Une méthode améliorée d'isolement d'ARN à partir de pin taeda ( P. taeda L.) et d'autres conifères

Summary

Beaucoup de tissus végétaux, y compris le phloème et le xylème de pin à encens (

Abstract

Tissus isolés à partir d'espèces de conifères, en particulier celles appartenant à la famille des Pinacées, comme le pin taeda (

Protocol

Partie 1: Récolte d'arbres

Après que l'arbre est sélectionné et abattu, il est important de travailler avec autant de soin et aussi rapidement que possible. Comme chaque type de tissu différent est récolté, ils doivent être placés immédiatement dans leurs propres vaisseaux azote liquide pour éviter toute contamination croisée du matériel d'échantillonnage. Ce protocole d'isolement d'ARN est évolutive.

1. Couper les boulons en longueurs d'environ 0,5 à 0,75 m et avec un score de tronçonneuse de l'écorce de deux ou trois places suivant l'axe longitudinal du boulon.
2. L'utilisation d'un ciseau à bois, le travail du bord de la région a marqué jusqu'à l'écorce commence à se séparer du bois et de continuer à travailler au ciseau tout en tirant sur la section de l'écorce jusqu'à ce qu'elle se sépare complètement de la tige.
3. Xylème secondaire est récolté avec un bord, droit de rasoir simple face en grattant le long de l'axe longitudinal de la culasse qui a été débarrassé de son écorce. Porter des gants en latex pour minimiser la contamination des tissus.
4. Phloème, qui est situé sur le côté intérieur des sections écorce, est facilement récoltés par pelage manuel.
5. Bois de réaction sont collectées à partir du dessous de membres après leur marquage avec la peinture en aérosol pour indiquer leur orientation d'origine par rapport au sol.
6. Les membres sont coupés en des boulons de 1-2 m et a marqué sur les côtés opposés sur l'axe longitudinal selon les emplacements approximatifs des deux types de bois de réaction: le bois en face (sur le côté haut de la jambe) et le bois de compression (sur le fond côté de la jambe). L'écorce est séparée de la branche comme décrit ci-dessus, sauf que seule l'écorce qui couvre chaque type de bois de réaction est enlevée en même temps. Xylème secondaire ou phloème est alors recueilli comme décrit ci-dessus et placés dans l'azote liquide.
7. D'autres échantillons, comme des aiguilles, des pousses et des cônes de jeunes, peuvent être récoltées à la main ou en utilisant un sécateur, au besoin.
8. Échantillons prélevés congelés dans l'azote liquide doivent être placés dans des sacs marqués ou des conteneurs appropriés et emballés dans de la glace sèche pour le transfert vers le laboratoire.

Partie 2: Traitement des échantillons Mill Congélateur

1. Remplir le réservoir de moulin à Spex 6850 congélateur avec l'azote liquide et placer la barre d'impact dans l'un des flacons de rectification et de remplir avec de l'azote liquide à pré-refroidir. Décanter l'azote liquide et ajouter de l'échantillon au flacon.
2. Assurez-vous qu'aucun excès d'azote liquide dans la chambre de broyage et de gaz excès d'azote est complètement purgée avant que le bouchon est assis pour sceller la chambre.
3. Insérer le tube dans le support de meulage et de fermer.
4. Échantillons boisée Mill pour deux cycles de 1 minute / cycle à une fixation des taux de 14.
5. Utilisez une spatule azote liquide réfrigéré à retirer l'échantillon broyé (farine de bois) dans un bécher qui a été pré-réfrigérés et contient une petite quantité d'azote liquide.
6. Verser le liquide d'azote / échantillon bouillie dans un récipient de stockage et le lieu à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

Partie 3: RNA, Jour 1

1. Placer 20 ml de tampon d'isolement d'ARN dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter plafonné 400 ul β-mercaptoéthanol, vortex brièvement, puis la chaleur dans un bain d'eau à 60 ° C.
2. Ajouter 4 g de tissus congelés dans chaque tube. Cap et agiter vigoureusement à la main suivie par vortex pendant 10 secondes.
3. Ajouter un volume égal de chloroforme sur le tube et inverser doucement pour mélanger. Placer le tube sur une roue tournante et permettre bout en bout au cours de mélange pendant 5 minutes.
4. Décanter le mélange dans un tube de 50 ml d'Oak Ridge et centrifuger à 12 000 (17 200 xg) tpm dans un SS34 rotor angulaire pendant 5 minutes.
5. Transférer la phase aqueuse dans un tube à Oak Ridge fraîche et ajouter un demi-volume de chloroforme.
6. Vortex pendant 1 minute et continuer à mélanger sur une roue en rotation pendant 5 minutes. Centrifuger à 12000 rpm (17 200 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 5 minutes.
7. Transférer la phase aqueuse au tube Ridge frais de chêne et d'ajouter un demi-volume de chloroforme. Vortex pendant 1 minute. Centrifuger à 12000 rpm (17 200 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 10 minutes.
8. Transférer la phase aqueuse à une vitesse de 50 ml tube en polypropylène haute. Centrifuger à 10000 rpm (11 900 xg) dans un rotor SS34 angle fixe pendant 20 minutes.
9. Décanter le surnageant dans 50 mL Falcon tube et ajouter un quart de volume de 10 M LiCl solution surnageante. Brièvement au vortex et placer à 4 ° C pour les précipitations durant la nuit.

