RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Summary

Loblolly çam ksilem ve floem de dahil olmak üzere birçok bitki dokularında, (

Abstract

Dokular özellikle Loblolly çam gibi kozalaklı türler, Pinaceae ailesine mensup olanlar, (den izole

Protocol

Bölüm 1: Ağaç Hasat

Ağaç ve yıkılan sonra, dikkatli ve mümkün olduğunca hızlı çalışması için önemlidir. Her biri farklı bir doku tipi hasat edilir örnek malzemenin herhangi bir çapraz kontaminasyonu engellemek için, onlar hemen kendi sıvı azot kaplar içine yerleştirilmiş olmalıdır. Bu RNA izolasyonu protokol ölçeklenebilir.

1. Yaklaşık 0.5-0.75 m uzunluğa ve testereli bir skor ile iki veya üç yerlerde kabuğu cıvata uzunlamasına eksen cıvata Kes.
2. Kabuğu, kök tamamen ayrılıncaya kadar ahşap ayrı ve kabuğu bölümü geri çekerken keski çalışmaya devam başlayana kadar bir ahşap keski kullanarak, gol bölgenin kenarında çalışır.
3. İkincil ksilem kabuğu soyulmuş cıvata uzunlamasına ekseni boyunca kazıma straight edge, tek taraflı jilet ile hasat edilir. Doku kontaminasyonu en aza indirmek için lateks eldiven giyin.
4. Phleom kabuğu bölümlerin iç tarafında bulunan, kolayca soyma elle hasat edilir.
5. Reaksiyon ahşap zemin saygı ile kendi orijinal yönünü göstermek için sprey boya ile işaretleme sonra alt uzuvlarda toplanıyor.
6. Uzuvlar cıvata içine 1-2 metre kesilmiş ve boylamasına ekseni boyunca yaklaşık iki tür reaksiyon ahşap yerlere göre ters taraftan gol: ters ahşap (bacak üst tarafındaki) ve sıkıştırma ahşap (alt ekstremite tarafı). Kabuğu, sadece her tür reaksiyon ahşap kaplama kabuğu bir anda kaldırılmış olması dışında, yukarıda açıklandığı gibi uzuv ayrılır. İkincil ksilem ve floem, yukarıda açıklanan ve sıvı azot yerleştirilmiş olarak tahsil edilir.
7. Iğneler, sürgün ipuçları ve genç koniler gibi diğer örnekleri, elle hasat ya da gerektiği gibi budama makasları kullanarak olabilir.
8. Toplanan numuneler, sıvı nitrojen içinde dondurulmuş işaretli torbaları veya uygun kaplara yerleştirilir ve laboratuvara gönderilmek Geri dönmek için kuru buz içinde paketlenmiş olmalıdır.

Bölüm 2: Numune Dondurucu Mill İşleme

1. Spex 6850 dondurucu değirmen rezervuar sıvı nitrojen ile doldurun ve taşlama şişeleri birine etkisi çubuğunu yerleştirin ve önceden soğuk sıvı azot ile doldurun. Sıvı nitrojen dökün ve flakon örnek eklemek.
2. Aşırı sıvı nitrojen Tambur kalır ve sonunda kapağı Odanın mühür oturan önce bu aşırı azot gazı tamamen Bacalı emin olun.
3. Taşlama flakon taşıyıcı ve yakın içine yerleştirin.
4. 14 bir oran ayarda iki kür için 1 dakika / devir Mill odunsu örnekleri.
5. Önceden soğutulmuş ve küçük bir miktar sıvı azot içeren bir behere öğütülmüş numune (odun unu) kaldırmak için bir sıvı azot soğutulmuş spatula kullanın.
6. Gerekli -80 ° C kadar bir saklama kabı ve yerine sıvı azot / numune şerbeti dökün.

Bölüm 3: RNA izolasyonu, 1. Gün

1. RNA İzolasyon Tampon 20ml 50ml kapaklı Falcon tüp içine yerleştirin ve sonra 400 mcL β-mercaptoethanol, girdap, kısaca ısı 60 ° C su banyosunda ekleyin.
2. Her tüpe 4 gr dondurulmuş doku. Cap ve 10 saniye boyunca vorteks tarafından takip elle kuvvetlice çalkalanır.
3. Tüpüne eşit miktarda kloroform ekleyin ve karıştırın hafifçe ters. Dönen bir tekerlek üzerinde tüp yerleştirin ve 5 dakika boyunca karıştırma sonu aşırı uç izin.
4. 12.000 (17.200 xg'de), 5 dakika boyunca SS34 sabit açılı rotor devir az 50 ml Oak Ridge tüp ve santrifüj karışımı süzün.
5. Taze Oak Ridge tüp sulu faz transfer ve kloroform yarım hacmi ekleyin.
6. 1 dakika ve 5 dakika boyunca dönen bir tekerlek karıştırmaya devam Vortex. 12.000 rpm (17.200 xg), 5 dakika boyunca SS34 sabit açılı rotor santrifüjleyin.
7. Sulu faz taze Oak Ridge tüpüne aktarın ve kloroform yarım hacmi ekleyin. 1 dakika karıştırın. SS34 10 dakika boyunca sabit açılı rotor 12.000 rpm (17.200 xg) santrifüjleyin.
8. Sulu faz 50 ml yüksek hızda polipropilen tüpe aktarın. SS34 20 dakika boyunca sabit açılı rotor 10.000 rpm (11,900 xg) santrifüjleyin.
9. Durusu 50 ml Falcon tüp içine süpernatant ve süpernatant çeyrek hacmi 10 M LiCl çözüm ekleyin. 4 Kısaca vorteks ve yeri ° C, gece yağış için.

