שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ ' taeda ל) ומינים אחרים Conifer

Summary

הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly (

Abstract

רקמות שבודד מינים כוניפאר, בעיקר אלה השייכים למשפחת Pinaceae, כגון אורן loblolly (

Protocol

חלק 1: קציר עץ

לאחר עץ נבחרה כרותים, חשוב לעבוד בזהירות במהירות האפשרית. כמו כל סוג רקמה שונה שנקטפו, הם צריכים להציב מיד לתוך כלי משלהם חנקן נוזלי, כדי למנוע זיהום לחצות החומר המדגם. זה פרוטוקול בידוד RNA הוא מדרגי.

1. גזור ברגים לתוך באורכים של מ כ ו 0.5-0.75 עם ציון מסור את הקליפה בשניים או שלושה מקומות בעקבות ציר האורך של הבורג.
2. באמצעות אזמל עץ, העבודה קצה האזור הבקיע עד הקליפה מתחילה נפרד מן העץ ולהמשיך לעבוד את האזמל תוך משיכת חזרה על הקטע של לנבוח עד שהוא מפריד לחלוטין מן הגבעול.
3. העצה המשנית שנקטפו עם תער קצה, על ידי גירוד צדדית יחיד לאורך ציר האורך של הבורג כי כבר מקולף. ללבוש כפפות גומי כדי למזער זיהום של הרקמה.
4. השיפה, הנמצא על הצד הפנימי של הסעיפים לנבוח, הוא לקצור בקלות על ידי מדריך מתקלף.
5. עץ תגובת נאסף מן החלק התחתון של הגפיים לאחר סימון אותם עם ספריי כדי לציין האוריינטציה המקורית שלהם לגבי הקרקע.
6. איברים נחתכים לתוך גלילים של 1-2 מ 'והבקיע בצדדים מנוגדים לאורך ציר האורך פי במיקום המשוער של שני סוגי עץ תגובה: עץ מול (בצד העליון של האיבר) ועץ דחיסה (בתחתית בצד של האיבר). הנביחה מופרד הגפה כפי שתואר לעיל, אלא רק את הקליפה מכסה כל סוג של עץ תגובת מוסר בבת אחת. העצה השיפה המשני או נאסף אז כפי שתואר לעיל והושמו חנקן נוזלי.
7. דוגמאות אחרות, כמו מחטים, טיפים לירות קונוסים צעיר, ניתן לקצור ביד או באמצעות מזמרה כנדרש.
8. דוגמאות שנאספו מוקפאת בחנקן נוזלי צריך להיות ממוקם בתוך שקיות או מיכלים המסומנים מתאים ארוז בקרח יבש עבור המשלוח בחזרה למעבדה.

חלק 2: מיל מקפיא עיבוד של דוגמאות

1. מלאו את 6850 טחנת Spex מאגר במקפיא עם חנקן נוזלי והמקום בר השפעה לאחד צלוחיות שחיקה למלא עם חנקן נוזלי לצנן מראש. יוצקים את חנקן נוזלי ולהוסיף מדגם בקבוקון.
2. ודא כי לא נותר עודף חנקן נוזלי בתא כרסום כי גז חנקן עודף פרקו לחלוטין לפני את הכובע בסוף יושב לאטום את החדר.
3. הכנס את בקבוקון טחינה לתוך המוביל ולסגור.
4. מיל דגימות וודי עבור שני מחזורים של דקה 1 / מחזור בהגדרה שיעור של 14.
5. השתמש מרית חנקן נוזלי מקורר כדי להסיר את המדגם הסתובבו (קמח עץ) לתוך מבחנה כי כבר מראש מקורר והוא מכיל כמות קטנה של חנקן נוזלי.
6. יוצקים את slurry חנקן נוזלי / מדגם לתוך מיכל אחסון מקום -80 ° C עד הצורך.

חלק 3: בידוד RNA, יום 1

1. המקום 20mL של הצפת בידוד RNA לתוך צינור פלקון 50 מ"ל כתרים ולהוסיף 400 בקצרה μL β-mercaptoethanol, מערבולת, אז חום לאמבטיה מים 60 מעלות צלזיוס.
2. הוסף 4 גרם של רקמה קפוא צינור אחד. שווי ולנער במרץ ביד ואחריו vortexing למשך 10 שניות.
3. הוסף נפח שווה של כלורופורם אל הצינור להפוך בעדינות לתערובת. מניחים את הצינור על גלגל מסתובב ולאפשר סוף סוף על ערבוב במשך 5 דקות.
4. למזוג את התערובת לתוך שפופרת 50 מ"ל ו Oak Ridge צנטריפוגות ב 12,000 (17,200 XG) סל"ד ב הרוטור קבוע זווית SS34 במשך 5 דקות.
5. מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם.
6. וורטקס דקה 1 וממשיכים לערבב על גלגל מסתובב במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה במשך 5 דקות.
7. מעבירים את השלב מימית כדי צינור Oak Ridge טרי ולהוסיף חצי נפח של כלורופורם. וורטקס דקה 1. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד (17,200 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 10 דקות.
8. מעבירים את השלב מימית כדי צינור 50 מ"ל מהירות גבוהה פוליפרופילן. צנטריפוגה ב 10,000 סל"ד (11,900 XG) בתוך הרוטור SS34 זווית קבועה למשך 20 דקות.
9. למזוג supernatant לתוך צינור פלקון 50 מ"ל ומוסיפים 1 / 4 נפח 10 M פתרון LiCl כדי supernatant. בקצרה מערבולת מקום ב 4 ° C עבור משקעים בין לילה.

