La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Summary

Este vídeo demuestra un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. Disociada neuronas comisurales son útiles para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento axonal y orientación.

Abstract

Las neuronas comisurales han sido ampliamente utilizados para investigar los mecanismos subyacentes de guiado de los axones durante el desarrollo embrionario de la médula espinal. Los cuerpos celulares de estas neuronas se encuentran en la médula espinal dorsal y sus axones siguen trayectorias estereotipados durante el desarrollo embrionario. Axones de la comisura ventral proyecto inicialmente a la placa del piso. Después de cruzar la línea media, estos axones a su vez hacia adelante y proyectarse hacia el cerebro. Cada uno de estos pasos está regulado por la acción de las señales de orientación varias. Culturas altamente enriquecido en las neuronas comisurales son ideales para muchos experimentos abordar los mecanismos de pathfinding axón, incluidos los ensayos de inflexión, inmunoquímica y bioquímica. Aquí se describe un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas E13 dorsal. En primer lugar, la médula espinal está aislado y tiras dorsales son diseccionados. El tejido dorsal luego se disocia en una suspensión de células por tripsinización y disrupción mecánica. Las neuronas son sembradas en cubreobjetos de vidrio con poli-L-lisina o placas de cultivo de tejidos. Después de 30 horas

Protocol

1. La disección de la médula espinal de ratas embrionarias dorsal

Recomendaciones generales

Mantenga medio L-15 en el hielo y con frecuencia cambian el medio en el plato de la disección para mantener los embriones frescos. Esto ayuda a preservar la integridad del tejido. Todos los pasos se llevan a cabo con dos pares de pinzas Dumont # 5 menos que se indique. Para evitar la contaminación, pulverizar todas las herramientas y superficies de trabajo con etanol 70% y mantener la disección botella medio cerrado. La transferencia de embriones entre los platos, use una pipeta de plástico cortado o una cuchara perforada. Es fundamental para no dañar la médula espinal (muescas, estiramiento) para completar con éxito la disección.

Preparación

• Fría medio L-15
• 50 ml de L-15 + inactivado por calor, 10% suero de caballo (HiHS). Mantener en hielo.

La disección de la médula espinal

1. La eutanasia a un E13 con el embarazo por etapas rata (E0 = primer día siguiente a día de apareamiento), con una cámara de CO ₂ de acuerdo con las directrices institucionales.
2. Rocíe el 70% de etanol en el abdomen. Pellizcar y levantar la piel de la región inferior del abdomen con una pinza y se corta con tijeras quirúrgicas. Repita la operación para cortar a través de los músculos y capas del peritoneo para llegar a la cavidad abdominal. Crear una incisión en forma de V por el corte de tejidos a lo largo de los lados del abdomen, hasta el tórax. Levante y tire de nuevo el tejido para exponer la cavidad abdominal.
3. El útero está conectado en tres lugares: en el abdomen inferior central, y en ambas esquinas laterales superiores. Levante el útero por el acaparamiento de los tejidos entre los sacos embrionarios. Cortar el tejido conectivo para extirpar el útero y el lugar en una placa de Petri llena de L-15 en el hielo.
4. Los siguientes pasos se realizan bajo un microscopio de disección. Para separar un embrión a partir de los tejidos y las membranas extraembrionarias embrionarias, toma el tejido entre los sacos de útero con un par de pinzas,. Con el otro par, una pizca el lado más transparente de la bolsa para cortar a través de las membranas superficiales (el lado más oscuro es la placenta). Exprima el embrión presionando suavemente el lado de la placenta de la bolsa. Quite todos los embriones y el lugar en una placa de Petri llena de L-15 en el hielo.
5. Lugar de un embrión en una placa de Petri de 10 cm llena con helado de L-15. Utilizando micro tijeras, corte la cabeza y las partes posteriores de ángulos que se muestran en la figura 1a.
   
   De corte en estos ángulos ayudará a la posición del embrión cuando se coloca "cara ventral hacia abajo".
   
