Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Summary

Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.

Abstract

Commissural neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan axon begeleiding tijdens de embryonale ontwikkeling van het ruggenmerg te onderzoeken. De cellichamen van deze neuronen bevinden zich in het dorsale ruggenmerg en hun axonen volgen stereotiepe trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling. Commissural axonen in eerste instantie ventraal project de richting van de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen naar voren en het project richting de hersenen. Elk van deze stappen wordt gereguleerd door de werking van verschillende begeleiding cues. Culturen sterk verrijkt in commissural neuronen zijn bij uitstek geschikt voor vele experimenten het aanpakken van de mechanismen van axon pathfinding, waaronder het draaien assays, immunochemie en biochemie. Hier beschrijven we een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Eerst wordt het ruggenmerg geïsoleerd en dorsale strips ontleed uit. De dorsale weefsel wordt dan gedissocieerd in een cel schorsing door behandeling met trypsine en mechanische storingen. Neuronen zijn uitgeplaat op poly-L-lysine-gecoat glas dekglaasjes of weefselkweek gerechten. Na 30 uur

Protocol

1. Dissectie van embryonale rat dorsale ruggenmerg

Algemene aanbevelingen

Houd L-15-medium op het ijs en vaak het medium verandering in de dissectie schotel om de embryo's af te koelen. Dit spaart weefsel integriteit. Alle stappen worden uitgevoerd met twee paar van Dumont # 5 tang tenzij anders vermeld. Om contaminatie te voorkomen, spray alle gereedschappen en werkoppervlakken met 70% ethanol en houden dissectie medium fles gesloten. Voor de overdracht van embryo's tussen de gerechten, gebruik dan een cut plastic pipet of een geperforeerde lepel. Het is van levensbelang, niet aan het ruggenmerg (knikken, stretching) schade met succes te voltooien de dissectie.

Voorbereiding

• Koude L-15-medium
• 50 ml L-15 + 10% hitte-geïnactiveerd paard serum (HiHS). Te houden op het ijs.

Ruggenmerg dissectie

1. Euthanaseren een E13 zwangerschap-geënsceneerde rat (E0 = eerste dag na dekking dagen) met een CO ₂ kamer volgens de institutionele richtlijnen.
2. Spray 70% ethanol op de buik. Pinch en trek de huid van de onderbuik met een pincet en snijden met chirurgische schaar. Herhalen om dwars door de spier-en peritoneale lagen om de buikholte te bereiken. Maak een V-vorm incisie door te snijden weefsel langs de zijkanten van de buik, tot aan de thorax. Til en trek terug het weefsel naar de buikholte bloot te leggen.
3. De baarmoeder is bevestigd op drie locaties: in het midden onder buik, en zowel de bovenste laterale hoeken. Til de baarmoeder door te grijpen op weefsel tussen embryonale zakken. Snijd het bindweefsel naar de baarmoeder en plaats het in een petrischaal gevuld met L-15 op het ijs te verwijderen.
4. De volgende stappen zijn gedaan onder een dissectie microscoop. Te scheiden een embryo van de extra-embryonale weefsels en embryonale membranen, pak het weefsel tussen de baarmoeder zakken met een pincet,. Met het andere paar, knijp de meer transparante zijde van de zak om dwars door de oppervlakkige membranen (de donkere kant is de placenta). Knijp het embryo door zachtjes te drukken op de placenta kant van de weg. Verwijder alle embryo's en in een petrischaal gevuld met L-15 op het ijs.
5. Plaats een embryo in een 10 cm petrischaal gevuld met ijskoude L-15. Met behulp van microscissors, weggesneden het hoofd en achterste delen hoeken weergegeven in figuur 1a.
   
   Snijden op deze hoek zal de positie van de embryo wanneer geplaatst "ventrale naar beneden" te helpen.
   
