагающее значение для биохимических исследований, и находит применение во многих других областях, включая новых лекарственных препаратов.
Для точного измерения кинетики взаимодействия между двумя взаимодействующими белками важно знать концентрацию, специфически связывающих белков в опытный образец, который используется как аналита. Спектрофотометр чтении 280 или колориметрических анализов, таких как один применением реагента Брэдфорда обычно используется для определения общей концентрации белка. Тем не менее, белок примесей может влиять на результат. Еще важнее то, как активные и неактивные формы белка, включены в общую концентрацию белка. Особенно в случае рекомбинантных белков, которые могут быть неактивными из-за неправильного складывающиеся, важно, чтобы определить процент, специфически связывающих белков в исследуемом образце.
В X100 Biacore, концентрации, связанных с конкретными связывающей активности может быть определен путем сравнения уровней обязательным ответом на калибровочной кривой основе известных стандартов, или с помощью совсем недавно представила методологию калибровки, свободной от анализа концентрации (ЦАФД). ЦАФД не опирается на стандарт. Таким образом, ЦАФД особенно полезно в случае изучения мутантных форм белков, где стандарты, как правило, не доступны.
В эксперименте ЦАФД, начальные обязательные измеряется при различных скоростях потока в условиях, когда распространение образца к поверхности чипа является лимитирующим. Коэффициент диффузии аналита, размеры ячейки потока и расхода принимаются во внимание при расчете специфического связывания концентрации от начального обязательным 1,2 ставки.
В эксперименте кинетика, концентрация аналита используется при расчете кинетической скорости ассоциации постоянной и близости от экспериментальных данных. ЦАФД и кинетические измерения в системах Biacore опираются на те же свойства взаимодействия. Поэтому, используя специфического связывания концентрации определяется с помощью анализа Biacore, а не общую концентрацию белка, повышает достоверность полученных результатов.
4. Использование Biacore анализа характеризующими взаимодействие цистатина B и папаин
Млекопитающих B цистатина является обратимым, конкурентоспособной и сильной связи белка ингибитора папаин-подобные протеиназы цистеина, в первую очередь катепсин B, H, K, L и S. Эти белки участвуют в основном фононамивыборные внутриклеточной деградации белков. Cystatins, как предполагается, защищают клетки и ткани от ненадлежащего протеолиз этих ферментов. Они также инактивации протеиназы цистеина от паразитов и вирусов, и могут участвовать в защите от вторжения в таких инфекционных агентов. Кроме того, cystatins тормозят несколько завода цистеиновых протеиназ, таких как папаин, который часто используется как модель фермента в структурно-функциональных исследований. Трехмерной структуре комплекса B цистатина с папаин 3 показывает, что взаимодействие между двумя белками преобладают гидрофобные контакты, которые, с ингибитором стороны, предоставляются N-и С-концевые концы и две петли шпильки ( Рисунок 1). В данном исследовании мы рассмотрим важность C-конце, а второй обязательный цикл цистатина B для связывания с папаин, используя бычий цистатина B вариантов содержащих точечные мутации в области взаимодействия с папаин. Мы сначала определить специфического связывания концентрация четыре цистатина B варианты используются, а также у диких белок типа. После специфического связывания концентрации активных B цистатина определены, скорость и близость констант дикого типа и мутантных вариантов цистатина В привязке к папаин измеряются с помощью Biacore X100.
5. Инструмент и реагенты
- Варианты цистатина B Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala и Cys3Ser производятся, как описано выше 4. Все мутанты содержат дополнительные замена цистеина на серин в положении 3, чтобы предотвратить образование дисульфидных связанных неактивных димеров цистатина B.
- Целевой папаин также готова, как описано выше 5. Это S-(метилтио) папаин (ММТС-папаин), имеющего группу метилтио придается Cys25 в активном расщелина, оказание протеазы каталитически неактивным.
- Biacore X100 с X100 Biacore Plus Пакет используется для измерения и анализа специфического связывания концентрации и обязательным кинетики.
- ММТС-папаин иммобилизованных на датчик CM5 чипов с помощью Biacore Амин Муфта Kit.
- Работает выполняются при 25 ° С, а буфер 0,01 М Hepes при рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,0034 М ЭДТА и 0,05% полисорбат 20.
- Между каждым вариантом цистатина B, поверхность датчика регенерируется с 20 мМ NaOH в течение 30 секунд при скорости потока 10 мкл / мин.