   
6. La posición del embrión "cara ventral hacia abajo" (apuntando en dirección anterior, posterior apuntando hacia el experimentador) (fig. 1b).
7. Sostenga firmemente el embrión de un lado, utilizando las pinzas para "precisar" el embrión (Fig. 1C). No mueva las pinzas, ya que se rompa el tejido. Con el otro par de pinzas, retire la piel que cubre la parte posterior del embrión a partir de la región entre el "holding" forceps (fig 1d-e). Esto expondrá la médula espinal que, en este momento, está envuelta por las membranas (meninges).
   
   Coge la piel de los lados en lugar de por encima de la médula espinal para evitar cortes en la médula espinal.
   
   
8. Parcialmente separar el tejido en el lado derecho de la médula espinal (Fig. 1F). Comenzando por el nivel de la pinza, tenencia, meter el tejido con una pinza cerrada, lo más cerca posible a la médula espinal. A continuación, abra lentamente la pinza a desgarrar el tejido. Esto debería desprenderse de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) de la médula espinal, y también debería afectar órganos ventral. Deje un poco de tejido unidos en los extremos anterior y posterior. Tejido Dejar conectado añade peso a la del embrión, impidiendo así que se tira hacia arriba durante el siguiente paso. Además, el tejido que se utiliza para mantener al embrión en pasos posteriores.
9. A partir de la parte anterior, el uso de la aguja de tungsteno en forma de gancho para cortar las meninges y la médula espinal abierta a lo largo del roofplate (Fig. 1G).
10. Gire el embrión de 180 grados (posterior apuntando hacia afuera, apuntando hacia el experimentador anterior) (fig. 1 h).
    
    Esto le permite al investigador a utilizar la misma mano para separar el tejido desde el otro lado del embrión.
    
    
11. Retener el embrión agarrándose la cara previamente separados, y destruir el tejido de la parte restante usando el mismo método (ver 1.8.). Cuando haya terminado, desconecte por completo los tejidos de ambos lados de la médula espinal.
    Alternativa: Totalmente separar el tejido que queda en el lado izquierdo, pero dejar un poco de tejido adherida en el extremo anterior y posterior del lado derecho. Esto a veces puede ayudar a mantener la columna vertebral en la posición en el paso 1.12.
12. Lugar de la médula espinal de su lado y eliminar la mayor parte de el resto del tejido mesenquimal y GRD (fig. 1i).
13. En este paso, las meninges y la médula espinal son dos "hojas" de tejido se ponga de una sobre la otra. Precisar la más grande, anterior-la mayoría de la porción de la médula espinal, y se desprenda un segmento corto de meninges espinales de la cord (Fig. 1j, izquierda). Ahora, espera que los dos segmentos separados por el acaparamiento de todo con pinzas, y se desprenda de las meninges con un movimiento suave y constante (Fig. 1j).
    Desigual "peeling" dará lugar a la rotura de la médula espinal y / o la capa de las meninges. Generalmente no es posible recuperar la parte de la médula espinal todavía unido a las meninges.
14. Con una pipeta de plástico, la transferencia de la médula espinal aislada de una placa de Petri que contiene L-15 HiHS + 10% y dejar en el hielo. Normalmente, la médula espinal de todos los embriones son recogidos antes de la disección de las partes dorsal.

La disección dorsal de la médula espinal

15. Un lugar de la médula espinal en una placa de Petri que contiene L-15 +10% HiHS, acostado en un "libro abierto" de configuración. Corte la más amplia, la porción anterior (que incluye parte del cerebro posterior) (fig. 1k).
16. El tejido dorsal se encuentra en las partes laterales-la mayoría de la médula espinal (Fig. 1 litro, a la izquierda). Aunque fijando el cable con una aguja de tungsteno recta, utilice la aguja de tungsteno en forma de L para cortar una franja que se 1/5o el ancho de la mitad de la médula espinal. (Fig. 1 litro, a la derecha). Coloque las tiras de dorsal en un tubo de plástico de 15 ml que contiene 15 L-+ HiHS 10% sobre el hielo.
    Dorsal secciones del tubo neural de los embriones E13 ~ 12 ~ dará 3,5 hasta 4 millones de células de revestimiento después de la disociación. Más células se pueden obtener mediante la realización de una disección grueso de la médula espinal dorsal (dorsal cortando tiras más anchas), pero la pureza de neuronas comisurales se verá reducida.