חלק 4: בידוד RNA, יום 2

1. SSTE חום חיץ אמבטיה 65 מעלות צלזיוס המים לפני ההתחלה.
2. יוצקים את המדגם LiCl-זירז לתוך צינור פוליפרופילן גלולה הרנ"א על ​​ידי צנטריפוגה ב 11,000 סל"ד ב הרוטור SS34 זווית קבועה (14,450 XG) במשך 30 דקות 4 ° C.
3. לאחר צנטריפוגה,לשפוך וישאירו את הנוזל, ו להפוך את הצינורות על Kimwipes דקה בערך 1. פיפטה את כל supernatant הנותרים.
4. Resuspend כל גלולה ב 800 μL של SSTE מחומם בעזרת פיפטה כדי לערבב היטב את הדגימות. העברת דגימת resuspended עד 2 מ"ל Ambion RNAse ללא צינורות microfuge.
5. דגימות מחממים על 65 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ואחריה vortexing נמרצת על מנת להבטיח resuspension להשלים.
6. הוסף נפח שווה של פנול, כלורופורם, pH8, אל צינור כל המדגם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ואז ספין microfuge בסל"ד 14,000 עבור 3 דקות
7. מעבירים את השלב מימית כדי חדש 2ml RNAse ללא צינורות Ambion microfuge, ולהוסיף נפח שווה של כלורופורם. וורטקס כל מדגם למשך 30 שניות ספין microfuge ב 14,000 סל"ד למשך 3 דקות.
8. העברת השלב מימית לשלב-Lock שפופרות ג'ל שהוכנו בעבר על ידי microfuging בסל"ד 11,000 במשך 2 דקות. הוסף חצי נפח של כלורופורם בעדינות פיפטה לערבב.
9. צנטריפוגה בסל"ד 11,000 במשך 5 דקות ולהעביר את השלב מימית כדי טריים 2ml Ambion RNAse ללא צינורות microfuge.

חלק 5: RNA רטיבות ולשטוף אתנול

1. הוסף 50 אצטט μL 3.0 M נתרן, pH 4.8, ו - 1 מ"ל 100% אתנול לשלב מימית. וורטקס ו להאיץ ב -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לילה ב -20 ° C.
2. Microfuge דגימות 14,000 סל"ד במשך 30 דקות ב 4 ° C, ובזהירות לשאוב את supernatant. נא לא להפריע את הכדור.
3. לשטוף את כדורי RNA עם 1 מ"ל אתנול ° C 70% (v / v) -20. Microfuge בסל"ד 14000 לרגע 1 ו לשאוב את אתנול.
4. חזור על שלב 5.3.
5. מסירה את הפקק מעל צינורות אוויר יבש כדורי על הספסל במשך 3-5 דקות.

חלק 6: Resuspension כימות הסופי

1. Resuspend כל גלולה במים 100 DEPC שטופלו μL. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפני ששמים על הקרח. חזור במידת הצורך, כדי להבטיח resuspension המדגם.
2. בריכת כמו דגימות אם רוצים ולעשות 50 μL של דילול 1:10 ב 10mm טריס, pH 7.5, עבור quantitation spectrophotometric. יחס ספיגת עבור 260/280 ו 260/230 הם בדרך כלל יותר מ 2.1 ו -2.2, בהתאמה. RNA התשואות בידוד נע בין 60-120μg / גרם רקמה קפוא.
3. ניתוח דגימות ידי הפעלת 1.5-2.5 מיקרוגרם RNA על 1% agarose ג'ל חיץ טה. לקבלת דוגמיות יותר קריטי, לנתח את RNA באמצעות 2100 Agilent Bioanalyzer לפי הוראות היצרן.