6.Immobilization лиганда ММТС-папаин
Ковалентная крепления ММТС-папаин для анализа ЦАФД
ЦАФД основан на измерении скорости обязательным в условиях, когда скорость ограничена диффузия молекул аналита на поверхности (ограничение общественного транспорта). Этому способствует высокий уровень иммобилизации лиганда. Иммобилизация ММТС-папаин была создана и запущена с помощью иммобилизации мастера из Biacore программного обеспечения управления X100.
- Активация поверхности в потоке ячейка 2 с помощью инъекции из смеси сукцинимид (NHS) и карбодиимида (EDC) в течение 7 минут при скорости потока 10 мкл / мин. Проточная ячейка 1 остается в неизменном виде в порядке, который будет использоваться в качестве опорной поверхности.
- Inject ММТС-папаин в 50μg/ml в буферного раствора ацетата натрия при рН 4,5 в течение 15 минут при скорости потока 5 мкл / мин.
- Ethanolamine вводят в течение 7 минут при скорости потока 10 мкл / мин до отключения оставшиеся активные сложные эфиры.
Вся процедура сцепление должно привести к ~ 3000 RU ММТС-папаин иммобилизованных в проточной ячейке 2.
Ковалентная крепления ММТС-папаин для кинетического анализа
Такая же процедура используется для иммобилизации ММТС-папаин для кинетического анализа, с той лишь разницей, что в кинетический анализ, иммобилизация уровне должна быть низкой, чтобы избежать обязательной ставка становится ограниченным путем диффузии. Проточная ячейка 1 остается в неизменном виде в этом шаге, а для того, чтобы использовать в качестве опорной поверхности.
- После активации поверхности смесью NHS и EDC, как в 7.1, ММТС-папаин вводится на 1μg/ml в течение 50 секунд. После этого поверхность деактивируется с введением этаноламин, как в пункте 7.3.
Муфта уровень должен быть примерно 50 RU после этой процедуры.
7. Определение концентрации цистатина Б, используя анализ ЦАФД
- Эксперимент ЦАФД настроена в соответствии с ЦАФД мастер Biacore X100 Plus Package. Примерно 10 нМ белка вводится при скоростях потока 10 и 100 мкл / мин в двух экземплярах в течение 48 секунд. Поверхность восстанавливается с 20 мМ NaOH между каждым циклом.
- Включите пустые инъекции для каждого потока.
- Концентрация белка в этом случае определяется из привязки данных (рис. 3), используя йэлектронной ЦАФД оценки особенностью Biacore X100 Plus Пакет программного обеспечения оценки.
Рисунок 2. Результаты анализа ЦАФД дикого типа цистатина Б. специфического связывания данных концентрация была извлечена из sensorgrams, полученных при скорости потока 10 и 100 мкл / мин.
Рисунок 3. Концентрации мутантов определяется с использованием 280 измерений (п = 3) и ЦАФД (п = 2). Стандартные ошибки обозначены погрешности. Молярные коэффициенты поглощения были рассчитаны, как описано в (6). Большая разница в концентрации значения Cys3Ser/Leu73Gly мутант определяется двумя методами можно наблюдать. - При сравнении концентрации определяется 280 измерений, что к ЦАФД, ясно, что, хотя в большинстве случаев белка полностью активен, для варианта Cys3Ser/Leu73Gly, доля активных белков является очень низким (рис. 3). Приведенная ниже таблица показывает деятельность цистатина B варианты, связанные с общей концентрации по 280.
Образец ЦАФД в связи с 280 (%) Дикий тип 94 Cys3Ser/His75Gly 101 Cys3Ser/Leu73Gly 9 Cys3Ser/Tyr97Ala 99 Cys3Ser 83
8. Измерение кинетики цистатина В привязке к Папаин
- На основании ЦАФД измерений, подготовить два раза концентрации серии от 2,5 до 40 нм для каждого из вариантов цистатина B.
- Эксперимент кинетики настроен с помощью мастера кинетики в X100 Biacore с единого подхода цикла. Поверхность не восстанавливаются между инъекциями, но после окончания каждого цикла анализа, используя 20 мМ NaOH в качестве регенерационного раствора.
- Настройка эксперимента так, чтобы каждый цикл, содержащий образец в окружении пустых циклов, где буфер вводится вместо образца.
- Используйте функцию кинетики оценки в X100 Biacore автоматически выполнять пустую вычитаний ведения вычитаются данные перед установкой модели 1:01 взаимодействия.
