Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten

Summary

Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer (

Abstract

Gewebe aus Nadelbaumarten, insbesondere den Angehörigen der Pinaceae Familie, wie loblolly Kiefer isoliert (

Protocol

Teil 1: Baum Ernte

Nachdem der Baum ausgewählt und gefällt, ist es wichtig, so sorgfältig und so schnell wie möglich zu arbeiten. Da jeder unterschiedliche Gewebetyp geerntet wird, sollten sie sofort in ihre eigenen flüssigem Stickstoff Schiffe gestellt werden, Kreuzkontaminationen von Probenmaterial zu vermeiden. Diese RNA-Isolierung Protokoll ist skalierbar.

1. Cut Schrauben werden in Längen von etwa 0,5 bis 0,75 m und mit einer Kettensäge Partitur der Rinde in zwei oder drei Stellen nach der Längsachse der Schraube.
2. Mit einem Stechbeitel, Arbeit Rande der erzielte Region, bis die Rinde beginnt sich aus dem Holz zu trennen und weiter zu arbeiten die Meißel während Sie wieder auf den Abschnitt der Rinde, bis sie vollständig von dem Stamm.
3. Sekundäre Xylem ist mit einer geraden Kante, einseitig gestochen durch Kratzen entlang der Längsachse der Schraube, die von entrindetes geerntet. Latexhandschuhe tragen, um eine Verunreinigung des Gewebes zu minimieren.
4. Phloem, die auf der Innenseite der Rinde Abschnitten befindet, ist leicht durch manuelles Peeling geerntet.
5. Reaction Holz ist von der Unterseite der Gliedmaßen nach dem Markieren sie mit Sprühlack in ihre ursprüngliche Ausrichtung bezüglich dem Boden zeigen, gesammelt.
6. Die Glieder sind in Schrauben von 1-2 m geschnitten und hat auf beiden Seiten entlang der Längsachse nach dem ungefähren Standorte der beiden Arten von Reaktionen Holz: gegenüber Holz (auf der Oberseite des Körpers) und Druckholz (auf der Unterseite Seite des Körpers). Die Rinde ist von den Extremitäten, wie oben beschrieben getrennt, außer dass nur die Rinde für jede Art von Reaktion Holz ist auf einmal entfernt. Sekundäre Xylem oder Phloem wird dann gesammelt, wie oben beschrieben und in flüssigem Stickstoff.
7. Andere Proben, wie Nadeln, Triebspitzen und jungen Zapfen, von Hand geerntet werden oder mit einer Gartenschere nach Bedarf.
8. Gesammelten Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren werden sollten, in gekennzeichneten Säcken oder geeigneten Behältern platziert werden und verpackt in Trockeneis für den Versand ins Labor.

Teil 2: Freezer Mühle Bearbeitung der Proben

1. Füllen Sie die Spex 6850 Gefrierschrank Mühle Behälter mit flüssigem Stickstoff und stellen die Auswirkungen bar in einer der Schleifen Fläschchen füllen und mit flüssigem Stickstoff vor Kälte. Abgießen flüssigem Stickstoff und fügen Probe Durchstechflasche.
2. Stellen Sie sicher, dass keine überschüssige Flüssigkeit Stickstoff in die Mahlkammer bleibt und dass übermäßige Stickstoff-Gas wird vollständig entlüftet, bevor die Endkappe sitzt, um die Kammer zu versiegeln.
3. Legen Sie die Schleifen Fläschchen in den Träger und zu schließen.
4. Mühle holzige Proben für zwei Zyklen von 1 Minute / Zyklus bei einer Rate-Einstellung von 14 Jahren.
5. Verwenden Sie ein flüssigem Stickstoff gekühlt Spachtel auf die gemahlenen Probe (Holzmehl) in ein Becherglas, die vorgekühlte hat und enthält eine geringe Menge von flüssigem Stickstoff zu entfernen.
6. Gießen Sie den flüssigen Stickstoff / Probe Gülle in einen Vorratsbehälter und Ort bei -80 ° C bis zum Gebrauch.

Teil 3: RNA Isolation, Tag 1

1. Legen Sie 20ml der RNA-Isolierung Buffer in ein 50 mL Falcon-Röhrchen verschlossen und fügen 400 ul β-Mercaptoethanol, kurz vortexen, dann Wärme in einem 60 ° C Wasserbad.
2. 4 g gefrorene Gewebe in jedes Röhrchen. Cap und kräftig schütteln mit der Hand durch Vortexen für 10 Sekunden an.
3. Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform auf das Rohr und drehen vorsichtig zu mischen. Das Röhrchen wird auf einem rotierenden Rad und lassen end-over-end Mischen für 5 Minuten.
4. Dekantieren die Mischung in eine 50 ml Oak Ridge Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 (17.200 xg) rpm in einem SS34-Festwinkelrotor für 5 Minuten.
5. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Oak Ridge Röhrchen und fügen Sie einen halben Volumen Chloroform.
6. Vortex für 1 Minute und fahren Mischen auf einem rotierenden Rad für 5 Minuten. Zentrifuge bei 12.000 rpm (17.200 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 5 Minuten.
7. Transfer der wässrigen Phase an die frische Oak Ridge Röhrchen und fügen Sie einen halben Volumen Chloroform. Vortex für 1 Minute. Zentrifuge bei 12.000 rpm (17.200 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 10 Minuten.
8. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein 50 mL High-Speed-Polypropylen-Röhrchen. Zentrifuge bei 10.000 rpm (11900 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 20 Minuten.
9. Dekantieren Überstand in 50 ml Falcon-Röhrchen und fügen Sie einen Viertel-Volumen 10 M LiCl Lösung Überstand. Kurz vortexen und bei 4 ° C über Nacht Niederschlag.