נציג תוצאות:

התשואות RNA בידוד מטווח כוניפאר רקמות שונות 60-120 מיקרוגרם / גרם רקמה קפוא עם דגימות וודי מניב בדרך כלל סביב 70-80g / גרם רקמה קפוא. יחסי אבחון של 260/280 ו 260/230 הן בדרך כלל יותר מ 2.1, הם אינדיקטורים טובים כי המדגם RNA ללא פנוליות משמעותי או זיהום הפחמימות, בהתאמה. דוגמאות נותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ואחריו מכתים EtBr צריך להראות שלוש להקות שונות עבור 25s, 18S, 5S ו-RNA (איור 1). קביעת stoichiometry של 18S ל -28 על agarose ג'ל הוא סובייקטיבי במקצת, גורמים כגון ריצה התנאים הג'ל, מכתים, והוא יכול לטעון מדגם כל השפעה. באופן כללי, -28: יחס 18S ייראה> 1.5. עם זאת, כמה דוגמאות כוניפאר יש יחס נמוך יותר. לדוגמה, לאחר ניתוח Agilent 2100 ראינו כמה מקרים של דגימות מן כוניפאר סוגי רקמות שונים שבהם stoichiometry הוא קרוב יותר 1.2:1. לכן, לכאורה -28 נמוך: 18S stoichiometry ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose אינו מצביע בהכרח על מדגם באיכות ירודה. ליף, לירות, דגימות חרוט לעתים קרובות יהיה להקות שונות נוספות הנוכחי בשל RNAs ריבוזומלי chloroplastic. EtBr מוכתם מחומרים שאינם נודדים מן המדגם טוב או גבוה להקות מסה מולקולרית (> 8-10 kb) בדרך כלל מצביעים על זיהום הדנ"א הגנומי (איור 2). מסה מולקולרית נמוכה מריחות בקרבת או מתחת הלהקה 5S והלהקה מופחת מכתים ריבוזומלי או 18S לכאורה> stoichiometry -28 הוא אינדיקטור טוב כי RNA השפלה אירעה (איור 3). בסופו של Agilent 2100 electropherogram, קו הבסיס צריך להיות נמוך יחסית וחלק גדול עם פסגות המתאים 18S ו -28 RNAs ריבוזומלי שיש -28: 18S יחסי בכל מקום החל 1.2-2.0. מספר RNA Agilent יושרה (רין) ערך עשויה להיות מנבא טוב יותר של איכות רנ"א צריך להיות לפחות 7 או יותר עבור רנ"א היא לשמש להכנת מטרות microarray. איור 4 מראה טיפוסי Agilent 2100 electropherogram עבור RNA עם העצה -28: 18S יחס שווה 1.4 וערך רין של 8.6 בעוד איור 5 מראה העצה עניים RNA לאחר הכנה בסיסית גבוהה מאוד מורגש השפלה, כפי שהיא מתגלה על ידי -28: 18S raשווה ל 0.65 וערך רין של 3.4 טיו.

1. איור ג'ל agarose ניתוח באיכות גבוהה RNA אורן. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2 מראה אופייני הכולל בידוד RNA מן העצה loblolly אורן המשני -28 ריבוזומלי, 18S אופיינית, ו 5S להקות -28 לעין: היחס 18S> 1.

2. איור ג'ל agarose ניתוח של מדגם RNA אורן מזוהם עם הדנ"א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, ליין 2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ"א הגנומי.

3. איור ג'ל agarose ניתוח של מדגם אורן מראה השפלה RNA וזיהום עם הדנ"א הגנומי. ליין 1, חוד 1 kb סטנדרטי, Lane2, העצה RNA מדגם מראה זיהום הדנ"א הגנומי וחמור השפלה RNA.

איור 4. Agilent 2100 electropherogram של רנ"א סך העצה מבודדים בשיטה המתוארת על העצה אורן loblolly. -28: יחס שווה 1.4 18S, ערך רין שווה 8.6

איור 5. Agilent 2100 electropherogram של רנ"א קצה apical מסך המציג והשפלה קשות זיהום גנטי. -28: יחס שווה 18S 0.65, ערך רין שווה 3.4

Discussion

קבלת באיכות גבוהה RNA ממינים כוניפאר יכול להיות משימה קשה בהתחשב רמות גבוהות של תרכובות פנוליות וכן פוליסכריד נמצא ברקמות וודי. החל פרוטוקול שפותח על ידי Chang et al. (1), נמצא כי מיצוי קפדני יותר לנקות צעדים להוביל לבידוד עקבית של RNA מסך מאוד איכותי של וודי וודי שונים שאינם רקמות שנדגמו מתוך מגוון רחב של מינים כוניפאר. סרט הווידאו הזה הוכיח לא רק שלנו שונה פרוטוקול RNA בידוד, אלא גם את הצעדים שננקטו באוסף בשדה וטכניקות עיבוד המשמש אורנים loblolly לפני RNA בבידוד. צעדים אלה קצירת והכנת חשובים באותה מידה כדי למזער השפלה רנ"א בתחום, אספו דגימות, כמו גם להגדיל הן באיכות RNA ואת התשואה הכוללת. באופן משמעותי ביותר, מצאנו כי RNA מוכן בשיטה זו הובילה עלייה בתשואות סינתזה cDNA בהשוואה לשיטות אחרות המשמשים להכנת מטרות microarray עבור הכלאה נגד PtGen2 loblolly אורן microarray (2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425