Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Summary

Den här videon demonstrerar en metod att dissekera och kultur commissural nervceller från E13 råtta rygg ryggmärgen. Dissocierade commissural nervceller är användbara för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av axon tillväxt och vägledning.

Abstract

Commissural nervceller har ofta använts för att undersöka mekanismerna bakom axonet vägledning under embryonal ryggmärgen utveckling. Cellen organ i dessa nervceller är belägna i rygg ryggmärgen och deras axoner följa stereotypa banor under fosterutvecklingen. Commissural axoner ursprungliga projektet ventralt mot floorplate. Efter att ha korsat mittlinjen, dessa axoner tur anteriorly och projekt mot hjärnan. Vart och ett av dessa steg är reglerad genom inverkan av flera vägledning signaler. Kulturer höganrikat i commissural nervceller är idealiska för många experiment behandlar mekanismer axonet pathfinding, inklusive vrida analyser, immunkemi och biokemi. Här beskriver vi en metod för att dissekera och kultur commissural nervceller från E13 råtta rygg ryggmärgen. För det första är ryggmärgen isolerade och rygg strips är dissekeras ut. Den dorsala vävnaden är då särskiljas i en cell avstängning av trypsinization och mekaniska störningar. Nervceller är klädd på poly-L-lysin-belagda glas täckglas eller vävnad-kultur rätter. Efter 30 timmar

Protocol

1. Dissektion av embryonala råtta dorsal ryggmärgen

Allmänna rekommendationer

Håll L-15 medium på isen och ofta byta mediet i dissekering skålen för att hålla embryon sval. Detta hjälper till att bevara vävnad integritet. Alla steg utförs med två par Dumont # 5 pincett om inget annat anges. Att undvika kontaminering, spraya alla verktyg och arbetsytor med 70% etanol och hålla dissektion medelstora försluten. För att överföra embryon mellan rätter, använd en pipett skära plast eller en perforerad sked. Det är viktigt att inte skada ryggmärgen (nicking, stretching) att framgångsrikt slutföra dissekering.

Förberedelser

• Kall L-15 medelstora
• 50 ml av L-15 + 10% värmeinaktiveras häst serum (HiHS). Håll på is.

Ryggmärgen dissektion

1. Euthanize en E13 graviditet iscensatt råtta (E0 = första dagen efter parning dag) med en CO ₂ kammare enligt institutionens riktlinjer.
2. Spray 70% etanol på buken. Nyp och dra upp huden på nedre delen av buken med pincett och skär med kirurgisk sax. Upprepa för att skära igenom muskeln och peritoneal lager för att nå bukhålan. Skapa en V-form snitt genom att skära vävnad längs sidorna av buken, upp till bröstkorgen. Lyft och dra tillbaka vävnaden att exponera bukhålan.
3. Livmodern är fäst på tre platser: i nedre mitten buken, och både övre laterala hörn. Lyft livmodern genom att ta tag i vävnaden mellan embryonala säckar. Skär bindväv för att ta bort livmodern och lägg i en petriskål fylld med L-15 på is.
4. I nästa steg görs under en dissektion mikroskop. Att separera ett embryo från extraembryonic vävnader och embryonala membran, greppa vävnad mellan uterus säckar med en pincett,. Med det andra paret, klämma mer transparent sidan av sac att skära igenom de ytliga membran (den mörkare sidan är moderkakan). Pressa ut embryot genom att försiktigt trycka moderkakan sidan av SAC. Ta bort alla embryon och placera i en petriskål fylld med L-15 på is.
5. Placera ett embryo i en 10 cm petriskål fylld med iskallt L-15. Använda microscissors, skära bort huvudet och bakre delarna på vinklar som visas i figur 1a.
   
   Kapning på dessa vinklar hjälper placera embryot när den placeras "ventral nedåt".
   
   
6. Placera embryot "ventrala nedåt" (anterior pekar bort, bakre pekar mot försöksledaren) (fig. 1b).
7. Håller kvar embryo från en sida, med hjälp av pincett för att "ringa in" ett embryo (fig 1c). Flytta inte pincett, eftersom det kommer slita vävnad. Med andra pincett, dra av huden som täcker ryggen av embryot börjar från regionen i mellan "innehav" peang (fig 1d-E). Detta kommer att utsätta ryggmärgen som på denna punkt, är lindade med membran (hjärnhinnorna).
   
   Ta huden från sidorna snarare än uppifrån ryggmärgen att undvika nicking ryggmärgen.
   
