Summary
체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 (
Abstract
조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리
Protocol
1 부 : 트리 하베스트
나무를 선택하고 넘어가는되면 그것은 신중하게 최대한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 각기 다른 조직 유형이 수확이므로 시료 물질의 교차 오염을 피하기 위해, 그들은 자신의 액체 질소 용기에 즉시 배치해야합니다. 이 RNA 격리 프로토콜은 확장성입니다.
- 약 0.5-0.75 m의 길이로 볼트를 잘라 전기톱 점수와 두 개 또는 세 곳에 껍질은 볼트의 세로축을 따라.
- 껍질 그것이 줄기에서 완전히 분리까지 나무에서 별도의 껍질 부분에 다시 당기면서 정을 작업을 계속하기 시작 때까지 나무 치즐 사용하여 점수 영역의 가장자리를 작동합니다.
- 보조 목부는 껍질 벗겨지고되었습니다 볼트의 길이 방향 축을 따라 스크레이핑하여 직선 가장자리, 단일 양면 레이저와 수확이다. 조직의 오염을 최소화하기 위해 라텍스 장갑을 착용한다.
- 껍질 섹션의 안쪽에 위치한 체관부는, 쉽게 필링 매뉴얼에 의해 수확이다.
- 반응 나무는 존중 땅에 그들의 원래 방향을 표시하는 스프레이 페인트를 표시한 다음 사지의 아래쪽에서 수집됩니다.
- 팔다리는 1-2미터의 볼트로 잘라 반응 나무의 두 가지 유형의 대략적인 위치에 따라 세로 축을 따라 반대편에 점수입니다 반대 우드 (사지의 상단쪽에)과 압축 나무 (하단에 사지의 측면). 나무 껍질은 반응 나무의 각 유형을 덮고있는 껍질이 한 번에 제거는 것을 제외하고 위에 설명된대로 갈기갈기 구분합니다. 위에서 설명한 및 액체 질소에 배치 보조 목부 또는 체관부 그 다음 수집됩니다.
- 이러한 바늘, 촬영 팁, 젊은 원뿔 같은 다른 샘플은, 손으로 수확하거나 필요한 가지치기 가위를 사용하실 수 있습니다.
- 액화 질소에 냉동 수집 샘플이 표시되어 가방이나 적당한 용기에 위치하고 연구실로 돌아 출하를위한 드라이 아이스로 포장해야합니다.
2 부 : 샘플 냉장고 밀 처리
- 액체 질소로 Spex 6,850 냉동고 밀 저수지 작성 및 연삭 유리병 중 하나에 영향을 막대를 장소와 사전 진정 액체 질소로 입력합니다. 액체 질소를 붓고하고 병을 샘플을 추가합니다.
- 더 초과 액체 질소는 밀링 챔버에 남아없고 마개가 챔버 밀봉하는 장착되어 전에 여분의 질소 가스를 완전히 배출되어 있는지 확인합니다.
- 캐리어와 가까이에 연삭 병을 넣습니다.
- 14 속도 설정 1 분 / 사이클의 두 사이클에 대한 밀 우디 샘플.
- 사전 냉장되고 액체 질소를 소량 이나마 갖고있는 비커에 가공된 샘플 (나무 가루)을 제거하는 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다.
- 필요한 ° C까지 -80에서 보관 컨테이너와 장소에 액체 질소 / 샘플 슬러리 하거라.
파트 3 : RNA 분리, 1 일
- 50mL 덮인 팰컨 튜브에 RNA 격리 버퍼의 20mL 플레이스 후 400 μL β - 메르 캅 토 에탄올, 소용돌이 잠깐, 60 ° C의 물을 욕조에 열을 추가합니다.
- 각각의 튜브에 동결 조직 4g을 추가합니다. 총액 10 초 동안 vortexing 다음 손으로 적극적으로 흔들.
- 튜브에 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하고 섞어 부드럽게 반전. 회전 바퀴에 튜브를 삽입하고 5 분 이상의 엔드 - 엔드는 혼합 수 있습니다.
- 12,000 (17,200 XG) 5 분 SS34 고정 앵글 로터의 RPM에서 50 ML 오크 리지 관과 원심 분리기로 혼합물을 가만히 따르다.
- 새로운 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다.
- 1 분 5 분 회전 바퀴에서 혼합 지속을위한 와동. 5 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기.
- 신선한 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다. 1 분 와동. 10 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기.
- 50 ML 고속 폴리 프로필렌 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 20 분 SS34 고정 각도 로터의 10,000 RPM (11,900 XG)에서 원심 분리기.