- Экспериментальные данные, полученные для связывания варианты цистатина Б папаин показано на рисунке 4. Приведенная ниже таблица ассоциаций и константы скорости диссоциации и константы диссоциации равновесия, полученные в кинетический анализ.
Образец А (М -1 с -1) к д (с -1) К D (M) Дикий тип 1,8 х 10 6 0,41 х 10 -3 2,3 х 10 -10 Cys3Ser/His75Gly 1,1 х 10 6 1,7 х 10 -3 1,5 х 10 -9 Cys3Ser/Leu73Gly 1,1 х 10 6 23 х 10 -3 2,2 х 10 -8 Cys3Ser/Tyr97Ala 1,7 х 10 6 12 х 10 -3 7,1 х 10 -9 Cys3Ser 0,9 х 10 6 0,53 х 10 -3 5,8 х 10 -10 
Рисунок 4. Кинетические профили для цистатина B варианты привязки к ММТС-папаин определяется с помощью одного кинетики цикла. Sensorgrams показывают пустые и ссылки вычитать данные с кинетической 1:01, пригодный для модели взаимодействия накладным в черное. - Хотя объединение темпы мутанты сравнима с диким типом белка (рис. 5, верхней панели), скорость константы диссоциации мутанты могут быть выше, почти на два порядка, с соответствующим увеличением равновесной диссоциации постоянной (рис. 5, нижняя панель).
Рисунок 5. Расчетов скорости и близости констант были основаны на концентрации получены из ЦАФД. Изменения к, к D и К D, связанных с мутациями изображены на графиках. - Так как образец концентрации параметром при расчете скорости ассоциации константу из экспериментальных данных, этоважно, что это правильно. Использование концентрации на основе 280 измерений, а не ЦАФД привело бы к выводу, что Leu73 важно для скорости ассоциации, где замена кажется, результат примерно в 10 раз медленнее, чем ассоциации и другие варианты B цистатина. Тем не менее, специфического связывания концентрация измеряется ЦАФД составляет лишь около 10% от общего белка в этом случае. При этом берется во внимание то становится ясно, что скорость ассоциации Leu73 похоже, что и другие варианты. Таким образом, ЦАФД позволяет правильно оценить к и К D тем самым сделав возможным соответствующее толкование механизм взаимодействия.
Discussion
В этой работе, четыре мутантов и диких B цистатина было произведено для того, чтобы оценить важность второй обязательный цикл и С-концевой концов, для взаимодействия между цистатина B и папаин. Это исследование продемонстрировало преимущества и простоту использования Biacore X100, чтобы определить концентрацию специфического связывания и проанализировать кинетику белок-белковых взаимодействий, чтобы понять, структурно-функциональных отношений. Мы показали, что измерение общей концентрации белка не раскрывает белка варианты, которые снизили активность связывания, который в данном случае представляет значительные погрешности измерения при определении аффинность связывания и кинетики. Специфического связывания концентрации варианты цистатина B определяли с помощью ЦАФД с X100 Biacore. Использование измерений концентрации по ЦАФД как входные данные для кинетического анализа привели к надежным скорости и близости констант, позволяя тем самым право интерпретации механизм взаимодействия.
Снизилась сродства мутанты были почти исключительно в связи с ростом к г-значение, тогда как к повлияло незначительно. Такое поведение указывает, что и вторая области связывания петлю и С-терминального конца не важны для связывания скорость ингибитор папаин. Вместо этого, они вносят вклад в сродство в первую очередь, сохраняя ингибитор придается фермента раз комплекс был сформирован.
Disclosures
Автор является сотрудником компании GE Healthcare, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore™ X100 System | GE Healthcare | BR-1100-73 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Biacore™ X100 Plus Package | GE Healthcare | BR-1007-98 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1000-14 | http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| Acetate buffer pH 4.5, 50 ml | GE Healthcare | BR-1003-50 | |
| HBS-EP+ buffer 10X, 4 x 50 ml | GE Healthcare | BR-1008-26 | |
| Plastic Vials 11 mm | GE Healthcare | BR-1002-87 | |
| Rubber caps, type 2 | GE Healthcare | BR-1004-11 |
References
- Christensen, L. L. H. Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation. Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).
- Sigmundsson, K., Mâsson, G., Rice, R., Beauchemin, N., Öbrink, B. Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification. Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).
- Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction. EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).
- Pol, E., Björk, I. Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases. Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).
- Björk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes. Biochem. J. 299, 219-225 (1994).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).
