Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

Summary

Muitos tecidos vegetais, incluindo floema e xilema do pinheiro (

Abstract

Tecidos isolados de espécies de coníferas, particularmente aqueles que pertencem à família Pinaceae, como o pinus taeda (

Protocol

Parte 1: Colheita Árvore

Depois que a árvore é selecionada e cortada, é importante trabalhar com o mesmo cuidado e tão rapidamente quanto possível. Como cada tipo de tecido diferente é colhida, devem ser colocados imediatamente em suas próprias embarcações nitrogênio líquido para evitar a contaminação cruzada de material da amostra. Este protocolo de isolamento do RNA é escalável.

1. Cortar os parafusos em comprimentos de cerca de 0,5-0,75 m e com uma pontuação motosserra a casca em duas ou três lugares seguintes do eixo longitudinal do parafuso.
2. Utilizando um cinzel de madeira, o trabalho da borda da região marcou até a casca começa a se separar da madeira e continuar a trabalhar o cinzel enquanto puxa para trás na seção de casca até que ela se separa da haste.
3. Xilema secundário é colhida com uma navalha reta de ponta, de lado único raspando ao longo do eixo longitudinal do parafuso que tem sido descascada. Usar luvas de látex para minimizar a contaminação do tecido.
4. Floema, que está localizado na parte interna das seções de casca, é prontamente colhidas pelo manual peeling.
5. Madeira de reação é coletado do lado de membros após marcando-as com tinta spray para indicar sua orientação original com respeito no chão.
6. Membros são cortados em parafusos de m 1-2 e marcou em lados opostos ao longo do eixo longitudinal de acordo com as localizações aproximadas dos dois tipos de madeira de reação: madeira oposto (no lado superior do membro) e madeira de compressão (no fundo lado do membro). A casca é separada do membro, como descrito acima, exceto que apenas a casca que cobre cada tipo de madeira de reação é removida de uma vez. Xilema secundário ou floema é, então, coletadas como descrito acima e colocada em nitrogênio líquido.
7. Outras amostras, como agulhas, brotos e cones jovens, podem ser colhidas à mão ou usando tesouras de poda, conforme necessário.
8. Amostras coletadas congeladas em nitrogênio líquido deve ser colocado em sacos ou recipientes adequados marcados e embalados em gelo seco para a expedição para o laboratório.

Parte 2: Processamento Freezer Moinho de Amostras

1. Encha o reservatório de moinho Spex 6850 freezer com nitrogênio líquido e coloque a barra de impacto em um dos frascos de moagem e preencher com nitrogênio líquido para chill-pre. Deitar fora nitrogênio líquido e adicione a amostra para o frasco.
2. Certifique-se de que nenhum excesso de nitrogênio líquido permanece na câmara de moagem e que o gás nitrogênio em excesso é completamente liberada antes da tampa está sentado para selar a câmara.
3. Insira o frasco de moagem para a transportadora e fechar.
4. Amostras woody moinho para dois ciclos de 1 minuto / ciclo à definição da taxa de 14.
5. Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para retirar a amostra moída (farinha de madeira) em um copo que foi pré-refrigerados e contém uma pequena quantidade de nitrogênio líquido.
6. Despeje a polpa de nitrogênio / amostra de líquido em um recipiente de armazenamento e coloque a -80 ° C até ser necessário.

Parte 3: RNA Isolation, Dia 1

1. Coloque 20 mL de RNA do buffer de isolamento em um tubo Falcon 50 ml nivelado e acrescentar 400 brevemente β-mercaptoetanol vortex, mL, então o calor em banho-maria a 60 ° C.
2. Adicionar 4 g de tecido congelado a cada tubo. Tampa e agitar vigorosamente à mão seguido por vórtex por 10 segundos.
3. Adicionar um volume igual de clorofórmio para o tubo e inverter suavemente para misturar. Colocar o tubo em uma roda giratória e permitir end-over-end mistura por 5 minutos.
4. Decantar a mistura em um tubo de 50 mL de Ridge Oak e centrifugar a 12.000 (17.200 xg) rpm em um SS34 rotor de ângulo fixo por 5 minutos.
5. Transferir a fase aquosa para um novo tubo Oak Ridge e adicionar uma metade do volume de clorofórmio.
6. Vortex por 1 minuto e continue misturando em uma roda giratória por 5 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm (17,200 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 5 minutos.
7. Transferir a fase aquosa para novo tubo de Oak Ridge e adicionar uma metade do volume de clorofórmio. Vortex por 1 minuto. Centrifugar a 12.000 rpm (17,200 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 10 minutos.
8. Transferir a fase aquosa para um tubo de 50 mL de polipropileno de alta velocidade. Centrifugar a 10.000 rpm (11,900 xg) em um ângulo de rotor SS34 fixo por 20 minutos.
9. Decantar o sobrenadante do tubo Falcon em 50 mL e adicionar um quarto volume 10 M solução de LiCl para sobrenadante. Brevemente vortex e colocar a 4 ° C para a precipitação durante a noite.