   
8. Delvis loss vävnaden till höger sida av ryggmärgen (fig. 1f). Börja i nivå med innehavet pincett, peta vävnaden med slutna pincett, så nära som möjligt till ryggmärgen. Sedan, sakta öppnar pincett för att riva vävnaden. Detta bör ta bort dorsalrotsganglier (DRG) från ryggmärgen, och bör också störa ventrala organ. Lämna lite vävnad fäst vid den främre och bakre ändar. Lämnar vävnad bifogas ger tyngd till embryot, vilket förhindrar den från att dras uppåt under nästa steg. Dessutom är att vävnaden används för att hålla fast vid embryo i senare steg.
9. Från den främre änden, använd krok-formade volfram nål för att klippa hjärnhinnorna och öppna ryggmärgen längs roofplate (fig. 1g).
10. Rotera embryot 180 grader (bakre pekar bort, främre pekar mot försöksledaren) (fig. 1h).
    
    Detta gör att försöksledaren att använda samma hand för att ta bort vävnad från andra sidan av embryot.
    
    
11. Håll embryot genom att ta tag på den tidigare fristående sida och störa vävnad från den återstående sidan med samma metod (se 1.8.). När du är klar, helt ta bort vävnaden på båda sidor av ryggmärgen.
    Alternativ: Helt loss vävnad kvar på vänster sida, men lämna en del vävnad fäst vid den främre och bakre änden på höger sida. Detta kan ibland bidra till att upprätthålla ryggmärgen på plats i steg 1,12.
12. Placera ryggmärgen på sidan och ta bort de flesta av de återstående mesenkymala vävnaden och DRG (fig. 1i).
13. I det här steget, hjärnhinnorna och ryggmärgen finns två "blad" av vävnad apposed på varandra. Pin ner större, främre-mesta delen av ryggmärgen, och dra av ett kort segment av hjärnhinnor från ryggmärgen motsvarandeD (figur 1j, vänster). Nu håller två skilda segment genom att ta tag i med tång, och dra av hjärnhinnorna med en mjuk, konstant rörelse (fig. 1j).
    Ojämn "peeling" kommer att leda till brott på ryggmärgen och / eller hjärnhinnorna skikt. Det är oftast inte att återställa den del av ryggmärgen fortfarande sitter hjärnhinnorna.
14. Med hjälp av en plast pipett de isolerade ryggmärgen till en petriskål som innehåller L-15 + 10% HiHS och lämnar på is. Normalt är ryggmärgen av alla embryon insamlats före dissekera rygg portioner.

Dorsal ryggmärgen dissektion

15. Placera en ryggmärgen i en petriskål som innehåller L-15 10% HiHS, liggande i en "öppen bok" konfiguration. Skär bort de större, främre delen (som omfattar en del av hindbrain) (fig. 1k).
16. Den dorsala vävnaden är beläget i den laterala-de flesta delar av ryggmärgen (fig. 1l, vänster). Samtidigt sätter sladden med en rak volfram nål, använd L-formade volfram nål för att skära ut en remsa som är 1/5th bredden halv ryggmärgen. (Fig. 1l, höger). Placera rygg remsorna i ett 15 ml plaströr som innehåller L-15 + 10% HiHS på is.
    Dorsal neuralröret delar av ~ 12 E13 embryon kommer att ge ~ 3,5 till 4.000.000 celler för plätering efter dissociation. Fler celler kan erhållas genom att utföra en grov dissekering av rygg ryggmärgen (skärning bredare rygg band), men commissural neuron renhet kommer att minska.

2. Commissural neuron kultur

Allmänna rekommendationer

Alla steg skall utföras under sterila förhållanden i en vävnad kultur huva inte annat anges. Använd färska medelstora och färska tinade kosttillskott och reagens. Den dissociation och steg trituration utförs i Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-fri} HBSS att minimera Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-beroende} vidhäftning.

