Un método mejorado para el aislamiento de ARN a partir de pino taeda ( P. taeda L.) y otras especies de coníferas

Summary

Muchos tejidos de plantas, incluyendo el floema y el xilema de pino taeda (

Abstract

Tejidos aislados de especies de coníferas, en especial los que pertenecen a la familia Pinaceae, como el pino taeda (

Protocol

Parte 1: Cosecha de árboles

Después de que el árbol se selecciona y se cortan, es importante trabajar con cuidado y lo más rápidamente posible. Como cada tipo de tejido diferentes se cosecha, se deben colocar inmediatamente en sus propios barcos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de muestras. Este protocolo de aislamiento de ARN es escalable.

1. Cortar los pernos en longitudes de aproximadamente 0,5-0,75 m y con una puntuación de motosierra de la corteza en dos o tres lugares, siguiendo el eje longitudinal del tornillo.
2. Utilizando un cincel de madera, el trabajo del borde de la región anotaron hasta la corteza comienza a separarse de la madera y seguir trabajando el cincel al tiempo que tira de nuevo en la sección de la corteza hasta que se separe por completo de la madre.
3. Xilema secundario se cosecha con un borde recto, de un solo lado de afeitar raspando a lo largo del eje longitudinal del tornillo que ha sido despojado de la corteza. Use guantes de látex para minimizar la contaminación de los tejidos.
4. Floema, que se encuentra en el lado interno de las secciones de la corteza, es fácilmente capturado por manual de pelar.
5. Madera de reacción se obtiene de la parte inferior de las extremidades después de marcarlos con pintura en aerosol para indicar su orientación original con respecto al suelo.
6. Las extremidades son cortadas en los tornillos de 2.1 m, y anotó en los lados opuestos a lo largo del eje longitudinal de acuerdo con la ubicación aproximada de los dos tipos de madera de reacción: madera opuesta (en la parte superior de la extremidad) y madera de compresión (en la parte inferior lado de la extremidad). La corteza se separa de la extremidad como se describió anteriormente, excepto que sólo la corteza que cubre cada tipo de madera de reacción se elimina de una vez. Xilema secundario o floema se recoge como se describe arriba y se colocan en nitrógeno líquido.
7. Otras muestras, tales como agujas, puntas de los brotes y los conos de los jóvenes, pueden ser cosechadas a mano o con tijeras de podar cuando sea necesario.
8. Las muestras recogidas se congelan en nitrógeno líquido debe ser colocado en bolsas o recipientes adecuados marcados y envasados ​​en hielo seco para que el traslado al laboratorio.

Parte 2: Procesamiento de Freezer Mill de las muestras

1. Llenar el depósito de molino Spex 6850 congelador de nitrógeno líquido y coloque la barra de impacto en uno de los viales de molienda y rellenar con nitrógeno líquido para pre-chill. Verter el nitrógeno líquido y añadir la muestra al vial.
2. Asegúrese de que el exceso de líquido de nitrógeno no permanece en la cámara de molienda y que el exceso de nitrógeno gas es ventilado completamente antes de que la tapa está sentado para sellar la cámara.
3. Introduzca el vial de molienda en el soporte y cerrar.
4. Molino de muestras de madera de dos ciclos de 1 minuto / ciclo en un ajuste de velocidad de 14.
5. Use una espátula de nitrógeno líquido refrigerado para extraer la muestra molida (harina de madera) en un vaso que ha sido pre-enfriado y contiene una pequeña cantidad de nitrógeno líquido.
6. Vierta el líquido de nitrógeno / muestra mezcla en un recipiente de almacenamiento y el lugar a -80 ° C hasta que se necesite.

Parte 3: el aislamiento de ARN, el día 1

1. Coloque 20 ml de tampón de aislamiento de ARN en un tubo de 50 ml tapado Falcon y añadir 400 l β-mercaptoetanol, vortex brevemente, y luego el calor en un baño de agua a 60 º C.
2. Añadir 4 g de tejido congelado para cada tubo. Tapa y agitar a mano seguido por agitación durante 10 segundos.
3. Añadir un volumen igual de cloroformo en el tubo e invierta para mezclar suavemente. Coloque el tubo en una rueda giratoria y permitir que de extremo a extremo la mezcla durante 5 minutos.
4. Decantar la mezcla en un tubo de 50 ml de Oak Ridge y centrifugar a 12.000 (17.200 xg) rpm en un SS34 rotor de ángulo fijo durante 5 minutos.
5. Pasar la fase acuosa a un tubo de Oak Ridge fresco y añadir un medio volumen de cloroformo.
6. Vortex durante 1 minuto y seguir mezclando en una rueda giratoria durante 5 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm (17.200 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 5 minutos.
7. Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo de Oak Ridge y añadir un medio volumen de cloroformo. Vortex durante 1 minuto. Centrifugar a 12.000 rpm (17.200 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 10 minutos.
8. Pasar la fase acuosa a un tubo de 50 ml de polipropileno de alta velocidad. Centrifugar a 10.000 rpm (11.900 xg) en un rotor de ángulo fijo SS34 durante 20 minutos.
9. Decantar el sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml y añadir un cuarto de volumen de 10 M a la solución de LiCl sobrenadante. Agitar brevemente y refrigerarlas a 4 ° C para la precipitación de la noche.