Parte 4: RNA Isolation, Dia 2

1. Buffer de calor SSTE em um banho de água 65 ° C antes de iniciar.
2. Verter a amostra LiCl-precipitado em um tubo de polipropileno eo pellet de RNA por centrifugação a 11.000 rpm em um ângulo de rotor SS34 fixo (14.450 xg) por 30 minutos a 4 ° C.
3. Após a centrifugação,Deitar fora e descartar o líquido, e inverter os tubos em Kimwipes por aproximadamente 1 minuto. Pipeta de desconto em qualquer sobrenadante restante.
4. Ressuspender cada pellet em 800 mL de SSTE aquecido utilizando uma pipeta para misturar as amostras. Transferir a amostra em suspensão para tubos de 2 mL Ambion RNAse-free microcentrífuga.
5. Amostras de calor a 65 ° C por 2 minutos seguido por vórtex vigoroso para garantir a ressuspensão completa.
6. Adicionar um volume igual de fenol-clorofórmio, PH8, a cada tubo de amostra. Vortex cada amostra por 30 segundos e em seguida, girar em uma microcentrífuga a 14.000 rpm por 3 minutos
7. Transferir a fase aquosa para um novo Ambion 2mL tubos de microcentrífuga RNAse-free, e adicionar um volume igual de clorofórmio. Vortex cada amostra por 30 segundos e girar na microcentrífuga a 14.000 rpm por 3 minutos.
8. Transferência de fase aquosa para tubos Phase Lock-Gel que tenham sido previamente preparado por microfuging a 11.000 rpm por 2 minutos. Adicionar uma metade do volume de clorofórmio e gentilmente pipeta para misturar.
9. Centrifugar a 11.000 rpm por 5 minutos e transferir a fase aquosa para novo 2mL Ambion tubos de microcentrífuga RNAse-free.

Parte 5: Precipitação e RNA Wash Etanol

1. Adicionar 50 mL de acetato de sódio 3,0 M, pH 4,8, e 1 mL de etanol a 100% para a fase aquosa. Vortex e precipitado em -80 ° C por 30 minutos ou durante a noite a -20 ° C.
2. Amostras de microcentrífuga a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, e aspirar cuidadosamente fora do sobrenadante. Não perturbar o pellet.
3. Lavar os pellets de RNA com 1 mL de etanol -20 ° C a 70% (v / v). Microcentrífuga a 14.000 rpm por 1 minuto e aspirado de fora o etanol.
4. Repita o passo 5.3.
5. Destampe a tubos e ar seco pellets no banco por 3-5 minutos.

Parte 6: ressuspensão final e Quantificação

1. Ressuspender cada pellet em 100 de água DEPC tratados mL. Misturar em vortex e incubar os tubos a 65 ° C por 2 minutos antes de colocar no gelo. Repita se necessário para garantir a ressuspensão da amostra.
2. Piscina como amostras, se desejar e fazer 50 mL de uma diluição de 1:10 em 10 mM Tris, pH 7,5, para a quantificação espectrofotométrica. Razão de absorvância para 260/280 e 260/230 são normalmente maiores do que 2,1 e 2,2, respectivamente. Isolamento do RNA rendimento varia de 60-120μg / g de tecido congelado.
3. Analisar amostras executando 1,5-2,5 mg RNA em um gel de agarose 1% em tampão TAE. Para mais amostras críticas, analisar o RNA usando um Agilent 2100 Bioanalyzer conforme instruções do fabricante.