2. Comisural neurona cultura

Recomendaciones generales

Todos los pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos a menos que se indique lo contrario. Use un nuevo medio y suplementos recién descongelado y reactivos. La disociación y los pasos se llevan a cabo la trituración de Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} libre de HBSS para minimizar el Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-dependiente} de la adhesión.

Preparación

• cubreobjetos recubiertos (el uso de vidrio Desag alemán) o placas de cultivo (véase el procedimiento de recubrimiento por debajo).
• calentar el medio de Revestimiento Neurobasal (ver más abajo), en placas de cultivo de tejidos y el CO ₂ se equilibraron en el cultivo de tejidos incubadora por lo menos 1,5 horas antes de enchapado.
• 2,5% de tripsina en el baño de agua a 37 ° C
• 2 botellas de HBSS Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} libre, uno a 4 ° C, uno a 37 ° C.
• dos al fuego cristal pulido pipetas Pasteur uno con un diámetro la mitad del tamaño normal, y uno con un diámetro ligeramente inferior a la mitad. Use esterilizados pipetas Pasteur. Para disparar a pulir las pipetas, use un mechero de Bunsen (la parte superior de la llama de color azul claro) para derretir la punta para reducir ligeramente el diámetro. Debido a que este paso se realiza fuera de la campana de cultivo de tejidos, rocíe las pipetas con etanol al 70% antes de colocar bajo el capó de cultivo de tejidos. Para una recuperación más eficiente de las neuronas, la capa de pipetas Pasteur con los medios de comunicación que contiene el suero antes del comienzo de la disociación o justo antes del paso de trituración (llenar pipetas con los medios de comunicación y mantener durante 30 segundos). Esto evitará que las células se peguen en el interior de la pipeta Pasteur durante la trituración.
• agua estéril para el lavado de milliQ PLL recubierto platos o laminillas
• 12,5% MgSO ₄ en solución HBSS

Poli-L-lisina de revestimiento

Si se utiliza cubreobjetos de vidrio, lavado con ácido durante 24 horas y esterilizar antes de la placa (ver Kaech y Banker, 2006). Use alemán cubreobjetos de vidrio Desag.

Para cubrir poli-L-lisina en cubreobjetos de vidrio o de plástico placas de cultivo de tejidos:

• bajo una campana de cultivo de tejidos, cubrir las superficies con una pequeña cúpula de 100 ug / ml de solución para el PLL 1.75-2 horas.
• dos lavados con agua milliQ, por lo menos 5 minutos por lavado (se puede realizar durante la etapa de disociación celular a continuación).
• almacenar en el agua hasta su uso. No deje que la superficie PLL recubierto seco.
  Para reducir el desperdicio de PLL para el revestimiento de cubreobjetos, colocar el cubreobjetos en placas de Petri estériles bacteriana. Escudo y lavar los cubreobjetos mediante la colocación de un domo de líquido en el cubreobjetos. El bacteriana placas de Petri son hidrofóbicas, por lo que el líquido debe permanecer en el cubreobjetos de vidrio. La transferencia de los cubreobjetos de placas de cultivo de tejido de las placas, solo las células.
  Para las neuronas chapada en platos de plástico de cultivo de tejidos, la adhesión es normalmente más alto, por lo tanto neurite elongación podría ser disminuida.