   
6. De positie van de embryo 'ventrale zijde naar beneden "(anterior wijst weg, posterior wijzend naar de experimentator) (afb. 1b).
7. Houd het embryo van de ene kant, met behulp van de tang "pin down" het embryo (fig. 1c). Niet bewegen van de tang, want het zal het weefsel scheuren. Met de andere tang, afschilferen van de huid over de rug van het embryo vanaf de streek tussen de "bedrijf" tang (fig 1d-e). Dit zal blootstellen het ruggenmerg, die op dit punt, is verpakt door membranen (de hersenvliezen).
   
   Pak de huid van de zijkanten in plaats van boven het ruggenmerg om te voorkomen dat knikken het ruggenmerg.
   
   
8. Gedeeltelijk los het weefsel aan de rechterkant van het ruggenmerg (fig. 1f). Vanaf het niveau van de holding tang, porren het weefsel met gesloten pincet, zo dicht mogelijk bij het ruggenmerg. Vervolgens opent u langzaam de tang om het weefsel scheuren. Dit moet los van de achterwortelganglia (DRG) van het ruggenmerg, en moeten ook verstoren ventrale organen. Laat wat weefsel bevestigd aan de voorste en achterste uiteinden. Aangesloten verlaten weefsel gewicht toevoegt aan het embryo, waardoor wordt voorkomen dat het wordt omhoog getrokken tijdens de volgende stap. Daarnaast wordt dat weefsel gebruikt om vast te houden aan het embryo in latere stappen.
9. Vanaf het voorste einde moet het gebruik van de haakvormige wolfraam naald op de hersenvliezen snijden en het ruggenmerg te openen langs de roofplate (fig. 1g).
10. Draai de embryo 180 graden (posterior weg te wijzen, voorste wijzend naar de experimentator) (afb. 1h).
    
    Hierdoor kan de onderzoeker aan dezelfde hand te gebruiken om het weefsel los te maken van de andere kant van het embryo.
    
    
11. Houd het embryo door te grijpen op de eerder vrijstaande kant, en verstoren het weefsel van de overblijvende zijde met behulp van dezelfde methode (zie 1.8.). Als je klaar bent, helemaal los van het weefsel aan beide zijden van het ruggenmerg.
    Alternatief: helemaal los het weefsel nog op de linkerkant, maar laat iets weefsel bevestigd aan de voorste en achterste einde aan de rechterkant. Dit kan soms helpen handhaven het ruggenmerg in de positie in stap 1.12.
12. Plaats het ruggenmerg op zijn kant en verwijder de meeste van de resterende mesenchymale weefsel en DRG's (fig. 1i).
13. Bij deze stap, de hersenvliezen en het ruggenmerg zijn twee 'platen' van de weefsels apposed op elkaar. Vastpinnen de grotere, anterior-de meeste deel van het ruggenmerg, en trek een kort segment van hersenvlies uit het ruggenmerg cord (fig. 1j, links). Nu, houd de twee gescheiden segmenten door te grijpen in met een pincet, en trek het hersenvliezen met een gladde, constante beweging (fig. 1j).
    Ongelijke "peeling" zal leiden tot breuk van het ruggenmerg en / of de hersenvliezen laag. Het is meestal niet mogelijk om te herstellen van het gedeelte van het ruggenmerg nog aan hersenvliezen.
14. Met behulp van een plastic pipet de geïsoleerde ruggenmerg naar een petrischaal met een L-15 + 10% HiHS en laten op het ijs. Typisch worden ruggenmerg van alle embryo's voor het ontleden van de dorsale delen.

Dorsale ruggenmerg dissectie

15. Plaats een ruggenmerg in een petrischaal met een L-15 +10% HiHS, liggend in een "open-boek" configuratie. Knip de ruimere, voorste gedeelte (waaronder een deel van de achterhersenen) (fig. 1k).
16. De dorsale weefsel bevindt zich in de laterale-de meeste delen van het ruggenmerg (fig 1l, links). Terwijl pinning het snoer met een rechte wolfraam naald, gebruik dan de L-vormige wolfraam naald te snijden een strip die is 1/5de van de breedte van de helft van het ruggenmerg. (Fig. 1l, rechts). Plaats de dorsale strips in een 15 ml plastic buis met L-15 + 10% HiHS op ijs.
    Dorsale neurale buis delen van ~ 12 E13 embryo's zal opleveren ~ 3.5-4 miljoen cellen voor plating na dissociatie. Meer cellen kunnen worden verkregen door het uitvoeren van een grove ontleding van de dorsale ruggenmerg (snijden breder dorsale strips), maar commissural neuron zuiverheid zal worden verminderd.