Partie 4: RNA, Jour 2

1. Buffer SSTE Chauffer au bain à 65 ° C l'eau avant de commencer.
2. Verser l'échantillon LiCl-précipité dans un tube en polypropylène et un culot d'ARN par centrifugation à 11000 rpm dans un rotor SS34 angle fixe (14 450 xg) pendant 30 minutes à 4 ° C.
3. Après centrifugation,égoutter et jeter le liquide, et inverser les tubes sur Kimwipes pendant environ 1 minute. Pipeter hors tout surnageant restant.
4. Resuspendre chaque pastille dans 800 ul de SSTE chauffée à l'aide d'une pipette pour bien mélanger les échantillons. Transférer l'échantillon remis en suspension à 2 mL tubes Ambion microcentrifugeuse RNAse free.
5. Échantillons de chaleur à 65 ° C pendant 2 minutes, suivi par vortex vigoureuses pour assurer la remise en suspension complète.
6. Ajouter un volume égal de phénol-chloroforme, pH8, dans chaque tube échantillon. Vortex chaque échantillon pendant 30 secondes puis de spin dans une microcentrifugeuse à 14 000 rpm pendant 3 minutes
7. Transférer la phase aqueuse à un nouveaux tubes de 2mL Ambion microcentrifugeuse RNAse free, et ajouter un volume égal de chloroforme. Vortex chaque échantillon pendant 30 secondes et de spin dans la microcentrifugeuse à 14 000 rpm pendant 3 minutes.
8. Transfert phase aqueuse pour des tubes de gel de verrouillage de phase qui ont été préalablement préparé par microfuging à 11.000 tours par minute pendant 2 minutes. Ajouter un demi-volume de chloroforme et doucement la pipette pour mélanger.
9. Centrifuger à 11000 rpm pendant 5 minutes et le transfert de la phase aqueuse pour frais 2mL tubes Ambion microcentrifugeuse RNAse free.

Partie 5: ARN précipitation et lavage à l'éthanol

1. Ajouter 50 uL d'acétate de sodium 3,0 M, pH 4,8, et 1 ml d'éthanol à 100% à la phase aqueuse. Vortex et précipité dans -80 ° C pendant 30 minutes ou toute la nuit à -20 ° C.
2. Échantillons microcentrifugeuse à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, et aspirer délicatement le surnageant. Ne pas perturber le culot.
3. Laver les culots d'ARN avec 1 ml à -20 ° C à 70% (v / v) d'éthanol. Microcentrifugeuse à 14000 rpm pendant 1 minute et aspirer de l'éthanol.
4. Répétez l'étape 5.3.
5. Débouchez les tubes et les sécher à l'air boulettes sur le banc pendant 3-5 minutes.

Partie 6: remise en suspension définitive et quantification

1. Resuspendre chaque pastille dans 100 ul DEPC eau traitée. Mélanger au vortex et incuber les tubes à 65 ° C pendant 2 minutes avant de placer sur la glace. Répétez si nécessaire pour assurer la remise en suspension de l'échantillon.
2. Piscine comme des échantillons si désiré et faire 50 uL d'une dilution 1:10 dans 10 mM Tris, pH 7,5, pour la quantification par spectrophotométrie. Ratios d'absorbance pour 260/280 et 260/230 sont généralement supérieures à 2,1 et 2,2, respectivement. Isolement d'ARN rendements varient de 60-120μg / g de tissu congelé.
3. Analyser les échantillons en exécutant 1.5 à 2.5 ug d'ARN sur un gel d'agarose 1% en tampon TAE. Pour des échantillons plus critique, d'analyser l'ARN en utilisant une bioanalyseur Agilent 2100 selon les instructions du fabricant.