Parte 4: el aislamiento de ARN, Día 2

1. Calor buffer SSTE en un baño de 65 ° C el agua antes de comenzar.
2. Vierta la muestra de LiCl precipita en un tubo de polipropileno y el ARN precipitado por centrifugación a 11.000 rpm en un rotor de ángulo fijo SS34 (14.450 xg) durante 30 minutos a 4 ° C.
3. Después de la centrifugación,Retirar y desechar el líquido, e invertir los tubos en Kimwipes durante aproximadamente 1 minuto. Pipeta de cualquier resto de sobrenadante.
4. Resuspender cada pellet en 800 l de SSTE calienta por medio de una pipeta para mezclar bien las muestras. Transferir la muestra se resuspendieron a 2 ml tubos de microcentrífuga Ambion RNasa libre.
5. Muestras de calor a 65 ° C durante 2 minutos, seguido por agitación vigorosa para asegurar la completa resuspensión.
6. Añadir un volumen igual de fenol-cloroformo, pH 8, a cada tubo de muestra. Vortex cada muestra durante 30 segundos y luego girar en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 3 minutos
7. Pasar la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml Ambion RNasa libre, y añadir un volumen igual de cloroformo. Vortex cada muestra durante 30 segundos y girar en la microcentrífuga a 14.000 rpm durante 3 minutos.
8. Transferencia de fase acuosa a tubos de gel de enganche de fase, que han sido previamente preparados por microfuging a 11.000 rpm durante 2 minutos. Añadir la mitad de volumen de cloroformo y suavemente la pipeta para mezclar.
9. Centrifugar a 11.000 rpm durante 5 minutos y la transferencia de la fase acuosa a un nuevo tubo 2 ml de microfuga Ambion RNasa libre.

Parte 5: ARN de precipitación y lavado de etanol

1. Añadir 50 l de acetato de sodio 3,0 M, pH 4,8, y 1 ml de etanol al 100% a la fase acuosa. Vortex y precipitado en -80 ° C durante 30 minutos o toda la noche a -20 ° C.
2. Muestras de microcentrífuga a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C, y cuidado aspirar el sobrenadante. No moleste a la bolita.
3. Lavar los gránulos de ARN con 1 ml -20 ° C 70% (v / v) de etanol. Microfuga a 14.000 rpm durante 1 minuto y aspirar el etanol.
4. Repita el paso 5.3.
5. Destape los tubos y los pellets de aire seco en el banquillo durante 3-5 minutos.

Parte 6: resuspensión final y cuantificación

1. Resuspender cada pellet en 100 l agua tratada con DEPC. Mezclar por agitación e incubar los tubos a 65 ° C durante 2 minutos antes de colocar en el hielo. Repita si es necesario para asegurar la resuspensión de la muestra.
2. Piscina como muestras si así lo desea y hacer 50 l de una dilución de 1:10 en 10 mM Tris, pH 7,5, para la cuantificación espectrofotométrica. Razón de absorbancia de 260/280 y 260/230 son típicamente mayores de 2.1 y 2.2, respectivamente. El aislamiento de ARN rendimientos oscilan entre 60-120μg / g de tejido congelado.
3. Analizar las muestras mediante la ejecución de 1,5-2,5 mg de ARN en un 1% en gel de agarosa en buffer TAE. Para más muestras de crítica, analizar el ARN utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer según las instrucciones del fabricante.