Teil 4: RNA Isolation, Tag 2

1. Hitze SSTE Puffer in einem 65 ° C Wasserbad vor dem Start.
2. Gießen Sie die LiCl-gefällte Probe in ein Polypropylenröhrchen und Pellet die RNA durch Zentrifugation bei 11.000 rpm in einem SS34 Festwinkelrotor (14.450 xg) für 30 Minuten bei 4 ° C.
3. Nach der Zentrifugationabgießen und entsorgen Sie die Flüssigkeit und drehen Sie die Rohre auf Kimwipes für ca. 1 Minute. Pipette Sie verbleibende Überstand.
4. Resuspendieren jedes Pellet in 800 ul von beheizten SSTE mit einer Pipette zu durchmischen die Proben. Übertragen Sie die resuspendierten Probe 2 mL Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Wärme-Proben bei 65 ° C für 2 Minuten durch kräftiges Vortexen gefolgt, um eine komplette Resuspension zu gewährleisten.
6. Fügen Sie dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform, pH 8, zu jeder Probe Röhre. Vortex jede Probe für 30 Sekunden und dann in einer Mikrozentrifuge Spin bei 14.000 rpm für 3 Minuten
7. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues 2-ml-Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform. Vortex jede Probe für 30 Sekunden und Spin in die Mikrozentrifuge bei 14.000 rpm für 3 Minuten.
8. Transfer wässrigen Phase zu Phase-Lock Gel Röhrchen, die zuvor durch microfuging bei 11.000 rpm für 2 Minuten vorbereitet. Fügen Sie einen halben Volumen Chloroform und sanft Pipette zu mischen.
9. Zentrifuge bei 11.000 rpm für 5 Minuten und den Transfer der wässrigen Phase an die frische 2ml Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen.

Teil 5: RNA Fällung und Ethanol waschen

1. Dann werden 50 ul 3,0 M Natriumacetat, pH 4,8 und 1 mL 100% Ethanol in die wässrige Phase. Vortex und Niederschlag in -80 ° C für 30 Minuten oder über Nacht bei -20 ° C.
2. Microfuge Proben bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, und sorgfältig absaugen des Überstandes. Bitte nicht stören das Pellet.
3. Waschen Sie die RNA-Pellets mit 1 ml -20 ° C 70% (v / v) Ethanol. Microfuge bei 14.000 rpm für 1 Minute und absaugen des Ethanols.
4. Wiederholen Sie Schritt 5.3.
5. Uncap den Rohren und an der Luft trocknen Pellets auf der Bank für 3-5 Minuten.

Teil 6: Final Resuspension und Quantifizierung

1. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul DEPC-behandeltem Wasser. Durch Vortexen mischen und die Röhrchen bei 65 ° C für 2 Minuten, bevor Sie auf dem Eis. Wiederholen Sie, wenn nötig, Probe Resuspension zu gewährleisten.
2. Pool wie Proben, falls gewünscht und machen 50 ul einer 1:10-Verdünnung in 10 mM Tris, pH 7,5, für die spektrophotometrische Quantifizierung. Die Absorption Verhältnisse für 260/280 und 260/230 sind in der Regel größer als 2,1 und 2,2 bzw.. RNA-Isolierung Erträge reichen von 60-120μg / g gefrorene Gewebe.
3. Analysieren Sie die Proben durch Ausführen von 1,5-2,5 pg RNA auf einem 1% Agarosegel in TAE-Puffer. Weitere kritische Proben, analysieren die RNA mit Hilfe eines Agilent 2100 Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Repräsentative Ergebnisse:

RNA-Isolierung Erträge aus verschiedenen Geweben Nadelbaum Bereich von 60 bis 120 pg / g gefrorene Gewebe mit holzigen Proben typischerweise Nachgeben rund 70-80g / g gefrorene Gewebe. Diagnostic-Verhältnisse von 260/280 und 260/230 sind beide in der Regel größer als 2,1, und sind gute Indikatoren, dass die RNA-Probe frei von signifikanten Phenol-oder Kohlenhydrat-Kontamination ist, bzw.. Proben durch Agarosegelelektrophorese durch EtBr-Färbung analysiert werden sollten zeigen drei verschiedene Bands für 25S, 18S und 5S RNA (Abbildung 1). Die Bestimmung der Stöchiometrie der 28S bis 18S auf Agarosegelen ist etwas subjektiv, und Faktoren wie läuft die Bedingungen für das Gel, Färbung und Muster laden können alle eine Wirkung haben. Im Allgemeinen ist die 28S: 18S-Verhältnis erscheint auf> 1,5 sein. Allerdings haben einige Koniferen Proben niedrigere Werte. Zum Beispiel folgende Agilent 2100 Analyse haben wir mehrere Instanzen von Nadelbaum-Proben aus verschiedenen Gewebetypen, wo die Stöchiometrie ist näher an 1.2:1 gesehen. So kann eine scheinbar geringen 28S: 18S hat Stöchiometrie durch Agarosegelelektrophorese nicht unbedingt auf eine schlechte Qualität der Probe. Leaf, schießen und Kegel Proben werden oft zusätzliche deutliche Banden durch chloroplastidäre ribosomalen RNAs. EtBr-gefärbten Materialien, die nicht aus der Probe gut oder hochmolekularen Banden (> 8-10 kb) Sie wandern in der Regel zeigen, genomische DNA-Kontaminationen (Abbildung 2). Niedermolekulare Abstriche in der Nähe oder unterhalb der 5S-Band und reduziert ribosomalen Band Färbung oder eine scheinbare 18S> 28S Stöchiometrie ist ein guter Indikator, dass RNA-Abbau stattgefunden hat (Abbildung 3). In der Agilent 2100 Elektropherogramm Analyse der Basislinie sollte gering sein und relativ glatt mit großen Peaks, die 18S und 28S ribosomalen RNAs mit 28S: 18S-Verhältnisse im Bereich irgendwo von 1,2 bis 2,0. Die Agilent RNA Integrity Number (RIN)-Wert kann eine bessere Prognosekraft RNA Qualität sein und sollte mindestens 7 oder höher für RNA, die für die Herstellung von Microarrays Ziele verwendet werden soll. Abbildung 4 zeigt ein typisches Agilent 2100 Elektropherogramm für Xylem-RNA mit einer 28S: 18S-Verhältnis gleich 1,4 und eine RIN-Wert von 8,6, während Abbildung 5 zeigt eine schlechte Xylem RNA prep mit einem sehr hohen Ausgangswert und merkliche Verschlechterung durch den 28S offenbart: 18S ratio gleich 0,65 und eine RIN-Wert von 3,4.

Abbildung 1. Agarose-Gel-Analyse von hochwertigem Kiefernholz RNA. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Spur 2 zeigt eine typische Gesamt-RNA isoliert von loblolly Kiefer sekundäre Xylem mit charakteristischen ribosomalen 28S, 18S und 5S Bands und scheinbare 28S: 18S-Verhältnis> 1 ist.

Abbildung 2. Agarose-Gel-Analyse von Kiefern-RNA-Probe mit genomischer DNA kontaminiert. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Spur 2, Xylem RNA-Probe zeigt genomische DNA-Kontaminationen.

Abbildung 3. Agarose-Gel-Analyse von Kiefern-Probe zeigt RNA-Abbaus und Kontamination mit genomischer DNA. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Lane2, Xylem RNA-Probe zeigt genomische DNA Kontamination und schwere RNA-Abbaus.

Abbildung 4. Agilent 2100 Elektropherogramm Xylem Gesamt-RNA isoliert mit dem beschriebenen Verfahren auf loblolly Kiefer Xylem. 28S: 18S-Verhältnis gleich 1,4, entspricht RIN-Wert 8,6

Abbildung 5. Agilent 2100 Elektropherogramm apikalen Spitze der Gesamt-RNA mit schweren Abbau und genomische Kontamination. 28S: 18S-Verhältnis ist gleich 0,65, entspricht RIN Wert 3.4

Discussion

Die Beschaffung qualitativ hochwertiger RNA aus Nadelbaumarten kann eine schwierige Aufgabe angesichts der hohen Phenol-und Polysaccharid-Verbindungen in holzigen Gewebe gefunden werden. Beginnend mit dem Protokoll, das von Chang et al. (1), haben wir, dass strengere Extraktion gefunden und bereinigen Stufen führen auf die konsequente Trennung von sehr hoher Qualität Gesamt-RNA aus verschiedenen holzigen und nicht verholzte Gewebe von einer Vielzahl von Nadelbaumarten abgetastet. Dieses Video hat nicht nur unsere modifizierte RNA-Isolierung-Protokoll, sondern auch die Schritte in Bereich Erfassung und Verarbeitung Techniken für loblolly Kiefer vor der Isolierung RNA verwendet genommen demonstriert. Diese Ernte und Aufbereitung Schritte sind ebenso wichtig, RNA-Abbau im Feld-gesammelten Proben zu minimieren, sowie die beiden RNA-Qualität und Gesamtertrag zu erhöhen. Am wichtigsten ist, haben wir festgestellt, dass RNA mit dieser Methode hat zu einer erhöhten cDNA-Synthese liefert im Vergleich zu anderen Methoden zur Mikroarray-Ziele für die Hybridisierung gegen die PtGen2 loblolly Kiefer-Microarray (2) vorzubereiten vorbereitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425