Resultados representativos:

Rendimentos de isolamento de RNA de diferentes tecidos de coníferas faixa 60-120 mg / g tecido congelado com amostras woody normalmente produzindo em torno de 70-80g / g de tecido congelado. Índices de diagnóstico de 260/280 e 260/230 são normalmente maiores do que 2.1, e são bons indicadores de que a amostra de RNA é livre de qualquer contaminação ou fenólicos significativa de carboidratos, respectivamente. Amostras analisadas por eletroforese em gel de agarose corado pela EtBr deve mostrar três bandas distintas para 25S, 18S e RNA 5S (Figura 1). Determinar a estequiometria da 28S a 18S em gel de agarose é um tanto subjetiva, e fatores como a execução de condições para o gel, a coloração, ea carga de amostra podem ter um efeito. Em geral, o 28S: 18S relação parecerá ser> 1,5. No entanto, algumas amostras de coníferas têm índices mais baixos. Por exemplo, após análise Agilent 2100 vimos vários casos de amostras de coníferas de diferentes tipos de tecidos, onde a estequiometria está mais perto de 1,2:1. Assim, uma aparente baixa 28S: 18S estequiometria por eletroforese em gel de agarose não indica necessariamente uma amostra de má qualidade. Folha, atirar, e amostras de cone, muitas vezes, têm adicional bandas distintas presente devido à chloroplastic RNAs ribossomais. EtBr manchada de materiais que não migram a partir da amostra bem ou bandas de alta massa molecular (> 80-10 kb) geralmente indicam a contaminação do DNA genômico (Figura 2). Baixo peso molecular manchas massa nas proximidades ou abaixo da banda de 5S e coloração banda reduzida ribossomal 18S ou um aparente> estequiometria 28S é um bom indicador de que o RNA degradação ocorreu (Figura 3). Na análise electrofograma Agilent 2100, a linha de base deve ser baixa e relativamente suave, com grandes picos correspondentes a 18S e 28S ribossomal ter RNAs 28S: 18S proporções que variam 1,2-2,0. A Agilent Número Integrity RNA (RIN) valor pode ser um melhor indicador de qualidade de RNA e deve ser pelo menos 7 ou superior para RNA que está a ser utilizado para a preparação de alvos microarray. A Figura 4 mostra uma típica Agilent 2100 electroferograma de RNA xilema com uma 28S: 18S proporção igual a 1,4 e um valor RIN de 8,6 enquanto a Figura 5 mostra um xilema pobres RNA prep ter uma linha de base muito alta e degradação perceptível como revelado pela 28S: 18S ratio igual a 0,65 e um valor de 3,4 RIN.

Figura 1. Gel Agarose análise de RNA de alta qualidade de pinho. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane 2 mostra um típico isolamento do RNA total de xilema secundário com pinheiros loblolly característica 28S ribossomal, 18S, 5S e 28S bandas e aparente: a relação 18S> 1.

Figura 2. Gel Agarose análise da amostra de RNA de pinheiros contaminadas com DNA genômico. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane 2, amostra de RNA xilema mostrando a contaminação do DNA genômico.

Figura 3. Gel Agarose análise de amostra de pinheiro mostrando RNA degradação e contaminação com DNA genômico. Raia 1, NEB 1 kb padrão, Lane2, amostra xilema RNA mostrando a contaminação e degradação do DNA genômico RNA grave.

Figura 4. Agilent electrofograma 2100 de RNA total xilema isolados utilizando o método descrito no xilema mudas de pinus. 28S: 18S é igual a relação de 1,4, valor igual a 8,6 RIN

Figura 5. Agilent 2100 electroferograma de RNA total de ponta apical mostrando severa degradação e contaminação genômica. 28S: 18S é igual a relação de 0,65, valor igual a 3,4 RIN

Discussion

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de espécies de coníferas pode ser uma tarefa difícil, dado os altos níveis de compostos fenólicos e polissacarídeos encontrados em tecidos lenhosos. Começando com o protocolo desenvolvido por Chang et al. (1), descobrimos que a extração de mais rigoroso e limpar passos conduzem ao isolamento consistente de muito alta qualidade RNA total do woody woody vários e não-tecidos amostrados de uma grande variedade de espécies de coníferas. Este vídeo tem demonstrado não só a nossa modificada protocolo de isolamento do RNA, mas também as medidas tomadas na coleta de campo e técnicas utilizadas para o pinheiro antes de RNA isolamento. Estas etapas de colheita e preparação são igualmente importantes para minimizar a degradação do RNA no campo de coleta de amostras, bem como para aumentar a qualidade e rendimento de RNA total. Mais significativamente, descobrimos que o RNA preparados usando este método levou ao aumento do rendimento de síntese de cDNA em comparação com outros métodos utilizados para preparar metas de microarray para a hibridização contra o PtGen2 loblolly pinheiros microarray (2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425