Los resultados representativos:

Los rendimientos de aislamiento de ARN de coníferas diferentes tejidos rango 60 a 120 mg / g de tejido congelado, con muestras de madera suelen ceder en torno al 70-80g / g de tejido congelado. Ratios de diagnóstico de 260/280 y 260/230 son por lo general mayor que 2.1, y son buenos indicadores de que la muestra de ARN está libre de cualquier contaminación o fenólicos importante de hidratos de carbono, respectivamente. Las muestras analizadas por electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción EtBr debe mostrar tres bandas distintas de 25S, 18S y 5S ARN (Figura 1). La determinación de la estequiometría de la 28S a 18S en geles de agarosa es algo subjetivo, y factores tales como condiciones de funcionamiento para el gel, las manchas, y la carga de probar todos pueden tener un efecto. En general, el 28S: 18S relación se parecen ser> 1,5. Sin embargo, algunas muestras de coníferas tienen menores proporciones. Por ejemplo, tras el análisis de Agilent 2100 hemos visto varios casos de muestras de coníferas de diferentes tipos de tejidos, donde la estequiometría está más cerca de 1,2:1. Por lo tanto, una aparente baja 28S: 18S estequiometría por electroforesis en gel de agarosa no indica necesariamente una muestra de mala calidad. Hoja, disparar, y las muestras de cono a menudo tienen más distintas bandas presentes debido a cloroplástico ARN ribosomal. EtBr manchado de materiales que no emigran de la muestra bien o bandas de alta masa molecular (> 10.8 kb) por lo general indican la contaminación de ADN genómico (Figura 2). Frotis bajo peso molecular en las proximidades o debajo de la banda 5S y tinción reducida banda ribosomal 18S o un aparente> estequiometría 28S es un buen indicador de que se ha producido la degradación del ARN (Figura 3). En el análisis electroferograma Agilent 2100, la línea de base debe ser baja y relativamente lisa, con picos principales correspondientes a los ARN 18S y 28S ribosomal 28S con: 18S ratios que van en cualquier lugar desde 1,2 hasta 2,0. El número de Agilent integridad del ARN (RIN) de valor puede ser un mejor predictor de la calidad del ARN y debe ser por lo menos 7 o superior para el ARN que se va a utilizar para la preparación de los objetivos de microarrays. La Figura 4 muestra una típica Agilent 2100 electroferograma para el ARN del xilema con un 28S: 18S proporción igual a 1,4 y un valor de RIN de 8,6 mientras que la Figura 5 se muestra un xilema pobres ARN de preparación con una base muy alta y la degradación notable como lo revela el 28S: 18S raigual a 0,65 y un valor de RIN de 3,4 tio.

Figura 1. Agarosa análisis en gel de ARN de pino de alta calidad. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Carril 2 muestra un típico aislamiento de ARN total de pino tea xilema secundario con características ribosomal 28S, 18S, 5S y las bandas y la aparente 28S: relación de 18S> 1.

Figura 2. Análisis en gel de agarosa de pino muestra de ARN contaminadas con ADN genómico. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Calle 2, xilema muestra de ARN que muestra la contaminación de ADN genómico.

Figura 3. Agarosa gel de análisis de la muestra de pino que muestra la degradación del RNA y de la contaminación con ADN genómico. Calle 1, ORC 1 kb estándar, Lane2, xilema muestra de ARN que muestra la contaminación de ADN genómico y severa degradación del ARN.

Figura 4. Agilent 2100 electroferograma de ARN total xilema aislado utilizando el método descrito en el xilema pino tea. 28S: 18S relación de igual a 1,4, el valor de RIN equivale a 8,6

Figura 5. Agilent 2100 electroferograma de ARN total de la punta apical que muestra una severa degradación y la contaminación genómica. 28S: 18S relación de igual a 0,65, el valor de RIN equivale a 3,4

Discussion

La obtención de ARN de alta calidad a partir de especies de coníferas puede ser una tarea difícil debido a los altos niveles de compuestos fenólicos y polisacáridos se encuentran en los tejidos leñosos. Comenzando con el protocolo desarrollado por Chang et al. (1), hemos encontrado que la extracción de más riguroso y limpieza de los pasos conducen al aislamiento constante de muy alta calidad total de ARN de varios tejidos leñosos no maderables en la muestra de una gran variedad de especies de coníferas. Este vídeo ha demostrado no sólo nuestro protocolo modificado el aislamiento de ARN, sino también las medidas adoptadas en la recolección de campo y técnicas de procesamiento utilizadas para el pino de incienso antes de aislamiento de ARN. Estos pasos de cosecha y la preparación son igualmente importantes para reducir al mínimo la degradación del ARN en el campo de las muestras recogidas, así como para aumentar tanto la calidad del ARN y el rendimiento total. Lo más importante, hemos encontrado que el ARN preparados con este método ha dado lugar a un aumento de los rendimientos de síntesis de cDNA en comparación con otros métodos utilizados para preparar los objetivos de microarrays de hibridación en contra de la PtGen2 pino tea de microarrays (2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425