2. Commissural neuron cultuur

Algemene aanbevelingen

Alle stappen dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap, tenzij anders vermeld. Gebruik vers medium en vers ontdooid supplementen en reagentia. De dissociatie en tritureren stappen worden uitgevoerd in Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-vrij} HBSS te minimaliseren Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-afhankelijke} hechting.

Voorbereiding

• beklede dekglaasjes (gebruik Duits Desag glas) of weefsel cultuur platen (zie coating procedure hieronder).
• warm Neurobasal Plating Media (zie hieronder), in weefselkweek gerechten en CO ₂ evenwicht in de weefselkweek incubator voor minimaal 1,5 uur voor de plating.
• 2,5% trypsine in de 37 ° C waterbad
• 2 flessen van HBSS Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-vrij,} een bij 4 ° C, een bij 37 ° C.
• twee vuur-gepolijst glas pasteurpipetten een met een diameter de helft van de gebruikelijke grootte, en een met een diameter van iets kleiner dan de helft. Gebruik gesteriliseerd Pasteurpipetten. Om brand-polijsten de pipetten, gebruik dan een Bunsen-brander (de top van de licht blauwe vlam) om de tip te smelten enigszins afnemen van de diameter. Omdat deze stap is uitgevoerd buiten de weefselkweek kap, spuit de pipetten met 70% ethanol voor plaatsing onder de weefselkweek kap. Voor meer efficiënte invordering van neuronen, de vacht van de pasteurpipetten met media die serum voor het begin van de dissociatie of net voor de tritureren stap (vul pipetten met media en houden gedurende 30 seconden). Dit voorkomt dat cellen van het vasthouden aan de binnenkant van het Pasteur pipet tijdens de tritureren.
• steriel milliQ water voor het wassen van PLL-gecoate gerechten of dekglaasjes
• 12,5% MgSO _4-oplossing in HBSS

Poly-L-lysine coating

Bij gebruik van glas dekglaasjes, acid-wash voor 24 uur en steriliseren voorafgaand aan de beplating (zie Kaech en Banker, 2006). Gebruik Duitse Desag glas dekglaasjes.

Voor het coaten van poly-L-lysine op glas of plastic dekglaasjes weefselkweek gerechten:

• onder een weefselkweek kap, bestrijken oppervlakken met een kleine koepel van 100 ug / ml PLL oplossing voor 1.75-2 uur.
• Was twee keer met milliQ water, ten minste 5 minuten per wasbeurt (kan worden uitgevoerd tijdens de cel dissociatie stap hieronder).
• op te slaan in het water tot gebruik. Laat niet de PLL-gecoate oppervlak droog is.
  Ter beperking van PLL verspilling voor dekglaasjes coating, plaats de dekglaasjes in steriele bacteriële petrischalen. Vacht en was de dekglaasjes door het plaatsen van een koepel van vloeistof op de dekglaasjes. De bacteriële Petri gerechten zijn hydrofoob, waardoor de vloeistof moet blijven op het glas dekglaasjes. Overdracht van de dekglaasjes om weefselkweek gerechten vlak voor beplating van de cellen.
  Voor neuronen vergulde op plastic weefselkweek gerechten, hechting meestal hoger is, kan dus neurieten rek worden verminderd.