- 가만히 따르다의 50 ML 팔콘 튜브에 뜨는 및 뜨는에 25 볼륨 10 M LiCl 솔루션을 추가합니다. 4 간단히 와동과 장소 ° 하루 강수량을위한 C.
4 부 : RNA 분리, 날 2
- 시작하기 전에하는 65 ° C의 물을 욕조에서 열 SSTE 버퍼.
- 4 30 분 SS34 고정 각도 로터의 11,000 RPM (14,450 XG)에서 원심 분리하여 폴리 프로필렌 튜브 및 펠릿 RNA에 LiCl - 시켰던 샘플을 부어 ° C.
- 원심 분리 후,에서 붓다와 액체를 폐기하고, 약 1 분 Kimwipes에 튜브를 반전. 남은 뜨는을 피펫.
- 철저하게 샘플을 혼합하는 피펫을 사용하여 가열 SSTE 800 μL의 각 펠렛을 Resuspend. 2 ML 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 resuspended 샘플을 전송합니다.
- 열 샘플 65 ° C 전체 resuspension을 보장하기 위해 적극적으로 vortexing 다음 2 분.
- 각 샘플 튜브로, 페놀 - 클로로포름, pH8의 동일한 볼륨을 추가합니다. 다음 30 초 동안 와동 각 샘플과 3 분 동안 14,000 rpm으로 microfuge에 스핀
- 새로운 2mL의 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송하고, 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 30 초 3 분 14,000 RPM에서 microfuge의 스핀을위한 와동 각각의 샘플을.
- 이전에 2 분 동안 11,000 rpm으로 microfuging에 의해 준비되었습니다 페이즈 록 젤 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 클로로포름의 절반 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞어 피펫.
- 5 분 11,000 rpm으로 원심 분리기와 신선한 2mL 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송합니다.
제 5 부 : RNA 강수 및 에탄올 워시
- 50 μL의 3.0 M 아세트산 나트륨, 산도 4.8 및 수성 단계 1 ML 100 % 에탄올을 추가합니다. -80의 소용돌이와 침전물 ° -20시 30 분 야간을위한 C ° C.
- Microfuge 샘플 14,000 4 30 분 RPM ° C, 그리고 신중하게 뜨는을 대기음에서. 펠렛을 방해하지 마십시오.
- 1 ML -20 ° C 70% (V / V) 에탄올과 RNA 알약을 씻으십시오. 1 분 14,000 RPM에서 Microfuge과 에탄올을 대기음.
- 5.3 단계를 반복합니다.
- 3~5분에 대한 벤치에 튜브 공기 건조 알약을 모자를 벗다.
6 부 : 최종 Resuspension 및 부량
- 100 μL DEPC - 처리된 물의 각 펠렛을 Resuspend. vortexing으로 믹스하고 얼음에 넣어 전에 2 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 샘플 resuspension을 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다.
- 원하는 및 분광 quantitation 위해 10mM 트리스, 산도 7.5의 1시 10분 희석의 50 μL를하면 샘플이 같은 풀. 280분의 260 및 230분의 260 대한 흡광도 비율은 일반적으로 각각 2.1 및 2.2보다 큰 수 있습니다. 60 - 120μg / g 냉동 조직에서 RNA의 분리 수율 범위.
- 태 버퍼의 1 % 아가로 오스 겔에서 1.5-2.5 μg의 RNA를 실행하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 더 중요한 샘플, 제조 업체의 지침에 따라 같은 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA를 분석합니다.