Les résultats représentatifs:

Rendements d'isolement d'ARN à partir de conifères tissus gamme différente de 60 à 120 g / g de tissu congelé des échantillons boisée typique rendement autour de 70-80g / g de tissu congelé. Diagnostic des ratios 260/280 et 260/230 sont à la fois typiquement supérieur à 2,1, et sont de bons indicateurs que l'échantillon d'ARN est libre de toute contamination importante ou phénoliques glucides, respectivement. Les échantillons analysés par électrophorèse sur gel agarose suivie d'une coloration EtBr doit montrer trois bandes distinctes pour les 25S, 18S et 5S ARN (figure 1). Détermination de la stoechiométrie de la 28S à 18S sur gels d'agarose est quelque peu subjective, et des facteurs tels que la course des conditions pour le gel, la coloration, et de charger tous les échantillons peuvent avoir un effet. En général, la 28S: 18S rapport apparaîtra à> 1,5. Cependant, certains échantillons de conifères ont des ratios plus faibles. Par exemple, après 2100 d'Agilent analyse, nous avons vu plusieurs cas d'échantillons de conifère de différents types de tissus où la stoechiométrie est plus proche de 1,2:1. Ainsi, une apparente 28S faible: 18S stoechiométrie par électrophorèse sur gel n'indique pas nécessairement un échantillon de mauvaise qualité. Leaf, tirer, et des échantillons de cône sera souvent d'autres bandes distinctes présentes en raison de chloroplastiques ARN ribosomal. EtBr tachés de matériaux qui ne migrent pas à partir de l'échantillon bien ou haute des bandes de masse moléculaire (> 8-10 ko) indiquent généralement la contamination d'ADN génomique (figure 2). Faible frottis masse moléculaire dans le voisinage ou au-dessous la bande 5S et réduit la bande coloration ribosomal 18S ou une apparente> 28S stoechiométrie est un bon indicateur que la dégradation des ARN s'est produite (figure 3). Dans l'analyse Agilent électrophérogramme 2100, la ligne de base doit être faible et relativement lisse avec des pics importants correspondant aux ARN 18S et 28S ribosomal 28S avoir: ratios 18S allant partout de 1,2 à 2,0. Le numéro d'Agilent intégrité de l'ARN (RIN) de valeur peut être un meilleur prédicteur de la qualité de l'ARN et devrait être d'au moins 7 ou plus pour les ARN qui doit être utilisé pour la préparation des cibles de biopuces. La figure 4 montre un typique Agilent 2100 électrophérogramme pour l'ARN 28S du xylème avec un: rapport 18S égal à 1,4 et une valeur du RIN de 8,6 tandis que la figure 5 montre un xylème mauvaise préparation de l'ARN ayant une base de référence très élevée et la dégradation notable révélée par le 28S: 18S raégal à 0,65 et une valeur du RIN de 3,4 TiO.

Figure 1. Analyse sur gel d'agarose de l'ARN de pin de haute qualité. Voie 1, l'ONE 1 kb standard, Lane 2 montre un typique isolement total d'ARN à partir du xylème secondaire, pin blanc avec une caractéristique ribosomal 28S, 18S et 5S bandes et apparente 28S: 18S Ratio> 1.

Figure 2. Analyse sur gel d'agarose des pins échantillon d'ARN contaminés avec de l'ADN génomique. Voie 1, l'ONE 1 kb standard, la voie 2, le xylème échantillon d'ARN montrant la contamination d'ADN génomique.

Figure 3. Analyses gel d'agarose des échantillons de pin montrant la dégradation de l'ARN et la contamination par l'ADN génomique. Voie 1, l'ONE 1 kb standard, Lane2, xylème échantillon d'ARN montrant la contamination d'ADN génomique et une grave dégradation de l'ARN.

Figure 4. Agilent 2100 électrophérogramme de l'ARN total isolé à l'aide du xylème de la méthode décrite sur le xylème de pin à encens. 28S: 18S taux est égal à 1,4, la valeur est égale à 8,6 RIN

Figure 5. Agilent 2100 électrophérogramme d'ARN pointe apicale totale montrant sévère dégradation et la contamination génomique. 28S: 18S taux est égal à 0,65, la valeur du RIN représente 3,4

Discussion

Obtention de haute qualité d'ARN à partir des espèces de conifères peut être une tâche difficile étant donné les niveaux élevés de composés phénoliques et des polysaccharides présents dans les tissus ligneux. En commençant par le protocole développé par Chang et al. (1), nous avons constaté que l'extraction de plus de rigueur et de nettoyer marches mènent à l'isolement cohérente de très haute qualité d'ARN total de Woody diverses et non ligneuses des tissus prélevés sur une grande variété d'espèces de conifères. Cette vidéo a démontré non seulement notre protocole modifié d'isolement d'ARN, mais aussi les mesures prises dans la collecte de terrain et des techniques de transformation utilisées pour le pin taeda avant isolement de l'ARN. Ces étapes de récolte et de préparation sont également importants pour minimiser la dégradation d'ARN dans des échantillons prélevés sur le terrain, ainsi que d'augmenter à la fois la qualité de l'ARN et le rendement total. Plus important encore, nous avons constaté que l'ARN préparés en utilisant cette méthode a conduit à une augmentation des rendements de synthèse d'ADNc par rapport aux autres méthodes utilisées pour préparer des cibles puces d'hybridation contre l'encens de pin PtGen2 puces (2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425