La disociación y de las planchas

1. Verifique que las tiras dorsales se han asentado en el fondo del tubo. Eliminar la mayor parte de la HiHS L-15 +10% con una pipeta Pasteur. Lave rápidamente las bandas dorsal del tubo neural, una vez mediante la adición de 3 ml de frío (4 ° C) HBSS.
2. Deje que las tiras dorsal del tubo neural reposar durante 2 minutos, luego retire el HBSS con una pipeta Pasteur.
3. Agregar agua tibia (37 ° C) HBSS a un volumen de 4,7 ml. Tgallina añadir 0,3 ml de 2,5% de tripsina a una concentración final de 0,15% de tripsina.
4. Se incuba a 37 ° C en el baño de agua durante 7 minutos. Mezclar suavemente una vez a mitad de camino a través de la incubación.
5. Añadir 30 l DNAsa (25 000 U / mL) para una concentración final de 150 U / mL. Añadir 60 l de _MgSO4 y mezclar brevemente, para una concentración final de 0,15%.
   Para el tejido de las disecciones gruesa, se incuba durante un extra de 1 minuto a 37 ° C en el tanque.
   
   En esta etapa, las secciones dorsal del tubo neural deben ser fragmentados. Si las secciones dorsal del tubo neural no han comenzado a fragmentarse, por lo general significa que el stock de tripsina 2,5% es viejo, y nuevo stock debe ser descongelado, o el lavado con HBSS frío no eliminan eficazmente la HiHS de la muestra.
6. Centrífuga los fragmentos de tejido a 200 g durante 4 min.
7. Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, dejando ~ 50-100 l de líquido en la parte inferior del tubo.
8. Flick el tubo con cuidado para eliminar el sedimento, luego se lavan las células mediante la adición de 5 ml de HBSS caliente. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 min.
9. Centrifugar a 200 g por 5 min.
10. Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, dejando ~ 50-100 l de líquido en la parte inferior del tubo.
11. Flick el tubo con cuidado para eliminar el sedimento y en parte volver a suspender las células. A continuación, añadir 2 ml de HBSS caliente.
12. Use el pequeño (la mitad de diámetro) de vidrio pulido al fuego pipeta Pasteur para disociar las células lentamente pipetear hacia arriba y hacia abajo 4-6 veces. Evite hacer burbujas, y la pipeta del líquido contra la pared del tubo. No se exceda en triturar.
13. Use la menor de fuego cristal pulido pipeta Pasteur a disociar aún más lentamente que las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces. Evite hacer burbujas, y la pipeta del líquido contra la pared del tubo. No se exceda en triturar.
    Para el tejido de las disecciones grueso, añadir un extra de 1 ml de HBSS caliente al tubo en el extremo de la disociación.
    Cuando la disociación de las células, no es necesario disociar todos los grupos de células y agregados. Dejar de pipeteo hacia arriba y hacia abajo o el cambio de una pipeta Pasteur con un diámetro más pequeño si no ve mayor disminución en el tamaño de los agregados celulares con pipetas más.
14. Deje que los fragmentos de tejido restante se establecen en el tubo durante 1 minuto. No es necesario transferir las células a un tubo nuevo.
15. Tomar 20 l de suspensión celular y se añaden 5 l de azul de tripano. Recuento de células en un hemocitómetro.
    Las neuronas deben ser ≥ 95% viable por exclusión del azul tripano.
16. Placa de las neuronas en los medios de comunicación Plating Neurobasal (ver recetas a continuación).
    • Sugiere la densidad de placas para la obtención de neuronas aisladas de baja densidad (las culturas para evitar que las neuronas se agrupen o se superponen entre sí):
    • 120 000 - 180 000 células / pocillo de una placa de 6 pocillos
    • 60 000 - 75 000 células / pocillo de una placa de 12 y
17. 16-18 horas más tarde, cambiar los medios de comunicación a los medios de cultivo Neurobasal (ver recetas a continuación)
    No utilice una bomba de vacío para aspirar los medios de comunicación de la placa de cultivo al cambiar los medios de comunicación, con cuidado el uso de una pipeta. Esto evita que se desprenda de las neuronas.