Förberedelser

• belagda täckglas (använda tyska Desag glas) eller vävnad plattor kultur (se beläggning procedur nedan).
• varma Neurobasal Plating Media (se nedan), i vävnadskultur rätter och CO ₂ jämvikt i vävnadsodling inkubatorn i minst 1,5 timmar före plätering.
• 2,5% trypsin i 37 ° C vattenbad
• 2 flaskor HBSS Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-fria,} ett vid 4 ° C, en vid 37 ° C.
• två brand-polerat glas Pasteur pipetter en med en diameter hälften av den vanliga storleken, och en med en diameter något mindre än hälften. Använd steriliserade Pasteur pipetter. För att brand-polera pipetter, använd en Bunsenbrännare (överst i ljusblå låga) för att smälta spetsen minska något i diameter. Eftersom detta steg utförs utanför vävnadsodling huva, spraya pipetter med 70% etanol innan den placeras under vävnadsodling huven. För mer effektiv återvinning av nervceller, belägga Pasteur pipetter med media som innehåller serum före början av dissociation eller strax innan trituration steget (fyll pipetter med media och hålla i 30 sekunder). Detta hindrar cellerna från att fastna på insidan av pasteurpipett under trituration.
• sterilt milliQ vatten för att tvätta PLL-belagda rätter eller täckglas
• 12,5% MgSO ₄ lösning i HBSS

Poly-L-lysin beläggning

Om du använder glas täckglas, syra-tvätt i 24 timmar och sterilisera före bordläggning (se Kaech och Banker, 2006). Använd tyska täckglas Desag glas.

Att belägga poly-L-lysin på glas täckglas eller plast vävnad rätter kultur:

• under en vävnadskultur huva, täcka ytor med en liten kupol på 100 ug / ml PLL lösning för 1,75-2 timmar.
• Tvätta två gånger med milliQ vatten i minst 5 minuter per tvätt (kan utföras under cellen dissociation steg nedan).
• förvaras i vatten tills de ska användas. Låt inte PLL-belagda ytan torr.
  För att minska PLL slöseriet för täckglas beläggning, placera täckglas i steril bakteriell petriskålar. Päls och tvätta täckglasen genom att placera en kupol av vätska på täckglas. Den bakteriella petriskålar är hydrofoba, så att vätskan bör förbli på glaset täckglas. Överför täckglas till rätter vävnadsodling strax före bordläggning cellerna.
  För nervceller pläterade på plastskålar vävnadsodling är vidhäftning normalt högre, kan alltså neurite förlängning att försvagas.

Dissociation och plätering

1. Kontrollera att rygg-band har lugnat ner sig till botten av röret. Ta bort de flesta av de L-15 10% HiHS med pasteurpipett. Snabbt tvätta dorsala neuralröret band en gång genom att tillsätta 3 ml kall (4 ° C) HBSS.
2. Låt den dorsala neuralröret remsor nöja sig med 2 minuter, ta sedan bort HBSS med en pasteurpipett.
3. Tillsätt varmt (37 ° C) HBSS till en volym på 4,7 ml. Thöna lägger 0,3 ml 2,5% trypsin ger en slutlig koncentration av 0,15% trypsin.
4. Inkubera vid 37 ° C i vattenbad under 7 min. Blanda en gång försiktigt halvvägs genom inkubation.
5. Tillsätt 30 l DNAse (25 000 U / ml) för en slutlig koncentration av 150 U / mL. Tillsätt 60 ìl MgSO ₄ och blanda kort, för en slutlig koncentration av 0,15%.
   För vävnad från grov dissektioner, inkubera i en extra 1 minut vid 37 ° C i vattenbad.
   
   I detta skede bör dorsala neuralröret sektioner vara fragmenterad. Om dorsala neuralröret avsnitt inte har börjat fragment, betyder det oftast att 2,5% trypsin beståndet är gamla och nya stock ska tinas, eller tvätta med kallt HBSS inte effektivt ta bort HiHS från provet.
6. Centrifugera vävnaden fragment på 200 g för 4 min.
7. Avlägsna supernatanten med en pasteurpipett, lämnar ~ 50-100 l vätska i botten av röret.
8. Flick röret försiktigt för att lossa pellets, sedan tvätta cellerna genom att tillsätta 5 ml varmt HBSS. Låt lösa i rumstemperatur i 2 min.
9. Centrifugera vid 200 gi 5 min.
10. Avlägsna supernatanten med en pasteurpipett, lämnar ~ 50-100 l vätska i botten av röret.
11. Flick röret försiktigt för att lossa pellets och delvis återsuspendera cellerna. Tillsätt sedan 2 ml varmt HBSS.
12. Använd den lilla (halv-diameter) brand-polerat glas pasteurpipett att skilja cellerna genom att långsamt pipettera upp-och-ned 4-6 gånger. Undvik att bubblor och pipett vätskan mot sidan av röret. Inte över-mal sönder.
13. Använd den minsta brand-polerat glas pasteurpipett att ytterligare separera celler genom att långsamt pipettera upp och ned 3-4 gånger. Undvik att bubblor och pipett vätskan mot sidan av röret. Inte över-mal sönder.
    För vävnad från grov dissektioner, lägga till en extra 1 ml varmt HBSS till röret i slutet av dissociation.
    När isär cellerna, är det inte nödvändigt att särskilja alla cellen klumpar och aggregat. Stoppa pipettera upp-och-ner eller byta till en pasteurpipett med en mindre diameter om du ser någon ytterligare minskning av storleken på cellen aggregat med ytterligare pipettering.
14. Låt eventuell kvarvarande vävnad fragment bosätta sig i röret i 1 min. Det är inte nödvändigt att överföra celler till ett nytt rör.
15. Ta 20 l cellsuspension och tillsätt 5 ìl trypan blått. Räkna celler i ett haemocytometer.
    Nervceller bör vara ≥ 95% livskraftiga genom trypan blå utslagning.
16. Plate nervceller i Neurobasal Plating Media (se recept nedan).
    • Förslag på bordläggning densiteter för att få isolerade nervceller (low-density kulturer för att undvika nervceller klumpar eller överlappar varandra):
    • 120 000 - 180 000 celler / bra för en 6 brunnar
    • 60 000 - 75 000 celler / bra för en 12 brunnar
17. 16-18 timmar senare Byt till Neurobasal Growth Media (se recept nedan)
    Använd inte en vakuumpump för att aspirera media från kulturen skålen vid byte av media, försiktigt använda en pipett. Detta undviker rubbas nervceller.