Dissociatie en plating

1. Controleer of de dorsale strips hebben zich tot op de bodem van de buis. Verwijder het merendeel van de L-15 +10% HiHS met een Pasteur pipet. Snel een keer was het dorsale neurale buis strips door het toevoegen van 3 ml koud (4 ° C) HBSS.
2. Laat de dorsale neurale buis strips gedurende 2 minuten rusten, verwijder vervolgens de HBSS met een Pasteur pipet.
3. Voeg warm (37 ° C) HBSS tot een volume van 4,7 ml. Then Voeg 0,3 ml van 2,5% trypsine tot een uiteindelijke concentratie van 0,15% trypsine te geven.
4. Incubeer bij 37 ° C in het waterbad gedurende 7 minuten. Meng voorzichtig een keer halverwege de incubatie.
5. Voeg 30 ul DNAse (25 000 U / mL) voor een uiteindelijke concentratie van 150 U / mL. Voeg 60 ul van MgSO ₄ en meng kort voor een uiteindelijke concentratie van 0,15%.
   Voor weefsel van grof dissecties, incubeer voor een extra 1 minuut bij 37 ° C in het waterbad.
   
   In dit stadium moet het dorsale neurale buis secties worden versnipperd. Als de dorsale neurale buis secties niet begonnen met het fragment, betekent dit meestal dat de 2,5% trypsine voorraad oud is, en nieuwe voorraad moet worden ontdooid, of het wassen met koud HBSS niet effectief te verwijderen van de HiHS uit het monster.
6. Centrifugeer het weefsel fragmenten bij 200 g gedurende 4 minuten.
7. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet, zodat ~ 50-100 ul van vloeistof op de bodem van de buis.
8. Flick de buis voorzichtig om de pellet los te maken, dan wassen van de cellen door toevoeging van 5 ml warm HBSS. Laten bezinken bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
9. Centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten.
10. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet, zodat ~ 50-100 ul van vloeistof op de bodem van de buis.
11. Flick de buis voorzichtig om de pellet los te maken en gedeeltelijk resuspendeer de cellen. Voeg vervolgens 2 ml warm HBSS.
12. Gebruik de kleine (half-diameter) brand-gepolijst glas Pasteur pipet om de cellen te scheiden door langzaam pipetteren up-and-down 4-6 keer. Voorkomen dat bubbels, en pipet de vloeistof tegen de zijkant van de buis. Niet over-vermaal.
13. Gebruik de kleinste vuur-gepolijst glas Pasteur pipet om verder van de cellen scheiden door langzaam pipetteren up-and-down 3-4 keer. Voorkomen dat bubbels, en pipet de vloeistof tegen de zijkant van de buis. Niet over-vermaal.
    Voor weefsel van grof dissecties, voeg een extra 1 ml warm HBSS aan de buis aan het einde van de dissociatie.
    Wanneer dissociëren de cellen, is het niet nodig om alle de cel klompen en aggregaten dissociëren. Stop pipetteren up-and-down of wijziging van een Pasteur pipet met een kleinere diameter als je geen verdere daling in de omvang van de cel aggregaten met verdere pipetteren.
14. Laat de resterende weefsel fragmenten in de buis genoegen nemen met een min. Het is niet nodig om de cellen over te dragen aan een nieuwe buis.
15. Neem 20 pi celsuspensie en voeg 5 pl trypan blauw. Rekenen cellen op een hemocytometer.
    Neuronen moet ≥ 95% haalbaar zijn door trypan blauw uitsluiting.
16. Het bord van de neuronen in Neurobasal Plating Media (zie recepten).
    • Aanbevolen plating dichtheden voor het verkrijgen van geïsoleerde neuronen (low-density culturen om neuronen klonteren of overlappen elkaar te voorkomen):
    • 120 000 - 180 000 cellen / goed voor een 6 wells plaat
    • 60 000 - 75 000 cellen / goed voor een 12 wells plaat
17. 16-18 uur later, wijzigt de media om Neurobasal Growth Media (zie recepten)
    Geen gebruik maken van een vacuümpomp om de media te zuigen uit de cultuur schotel bij het ​​veranderen van media; voorzichtig gebruik van een pipet. Dit voorkomt loskomen van de neuronen.