대표 결과 :
다른 코니퍼 조직 범위에서 RNA의 분리 수율은 60-120에서 우디 샘플 μg / g 냉동 조직은 일반적으로 70-80g / G 냉동 조직 주위에 항복. 280분의 260과 230분의 260의 진단 비율은 모두 2.1보다 일반적으로 더 큰되며, RNA 샘플은 각각 어떤 의미 페놀 수지 carbon이나 탄수화물 오염은 무료입니다 좋은 지표입니다. EtBr의 얼룩 다음 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플은 초, 18S 및 5S RNA (그림 1) 세 가지 서로 다른 밴드를 표시해야합니다. 아가로 오스 젤에 18S에 28S의 stoichiometry 결정하는 것은 다소 주관적이며, 같은 젤, 얼룩 및 샘플 부하 조건을 실행 같은 요인 모두 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로, 28S의 경우 : 18S 비율> 1.5로 나타납니다. 그러나, 일부 침엽수 샘플 낮은 비율을했습니다. 예를 들어, 애질런트 2100 분석 다음 우리는 stoichiometry이 1.2:1에 가까운 다양한 조직 유형에서 코니퍼 샘플의 여러 인스턴스를 볼 수 있습니다. 따라서 명백한 낮은 28S : 18S 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 stoichiometry 반드시 가난한 품질의 샘플을 표시하지 않습니다. 나뭇잎이, 이런, 원뿔 샘플은 종종 추가 뚜렷한 밴드가 chloroplastic ribosomal RNAS로 인해 제공합니다. 물론 표본이나 높은 분자 질량 밴드 (> 8-10킬로바이트)에서 마이 그 레이션하지 EtBr 묻은 물질은 일반적으로 게놈 DNA 오염 (그림 2)를 나타냅니다. 5S 밴드와 감소 ribosomal 밴드 얼룩 또는> 28S의 stoichiometry은 RNA 저하는 (그림 3) 발생했음을 좋은 지표 명백한 18S이나 아래 부근에있는 낮은 분자 질량 뭉개진. 애질런트 2100 electropherogram 분석에서,베이스 라인은 18S와 28S 28S ribosomal하는 데 RNAS에 해당하는 주요 봉우리와 낮은 비교적 부드럽게한다 : 1.2에서 2.0으로 어디까지 18S 비율. 애질런트 RNA 무결성 번호 (RIN) 가치 RNA 품질의 더 나은 예측 수 있으며 microarray 목표의 준비를 위해 사용하는 RNA에 대한 최소 7 이상되어야합니다. 18S : 그림 5 28S에 의해 공개로 RNA 준비는 매우 높은 기준과 눈에 띄는 저하가 발생 가난한 목부를 보여줍니다 동안 1.4 동등 18S 비율과 8.6의 RIN 값 : 그림 4는 28S와 목부의 RNA에 대한 전형적인 애질런트 2100 electropherogram을 보여줍니다 라0.65과 3.4의 RIN 가치와 동일 티오.
고품질 소나무 RNA의 그림 1. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2 특성 ribosomal 28S, 18S, 5S 및 밴드와 명백한 28S와 로블롤리 파인 보조 목부에서 전형적인 총 RNA 분리를 보여줍니다 : 18S 비율> 1.
소나무 RNA 샘플의 그림 2. 아가로 오스 겔의 분석은 게놈 DNA가 오염. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2, 게놈 DNA 오염을 보여주는 목부 RNA 샘플.
RNA의 저하 및 게놈 DNA와 오염을 보여주는 소나무의 샘플 그림 3. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 Lane2, 게놈 DNA의 오염과 심각한 RNA 저하를 보여주는 목부 RNA 샘플.
그림 4. 목부의 총 RNA의 애질런트 2100 electropherogram는 로블롤리 파인 목부에 설명된 방법을 사용하여 격리. 28S가 : 18S 비율은 1.4와 동일, RIN 값은 8.6와 동일
그림 5. 애질런트 심각한 저하와 게놈 오염을 보여주는 혀끝의 팁 총 RNA의 2100 electropherogram. 28S가 : 18S 비율은 0.65와 동일, RIN 값은 3.4 동일
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Discussion
침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 - 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토콜뿐만 아니라 필드 수집 및 절연 RNA하기 전에 로블롤리 파인에 사용되는 처리 기술에서 촬영된 단계뿐만 아니라 증명했다. 이러한 수확 및 준비 단계는 현장에서 수집된 샘플 RNA의 저하를 최소화하기 위해,뿐만 아니라 RNA의 품질과 총 생산량 모두 증가 똑같이 중요합니다. 가장 중요한, 우리는 RNA가 PtGen2 로블롤리 소나무 microarray (2)에 대한 하이브 리다이 제이션에 대한 microarray 목표를 준비하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 cDNA 합성 수율을 증가하게되었다이 방법을 사용하여 준비 것으로 나타났습니다.
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Acknowledgments
닥터 조 나이른, 매트 Bryman, 마이클 보르도, Ujwal Bagal, Huizhe 진, 아만다 Bouffier : 우리는 누구의 도움이 소나무 조직의 수집이 가능 않았을 텐데하지 않고 다음 사람에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA Isolation Buffer | 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-4 | |
| Phenol, Ultrapure | Invitrogen | 15509-037 | |
| 10M LiCl | Made with DEPC-treated water | ||
| SSTE Buffer | 1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0) | ||
| Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8 | Made with DEPC-treated water | ||
| Phenol-chloroform (pH8.0) | 120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0 | ||
| Oak Ridge High Speed Teflon Tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-16B | |
| Polypropylene 50mL High Speed Tubes | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #05-562-10K | |
| BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes | VWR international | #21008-939 | |
| Phase Lock Gel Heavy, 2mL | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #2302830 | |
| Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL | Ambion | #AM12425 |
References
- Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).
- Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray. Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).