Representativa resultat:

Fyra timmar efter förkromning bör nervceller har anslutit sig till poly-L-lysin (PLL)-belagda ytan. Enligt faskontrast belysning, levt cell organ är vanligtvis relativt platt och oval (fig. 2a). Celler som inte har väl anslutit sig som sfärer som rör sig något när skålen är mycket försiktigt knackade på sidan. Många faktorer kan potentiellt hindra vidhäftning av celler (se diskussion).

Efter 30 timmar in vitro har de flesta nervceller förlängs en ​​axon med en synlig tillväxt kotte (fig. 2c, d). Om dålig axonal tillväxt observeras kontrollera att Neurobasal Tillväxten Media har gjorts med färska medelstora och kosttillskott. Nervceller förblir friska i minst sex dagar under dessa villkor. Detta förfarande har visat sig tillförlitligt ge förberedelser höganrikat i commissural nervceller, med ~ 90% av nervceller som uttrycker DCC (Yam et al. 2009). Bredden på rygg ryggmärgen band som används för att förbereda cellsuspension kommer att påverka renheten av kulturen, med större renhet när tunnare remsor används. Ett exempel programmet visas i figur 3 (immunofluorescens). Se artikeln av Yam et al. (2009) för fler exempel.

Figur 1. Schema av spinal steg sladd dissekering. D = bröst-, V = på magen. Klicka här för att se en större figur.

Figur 2. Representativt resultat av isolerade commissuralnervceller pläterade på en PLL-belagt glas täckglas. a, b) 4 timmar efter plätering, har nervceller anslutit sig till ytan. Bar = 20 mikrometer. c, d) 30 timmar efter plätering, har de flesta nervceller förlängs en axon med en synlig tillväxt kon. Bar = 20 mikrometer.

Figur 3. En commissural neuron immunostained för gamma-tubulin (grön), med F-aktin märkas av phalloidin (F-aktin, röd) och kärnan av DAPI (blå).

Recept och kommentarer

Neurobasal Plating Media

• Neurobasal
• 10% Värmeinaktiverade FBS (HiFBS)
• 2 mM L-glutamin (från 200 mm stamlösning)
  Tillval: Penicillin / streptomycin antibiotika (hälften av det normala koncentrationen)

Neurobasal Tillväxt Media

• Neurobasal
• B27 (1 / 50 utspädning från lager)
• 2 mM L-glutamin (från 200 mm stamlösning)
• Tillval: Penicillin / streptomycin antibiotika (hälften av det normala koncentrationen)
  
  När media är gjord, kan den förvaras vid 4 ° C i två veckor. Att balansera temperaturen och pH-värdet i media innan plätering cellerna, media rum i Petri vävnadsodling rätter och placera i en vävnadsodling inkubator i minst 1,5 timmar.

Neurobasal

Efter en flaska Neurobasal mediet har öppnats, kan den förvaras i en månad vid 4 ° C i mörker. Kasta Neurobasal som har öppnats för mer än en månad annars cellöverlevnad blir lägre.