Bölüm 4: RNA izolasyonu, 2. Gün

1. Isı SSTE başlamadan önce 65 ° C su banyosunda tampon.
2. 4 SS34 sabit açılı rotor 11.000 rpm (14.450 xg) 30 dakika süreyle santrifüj bir polipropilen boru ve pelet RNA LiCl çöktürülmüş örnek dökün ° C.
3. Santrifüj sonra,dökün ve sıvı atmak ve yaklaşık 1 dakika boyunca Kimwipes tüpler ters. Herhangi bir kalan süpernatant Pipet.
4. Isıtmalı SSTE örnekleri iyice karıştırmak için bir pipet kullanarak 800 mcL her pelletini tekrar. 2 mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de tüpler yeniden süspanse örnek aktarın.
5. Isı örnekleri 65 ° C,, tam olarak yeniden süspanse sağlamak için kuvvetli bir vorteks takip 2 dakika boyunca.
6. Her numune tüpü, fenol-kloroform, pH8 bir eşit miktarda ekleyin. 14.000 rpm'de 3 dakika 30 saniye sonra Vorteks her bir örnek ve bir mikrofuge'ye Spin
7. Yeni bir 2mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de borular, sulu faz transfer ve kloroform eşit miktarda ekleyin. Vorteks her 30 saniye ve 3 dakika 14.000 rpm'de mikrofuge'ye spin örnek.
8. Faz-Lock Jeli tüpler daha önce 2 dakika 11.000 rpm'de microfuging tarafından hazırlanan sulu faz aktarın. Kloroform yarım hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın pipetle.
9. 5 dakika 11.000 rpm'de santrifüj ve taze 2mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de borular, sulu faz transfer.

Bölüm 5: RNA Yağış ve Etanol Yıkama

1. 50 mcL 3.0 M sodyum asetat, pH 4.8 ve sulu faz 1 ml% 100 etanol ekleyin. Girdap ve çökelti -80 ° C de 30 dakika veya gece -20 ° C
2. Mikrofuge'de örnekleri 30 dakika boyunca 14.000 4 dak ° C, ve dikkatle süpernatantı aspire. Pelet rahatsız etmeyin.
3. 1 ml -20 ° C% 70 (v / v) etanol ile RNA pelet yıkayın. 1 dakika 14.000 rpm'de mikrofuge'de ve etanol aspirat.
4. 5.3 adımı tekrarlayın.
5. 3-5 dakika bankta tüpler ve hava-kuru granül şapkasını çıkarmak.

Bölüm 6: Tekrar Süspansiyonu ve Miktar

1. 100 mcL DEPC arıtılmış su her pelletini tekrar. Vorteks Mix ve tüpler buz üzerine yerleştirmeden önce 2 dakika 65 ° C'de inkübe edin. Örnek tabanda sağlamak için gerekirse tekrarlayın.
2. Istenen ve spektrofotometrik kantitatif, 10mM Tris, pH 7.5 1:10 seyreltme 50 mcL örnekleri gibi Havuzu. 260/280 ve 260/230 Absorbans oranları genellikle sırasıyla 2.1 ve 2.2 'den daha fazladır. 60-120μg / g dondurulmuş doku, RNA izolasyonu getirileri aralığı.
3. TAE tampon 1.5-2.5 mg RNA% 1 agaroz jel üzerinde çalışıyor örnekleri analiz edin. Daha kritik örnekleri için, üreticinin talimatlarına göre bir Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA analiz edin.

Temsilcisi Sonuçlar:

Odunsu örnekleri ile farklı kozalaklı dokuların aralığı RNA izolasyonu verim 60-120 mikrogram / g dondurulmuş doku genellikle 70-80g / g dondurulmuş doku çevresindeki verimli. 260/280 ve 260/230 tanı oranları genellikle 2.1 'den daha fazladır ve RNA örneği ise, önemli bir fenolik veya karbonhidrat kirlenme ücretsiz olduğunu iyi göstergeleridir. EtBr boyama agaroz jel elektroforezi ile analiz Örnekleri 25S, 18S ve 5S RNA (Şekil 1) için üç ayrı grup göstermelidir. Agaroz jel üzerinde 18S 28S stokiyometri tespiti biraz öznel ve jel, boyama, ve örnek yük koşulları çalışan gibi faktörlerin hepsi bir etkisi olabilir. Genel olarak, 28S 18S oranı> 1.5 olarak görünecektir. Ancak, bazı kozalaklı örnekleri daha düşük oranları var. Örneğin, Agilent 2100 analizi aşağıdaki stokiyometri 1.2:1 için yakın farklı doku tiplerinin kozalaklı örnekleri çeşitli örneklerini gördük. Böylece, belirgin bir düşük 28S 18S agaroz jel elektroforezi ile stokiyometri mutlaka düşük kaliteli örnek göstermek değildir. Yaprak, ateş ve koni örnekleri genellikle ek farklı bantları chloroplastic ribozomal RNA'lar nedeniyle mevcut olacak. Iyi örnek veya yüksek molekül kütlesi bantları (8-10 kb) göç etmeyen EtBr lekeli malzemeleri genellikle genomik DNA kontaminasyonu (Şekil 2) gösterir. 5S bant ve azaltılmış ribozomal bant boyama ya da belirgin bir 18S> 28S stokiyometri RNA bozulması meydana gelmiştir (Şekil 3) iyi bir gösterge ya da aşağıda çevresinde Düşük moleküler kütlesi bulaşıyor. Agilent 2100 Elektroferogram analiz, taban çizgisi 18S ve 28S sahip 28S ribozomal RNA'lar ilgili önemli zirveleri ile düşük ve nispeten pürüzsüz olmalıdır: 1.2 'den 2.0' a her yerde değişen 18S oranları. Agilent RNA Bütünlük sayısı (RIN) değeri RNA kalitesini daha iyi bir belirleyicisi olabilir ve RNA mikroarray hedeflerinin hazırlanması için kullanılacak en az 7 veya daha büyük olmalıdır. 1.4 eşit 18S 18S: Şekil 5 RNA hazırlık 28S ortaya koyduğu gibi çok yüksek bir bazal ve fark bozulması olan fakir bir ksilem gösterirken oranı ve bir RIN değeri 8.6: Şekil 4, bir 28S ile ksilem RNA tipik bir Agilent 2100 Elektroferogram gösterir ra0.65 ve 3.4 RIN değeri eşit tio.

Şekil 1, yüksek kaliteli çam RNA agaroz jel analizi . Lane 1, NEB 1 kb standart, Lane 2 Loblolly çam ikincil ksilem karakteristik ribozomal 28S, 18S ve 5S bantları ve belirgin 28S ile tipik bir toplam RNA izolasyonu gösterir: 18S oranı> 1.

Şekil 2 çam RNA örnek agaroz jel analizi genomik DNA ile kontamine olmuş . Lane 1 NEB 1 kb standart 2, Lane, genomik DNA kontaminasyonu gösteren ksilem RNA örnek.

Şekil 3 genomik DNA ile RNA bozulma ve kirlenme gösteren çam örnek agaroz jel analizi. Lane 1, NEB 1 kb standart, Lane2, genomik DNA kontaminasyonu ve şiddetli RNA bozulma gösteren ksilem RNA örnek.

Şekil 4 ksilem total RNA Agilent 2100 Elektroferogram Loblolly çam ksilem açıklanan yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. 28S: 18S oranı 1.4 eşittir, RIN değeri 8.6 eşittir

Şekil 5 Agilent 2100, ciddi bozulma ve genomik kirlenme gösteren apikal uç total RNA Elektroferogram . 28S 18S oranı 0.65 eşittir, RIN değeri 3.4 eşittir

Discussion

Kozalaklı ağaç türlerinin yüksek kaliteli bir RNA Alınması odunsu dokularında bulunan fenolik ve polisakkarit bileşiklerin yüksek düzeyde verilen zor bir görev olabilir. Chang ve arkadaşları tarafından geliştirilen protokol ile başlayarak. (1), biz daha titiz çıkarma bulundu ve tutarlı kozalaklı türlerin geniş bir yelpazede örneklenmiş çeşitli odunsu ve odunsu olmayan dokular çok yüksek kalitede toplam RNA izolasyonu yol adımları temizlemek gerekir. Bu video modifiye RNA izolasyon protokol, aynı zamanda Loblolly çam önce RNA izolasyonu için kullanılan alan toplama ve işleme teknikleri atılan adımlar sadece göstermiştir. Bu hasat ve hazırlık adımları alanında toplanan örneklerin RNA bozulması en aza indirmek için, hem de RNA kalite ve toplam verimi artırmak için de aynı derecede önemlidir. En önemlisi, biz RNA PtGen2 Loblolly çam mikroarray (2) karşı hibridizasyon mikroarray hedefler hazırlamak için kullanılan diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında cDNA sentezi verimi artışa yol açmıştır bu yöntemi kullanarak hazırlanan bulduk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA Isolation Buffer			2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Phenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Made with DEPC-treated water
SSTE Buffer			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8			Made with DEPC-treated water
Phenol-chloroform (pH8.0)			120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Oak Ridge High Speed Teflon Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polypropylene 50mL High Speed Tubes	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL	Ambion	#AM12425