Los resultados representativos:

Cuatro horas después de la siembra, las neuronas que se han adherido a la poli-L-lisina (PLL) con recubrimiento de superficie. Bajo la iluminación de contraste de fase, se adherían los cuerpos celulares suelen ser relativamente plana y de forma ovalada (fig. 2a). Las células que no tienen bien adheridos aparecen como esferas que se mueven un poco cuando el plato es muy suave golpecito en el lateral. Hay muchos factores que potencialmente pueden impedir la adhesión de las células (véase la discusión).

Después de 30 horas in vitro, la mayoría de las neuronas se han extendido de un axón con un cono de crecimiento visible (Fig. 2C, D). Si el crecimiento axonal pobres se observa, verificar que el medio de crecimiento Neurobasal se ha hecho con un nuevo medio y suplementos. Las neuronas se mantendrán sanos durante al menos 6 días en estas condiciones. Este procedimiento ha demostrado ser fiable para producir preparaciones altamente enriquecido en las neuronas comisurales, con aproximadamente el 90% de las neuronas que expresan DCC (Yam et al. 2009). El ancho de la franja dorsal de la médula espinal que se utiliza para la preparación de la suspensión celular afecta la pureza de la cultura, con una mayor pureza, cuando se usan las tiras más delgadas. Un ejemplo de aplicación se muestra en la Figura 3 (inmunofluorescencia). Véase el artículo de ñame y otros. (2009) para más ejemplos.

Figura 1. Esquema de la columna vertebral pasos cable de la disección. D = dorsal, V = ventral. Haga clic aquí para ver una figura más grande.

Figura 2. Resultado Representante de la comisura aisladoslas neuronas colocadas en un portaobjetos de vidrio recubierto de PLL. a, b) 4 horas después de la siembra, las neuronas se han adherido a la superficie. Bar = 20 micras. c, d) 30 horas después de la siembra, la mayoría de las neuronas se han extendido de un axón con un cono de crecimiento visible. Bar = 20 micras.

Figura 3. Una neurona comisural immunostained de gamma-tubulina (verde), con F-actina marcada por phalloidin (F-actina, de color rojo) y el núcleo de DAPI (azul).

Recetas y comentarios

Los medios de comunicación Neurobasal Plating

• Neurobasal
• 10% de SFB inactivado por calor (HiFBS)
• 2 mM L-glutamina (de 200 mM solución madre)
  Opcional: los antibióticos penicilina / estreptomicina (usar la mitad de la concentración normal)

Los medios de comunicación Neurobasal crecimiento

• Neurobasal
• B27 (1 / 50 de dilución del stock)
• 2 mM L-glutamina (de 200 mM solución madre)
• Opcional: los antibióticos penicilina / estreptomicina (usar la mitad de la concentración normal)
  
  Una vez que los medios de comunicación que se haga, puede mantenerse a 4 ° C durante dos semanas. Para equilibrar la temperatura y el pH de los medios de comunicación de las placas, las células, los medios de comunicación en el lugar de cultivo de tejidos platos Petri y colocar en un cultivo de tejidos incubadora por lo menos durante 1,5 horas.

Neurobasal

Después de una botella de medio Neurobasal ha sido abierto, se puede mantener durante un mes a 4 ° C en la oscuridad. Disponer de Neurobasal que se ha abierto desde hace más de un mes de lo contrario la supervivencia celular será menor.

Inactivado por calor suero fetal bovino (HiFBS) o suero de caballo (HiHS)

Al calor-el calor inactiva o FBS SA, a 56 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. Agitar la botella aproximadamente cada 10 minutos o así. (Para mayor precisión el uso de una botella de tamaño similar lleno de agua. Ponga un termómetro en la botella de agua para ver cuando 56 ° C se alcanza. Comience el momento en este punto.) SFB inactivado por calor puede ser necesario centrifugadas para eliminar precipitados, y puede ser en alícuotas y re-congelado a -20 ° C.

L-Glutamina

Siempre descongele una parte alícuota de la L-glutamina para cada experimento.