Värmeinaktiverade fetalt bovinserum (HiFBS) eller häst serum (HiHS)

För att värma-inaktivera FBS eller HS, värme vid 56 ° C i ett vattenbad under 30 minuter. Snurra flaskan ungefär var 10 minuter eller så. (För noggrannhet använder en flaska av liknande storlek fylld med vatten. Placera en termometer i vattenflaskan för att se när 56 ° C uppnås. Börja timing på denna punkt.) Värmeinaktiverade FBS kan behöva centrifugeras för att klara utfällningar och kan alikvoteras och frysas vid -20 ° C.

L-glutamin

Alltid tina en ny delmängd av L-glutamin för varje experiment.

B27

Alikvoter av B27 kan hållas vid 20 ° C för långtidsförvaring eller vid 4 ° C i upp till en månad.

Discussion

Vi har beskrivit en metod för att dissekera och kultur commissural nervceller från embryonala råtta ryggmärgen. Detta förfarande har använts rutinmässigt i våra labb på ett tillförlitligt sätt förbereda nervceller för att studera de cellulära och molekylära mekanismer av Axon vägledning. För cellbiologi och experiment immunkemi, dissektion av en kull producerar tillräckligt med nervceller. När fler celler behövs, kan till exempel i många biokemi experiment, dissekering av två kullar krävas. För en person med utbildning, kan dissektion och dissociation av ~ 20 embryon skall utföras på mindre än 4 timmar. Längre tidsskalor kommer att resultera i en svårare dissekering av ryggmärgen på grund av förändringar i vävnad integritet, och kan också äventyra en effektiv indrivning av livskraftiga nervceller.

När du utför proceduren för första gången, platta celler på olika PLL-belagda ytor (syratvättad glas täckglas, vävnadskultur rätter) för jämförelse. Normalt bör celler bifoga kraftigt till PLL-belagda kultur plast vävnad rätter eller flera bra plattor. Detta kan användas som en generell kontrollera cellviabiliteten och underhåll om det finns problem med cell adhesion och tillväxt på glas täckglas. Den viktigaste faktorn bakom stackars cell vidhäftning mot glas är kvaliteten på glaset och täckglas rengöring (syra-tvätt och sterilisering). Detta kommer att påverka cellens vidhäftning delvis genom att minska PLL-beläggning effektivitet. Andra vanliga faktorer är dålig PLL-beläggning (ytbehandling för kort eller PLL-lösning för gammal), bakterie-eller svampinfektioner kontamination, eller användning av media eller kosttillskott som är gamla eller gått ut.

Vi har använt commissural neuron kulturer upprättats i enlighet med detta förfarande i flera typer av experiment, bland annat immunkemi, biokemi, och vrida tester (Yam et al. 2009). Anmärkningsvärt, commissural nervceller pläterade på PLL-belagt glas kvar möjligheten att svara på vägledning ledtrådar, det vill säga, kommer de att ändra sin riktning tillväxt som svar på en tillämpad chemotropic faktor, som Sonic Hedgehog, som tidigare visat sig vara ett axon vägledning kö ( Charron et al, 2003; Okada et al, 2006; Yam et al 2009; Fabre et al, 2010).. Därför är detta ett kraftfullt system för att studera effekten av axonet vägledning signaler in vitro och ger möjlighet till experiment som inte är möjliga in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium, liquid	Invitrogen	21103-049	See Recipes and Comments
B27 supplement 50X	Invitrogen	17504	See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P4707
L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-070
Trypsin 2.5% (10X)	Invitrogen	15090-046
DNAse I, 25000 U/mL	Worthington Biochemical
MgSO4	Sigma-Aldrich	M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free	Invitrogen	14170-112
L-glutamine 200mM, liquid	Invitrogen	25030-081	See Recipes and Comments
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I) E13 pregnancy-staged rat Ethanol 70% Surgical scissors, Fine Science Tools Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools Petri dishes L-15 medium Dissection microscope, Leica Plastic transfer pipettes Microscissors, Fine Science Tools Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools Heat-inactivated Horse Serum (HiHS) 15 ml plastic tubes Commissural neuron culture (see also Table I) Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled) German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes Poly-L-lysine, Sigma Sterile milliQ H2O Neurobasal, Invitrogen Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS) L-Glutamine B27, Invitrogen Penicillin/Streptomycin antibiotics 37°C waterbath Sterile Pasteur Pipettes Bunsen gas burner HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen DNAse, Worthington MgSO4 Centrifuge Hemacytometer Trypan Blue Solution