Representatieve resultaten:

Vier uur na plating, moet neuronen hebben gehandeld op grond van de poly-L-lysine (PLL)-coating. Onder fase contrast belichting, gevolgd cellichamen zijn meestal vrij plat en ovaal van vorm (fig. 2a). Cellen die niet goed zijn toegetreden weergegeven als bolletjes die iets bewegen als de schotel is zeer zacht klopte op de zijkant. Vele factoren kunnen mogelijk belemmeren de hechting van cellen (zie discussie).

Na 30 uur in vitro, hebben de meeste neuronen uitgebreid een axon met een zichtbare groei kegel (fig. 2c, d). Als een slechte axonale groei wordt waargenomen, controleert u of de Neurobasal Growth Media is gemaakt met vers medium en supplementen. Neuronen gezond te blijven gedurende ten minste 6 dagen in deze voorwaarden. Deze procedure heeft bewezen betrouwbaar te geven voorbereidingen sterk verrijkt in commissural neuronen, met ~ 90% van de neuronen die DCC (Yam et al.. 2009). De breedte van de dorsale ruggenmerg strip die wordt gebruikt voor de voorbereiding van de celsuspensie van invloed op de zuiverheid van de cultuur, met een grotere zuiverheid wanneer dunnere strips worden gebruikt. Een voorbeeld toepassing is weergegeven in figuur 3 (immunofluorescentie). Zie het artikel van Yam et al.. (2009) voor meer voorbeelden.

Figuur 1. Schema van het ruggenmerg dissectie stappen. D = rug-, V = Ventraal. Klik hier voor een grotere afbeelding te zien.

Figuur 2. Vertegenwoordiger gevolg van de geïsoleerde commissuralneuronen uitgeplaat op een PLL-gecoat glas dekglaasje aan. a, b) 4 uur na de plating, hebben neuronen gehandeld op grond van het oppervlak. Bar = 20 urn. c, d) 30 uur na de plating, hebben de meeste neuronen uitgebreid een axon met een zichtbare groei kegel. Bar = 20 urn.

Figuur 3. Commissural Een neuron immunostained voor gamma-tubuline (groen), met F-actine gelabeld door phalloidin (F-actine, rood) en de kern van DAPI (blauw).

Recepten en opmerkingen

Neurobasal Plating Media

• Neurobasal
• 10% hitte-geïnactiveerd FBS (HiFBS)
• 2 mM L-glutamine (van 200 mM voorraad-oplossing)
  Optioneel: penicilline / streptomycine antibiotica (gebruik de helft van de normale concentratie)

Neurobasal Groei Media

• Neurobasal
• B27 (1 / 50 verdunning uit voorraad)
• 2 mM L-glutamine (van 200 mM voorraad-oplossing)
• Optioneel: penicilline / streptomycine antibiotica (gebruik de helft van de normale concentratie)
  
  Zodra de media is gemaakt, kan deze worden bewaard bij 4 ° C gedurende twee weken. Om de temperatuur en de pH van media evenwicht voor het uitplaten de cellen, plaatsen media in weefselkweek petrischalen en plaats in een weefselkweek incubator voor minstens 1,5 uur.

Neurobasal

Na een fles Neurobasal medium is geopend, kan het een maand bewaard bij 4 ° C in het donker. Gooi Neurobasal die is geopend voor meer dan een maand anders overleving van de cel lager zal zijn.

Warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (HiFBS) of paard serum (HiHS)

Om warmte-inactiveren FBS of GS, warmte bij 56 ° C in een waterbad gedurende 30 minuten. Schud de fles ongeveer elke 10 minuten of zo. (Gebruik Voor nauwkeurigheid een fles van vergelijkbare grootte gevuld met water. Plaats een thermometer in het water fles om te zien wanneer 56 ° C is bereikt. Begin timing op dit punt.) Warmte-geïnactiveerd FBS moet mogelijk worden gecentrifugeerd om duidelijke precipitaten, en kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opnieuw ingevroren bij -20 ° C.

L-Glutamine

Altijd dooi een verse hoeveelheid van L-glutamine voor elk experiment.