B27

Alícuotas de B27 puede mantenerse a 20 ° C para el almacenamiento a largo plazo, oa 4 ° C durante un máximo de un mes.

Discussion

Se ha descrito un método para analizar la cultura y las neuronas de la comisura de la médula espinal de ratas embrionarias. Este procedimiento ha sido de uso habitual en nuestro laboratorio para preparar de forma fiable las neuronas para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de guiado de los axones. Para la biología celular y los experimentos inmunoquímica, la disección de una camada produce neuronas suficientes. Cuando se necesitan más células, como en muchos experimentos de bioquímica, la disección de dos camadas pueden ser requeridos. Para una persona capacitada, la disección y la disociación de aproximadamente 20 embriones se pueden realizar en menos de 4 horas. Ya los plazos dará lugar a una disección más difícil de la médula espinal debido a cambios en la integridad del tejido, y también puede comprometer la recuperación efectiva de las neuronas viables.

Al realizar el procedimiento por primera vez, células de la placa en diferentes superficies recubiertas con PLL (lavado con ácido cubreobjetos de vidrio, platos de cultivo de tejidos) para la comparación. Normalmente, las células deben adjuntar con firmeza a la PLL recubiertas placas de cultivo de tejidos plásticos o placas de pozos múltiples. Esto puede ser usado como un control general para la viabilidad celular y el mantenimiento, si hay problemas con la adhesión celular y el crecimiento en cubreobjetos de vidrio. El principal factor responsable de la adhesión celular a los pobres de vidrio es la calidad de la limpieza de cristales y cubreobjetos (ácido-lavado y esterilización). Esto afectará a la adhesión celular en parte por la reducción de la eficiencia PLL-recubrimiento. Otros factores comunes son malas PLL-coating (recubrimiento de tiempo demasiado corto o demasiado viejo solución PLL), la contaminación por bacterias u hongos, o el uso de los medios de comunicación o suplementos que son antiguas o vencidas.

Hemos utilizado las culturas de la comisura de neuronas preparados de acuerdo con este procedimiento en varios tipos de experimentos, incluyendo la inmunoquímica, bioquímica y pruebas de giro (Yam et al. 2009). Sorprendentemente, las neuronas comisurales chapada en PLL de vidrio recubiertos de conservar la capacidad de responder a las señales de orientación, es decir, que va a cambiar la dirección de su crecimiento en respuesta a un factor quimiotrópica aplicados, tales como Sonic Hedgehog, previamente a ser una señal para guía de axones ( Charron et al, 2003; Okada et al, 2006; ñame y otros, 2009; Fabre et al, 2010).. Por lo tanto, se trata de un potente sistema para estudiar el efecto de las claves para guía de axones in vitro y permite que los experimentos que no son posibles en vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium, liquid	Invitrogen	21103-049	See Recipes and Comments
B27 supplement 50X	Invitrogen	17504	See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P4707
L-15 medium, powder	Invitrogen	41300-070
Trypsin 2.5% (10X)	Invitrogen	15090-046
DNAse I, 25000 U/mL	Worthington Biochemical
MgSO4	Sigma-Aldrich	M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free	Invitrogen	14170-112
L-glutamine 200mM, liquid	Invitrogen	25030-081	See Recipes and Comments
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I) E13 pregnancy-staged rat Ethanol 70% Surgical scissors, Fine Science Tools Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools Petri dishes L-15 medium Dissection microscope, Leica Plastic transfer pipettes Microscissors, Fine Science Tools Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools Heat-inactivated Horse Serum (HiHS) 15 ml plastic tubes Commissural neuron culture (see also Table I) Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled) German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes Poly-L-lysine, Sigma Sterile milliQ H2O Neurobasal, Invitrogen Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS) L-Glutamine B27, Invitrogen Penicillin/Streptomycin antibiotics 37°C waterbath Sterile Pasteur Pipettes Bunsen gas burner HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen DNAse, Worthington MgSO4 Centrifuge Hemacytometer Trypan Blue Solution