B27

Aliquots van B27 kan worden bewaard bij 20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.

Discussion

We hebben beschreven een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen uit embryonale rat ruggenmerg. Deze procedure is routinematig gebruikt in ons lab om op betrouwbare wijze voor te bereiden neuronen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon begeleiding te bestuderen. Voor celbiologie en immunochemie experimenten, dissectie van een nest produceert voldoende neuronen. Wanneer er meer cellen nodig zijn, kunnen dergelijke zoals in veel biochemie experimenten, dissectie van twee nestjes nodig zijn. Voor een getraind persoon, kan dissectie en dissociatie van ~ 20 embryo's worden uitgevoerd in minder dan 4 uur. Langere termijnen zal resulteren in een moeilijkere dissectie van ruggenmerg als gevolg van veranderingen in weefsel integriteit, en kan ook gevaar effectief herstel van levensvatbare neuronen.

Bij het uitvoeren van de procedure voor de eerste keer, plaat cellen op verschillende PLL-gecoate oppervlakken (met zuur gewassen glazen dekglaasjes, weefselkweek gerechten) ter vergelijking. Normaal gesproken moet robuust cellen hechten aan PLL-gecoate kunststof weefsel cultuur gerechten of multi-well platen. Deze kan worden gebruikt als een algemene controle voor de levensvatbaarheid van de cellen en het onderhoud als er problemen zijn met celadhesie en de groei op glas dekglaasjes. De belangrijkste factor die verantwoordelijk is voor de slechte cel adhesie aan glas is de kwaliteit van het glas en dekglaasje reiniging (zuur-wassen en steriliseren). Dit zal gevolgen hebben celadhesie gedeeltelijk door het verminderen van de PLL-coating efficiency. Andere veel voorkomende factoren zijn onder meer slechte PLL-coating (coating tijd te kort of PLL oplossing te oud), bacteriële of schimmelinfectie, of het gebruik van media of supplementen die zijn oude of vervallen.

We hebben gebruik gemaakt commissural neuron culturen bereid volgens deze procedure in verschillende type experimenten, waaronder immunochemie, biochemie, en draaien assays (Yam et al.. 2009). Opmerkelijk, commissural neuronen uitgeplaat op PLL-gecoat glas behouden de mogelijkheid om te reageren op begeleiding signalen, dat wil zeggen, ze zullen hun richting van groei veranderen als reactie op een toegepaste chemotropic factor, zoals Sonic Hedgehog, eerder aangetoond dat een axon begeleiding cue worden ( Charron et al., 2003; Okada et al., 2006; Yam et al. 2009; Fabre et al., 2010).. Daarom is dit een krachtig systeem om het effect van axon begeleiding cues in vitro onderzoek en maakt het mogelijk voor experimenten die niet mogelijk zijn in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium, liquid	Invitrogen	21103-049	See Recipes and Comments
B27 supplement 50X	Invitrogen	17504	See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P4707
L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-070
Trypsin 2.5% (10X)	Invitrogen	15090-046
DNAse I, 25000 U/mL	Worthington Biochemical
MgSO4	Sigma-Aldrich	M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free	Invitrogen	14170-112
L-glutamine 200mM, liquid	Invitrogen	25030-081	See Recipes and Comments
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I) E13 pregnancy-staged rat Ethanol 70% Surgical scissors, Fine Science Tools Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools Petri dishes L-15 medium Dissection microscope, Leica Plastic transfer pipettes Microscissors, Fine Science Tools Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools Heat-inactivated Horse Serum (HiHS) 15 ml plastic tubes Commissural neuron culture (see also Table I) Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled) German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes Poly-L-lysine, Sigma Sterile milliQ H2O Neurobasal, Invitrogen Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS) L-Glutamine B27, Invitrogen Penicillin/Streptomycin antibiotics 37°C waterbath Sterile Pasteur Pipettes Bunsen gas burner HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen DNAse, Worthington MgSO4 Centrifuge Hemacytometer Trypan Blue Solution