Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

doi: 10.3791/1773 Published: May 25, 2010
* These authors contributed equally

Summary

هذا الفيديو يوضح طريقة لتشريح والثقافة الخلايا العصبية صواري E13 من الحبل الشوكي الفئران الظهرية. فصل الخلايا العصبية صواري مفيدة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي والتوجيه.

Abstract

وقد استخدمت على نطاق واسع صواري الخلايا العصبية للتحقيق في الآليات الكامنة وراء التوجيه محوار خلال تطور الجنين في الحبل الشوكي. توجد أجسام الخلايا العصبية في هذه النخاع الشوكي الظهري والمحاور التي تتبع المسارات النمطية أثناء التطور الجنيني. محاور المشروع في البداية صواري ventrally نحو floorplate. بعد عبور خط الوسط ، وهذه المحاور الأمامية وتحويل المشروع نحو الدماغ. ينظم كل من هذه الخطوات التي عمل عدة اشارات التوجيه. هي مناسبة بشكل مثالي الثقافات عالي التخصيب في الخلايا العصبية صواري لمعالجة العديد من التجارب آليات محوار الاستطلاعية ، بما في ذلك فحوصات تحول ، كيمياء المناعة والكيمياء الحيوية. هنا ، نحن تصف طريقة لتشريح والثقافة الخلايا العصبية صواري E13 من الحبل الشوكي الفئران الظهرية. الأول ، هو عزل النخاع الشوكي وتشريح شرائط الظهرية بها. النسيج الظهرية ومن ثم فصلها الى تعليق خلية trypsinization واضطراب الميكانيكية. ومطلي على الخلايا العصبية coverslips الزجاج بولي - L - يسين المغلفة أو أطباق الأنسجة الثقافة. بعد 30 ساعة

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تشريح الفئران الجنينية الحبل الشوكي الظهري

توصيات عامة

إبقاء L - 15 متوسطة على الجليد وتغيير في كثير من الأحيان وسيلة في طبق تشريح للحفاظ على الاجنة بارد. هذا يساعد على الحفاظ على سلامة الأنسجة. يتم تنفيذ جميع الخطوات مع اثنين من أزواج من ملقط # 5 دومون ما لم يذكر. لتجنب التلوث ، رش جميع الأدوات والأسطح العمل مع الايثانول 70 ٪ والحفاظ على تشريح زجاجة مغلقة المتوسطة. لنقل الأجنة بين الأطباق ، واستخدام قطع بلاستيكية أو ماصة ملعقة مثقوبة. فمن الأهمية بمكان عدم تلف الحبل الشوكي (الخدش ، وتمتد) لإكمال بنجاح تشريح.

إعداد

  • L - 15 الباردة المتوسطة
  • 50 مل من L - 15 + المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل الحصان (HiHS). تبقي على الجليد.

تشريح الحبل الشوكي

  1. الموت ببطء an E13 بالحمل نظموا الفئران (E0 = اليوم الاول وفي اليوم التالي التزاوج) مع غرفة CO 2 وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  2. رذاذ الايثانول 70 ٪ على البطن. قرصة وسحب ما يصل إلى الجلد في منطقة أسفل البطن مع ملقط وقطع مع مقص جراحي. كرر لقطع طريق العضلات وطبقات البريتوني للوصول الى التجويف البطني. إنشاء شق على شكل V على طول طريق قطع الأنسجة الجانبين من البطن ، وتصل إلى القفص الصدري. رفع وسحب النسيج للكشف عن تجويف البطن.
  3. ويرد الرحم في ثلاثة مواقع : في البطن السفلى المركز ، وعلى كل من الزوايا الجانبية العليا. رفع الرحم عن طريق الاستيلاء على الأنسجة بين الحويصلات الجنينية. قطع النسيج الضام لإزالة الرحم ووضعه في طبق بتري مليئة L - 15 على الجليد.
  4. تتم الخطوات التالية تحت المجهر تشريح. لفصل جنين من الأنسجة والأغشية الجنينية خارج الجنين ، والاستيلاء على الأنسجة بين الحويصلات الرحم مع زوج واحد من الملقط. مع الزوج الآخر ، قرصة الجانب أكثر شفافية من الكيس الى قطع طريق الأغشية السطحية (الجانب المظلم هو المشيمة). اخراج الجنين عن طريق الضغط بلطف الجانب المشيمة من الكيس. إزالة جميع الأجنة ومكان في صحن بيتري مليئة L - 15 على الجليد.
  5. مكان واحد الجنين في طبق بتري 10 سم مملوءة الجليد الباردة 15 - L. microscissors به ​​، وقطع رأسه وبعيدا الأجزاء الخلفية في زوايا هو مبين في الشكل 1A.

    وقطع في هذه الزوايا مساعدة وضع الجنين عند وضعه "وجها لأسفل بطني".

  6. موقف الجنين "وجها لأسفل بطني" (مشيرا بعيدا الأمامي ، الخلفي لافتا نحو مجرب) (الشكل 1B).
  7. اعتقادا راسخا الجنين من جانب واحد ، وذلك باستخدام ملقط الى "دبوس أسفل" للجنين (الشكل 1C). لا تحرك الملقط ، لأنها سوف تمزق الأنسجة. مع زوج آخر من الملقط ، تقشر الجلد الذي يغطي الجزء الخلفي من الجنين بدءا من المنطقة الواقعة بين ملقط "عقد" (التين - 1D ه). وسوف يعرض هذا الحبل الشوكي ، وعند هذه النقطة ، هو التفاف بواسطة الأغشية (السحايا).

    انتزاع الجلد من الجانبين وليس من فوق الحبل الشوكي لتجنب الخدش والحبل الشوكي.

  8. فصل جزء من الأنسجة في الجانب الأيمن من الحبل الشوكي (الشكل 1F). بدءا من مستوى ملقط القابضة ، كزة النسيج مع ملقط مغلقة ، وأقرب ما يمكن إلى الحبل الشوكي. ثم فتح ببطء ملقط لتمزيق النسيج. هذا يجب فصل العقد الجذرية الظهرية (DRGs) من النخاع الشوكي ، وينبغي أن تؤدي أيضا إلى تعطيل الأجهزة البطني. ترك بعض الأنسجة تعلق في نهايات الأمامي والخلفي. الأنسجة ترك المرفقة يضيف وزنا إلى الجنين ، وبالتالي منع من ذلك يجري سحب التصاعدي خلال الخطوة التالية. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم هذا النسيج إلى الابقاء على الجنين في خطوات لاحقة.
  9. بدءا من نهاية الأمامي ، استخدم إبرة التنغستن خطاف على شكل لقطع السحايا والحبل الشوكي مفتوح على طول roofplate (الشكل 1G).
  10. تدوير الجنين 180 درجة (الخلفي لافتا بعيدا ، مشيرا الأمامي نحو مجرب) (الشكل 1H).

    هذا يسمح للمجرب لاستخدام نفس اليد لفصل الأنسجة من الجانب الآخر من الجنين.

  11. الاستمرار على الجنين عن طريق الاستيلاء على الجانب منفصلة سابقا ، وتعطيل الأنسجة المتبقية من الجانب باستخدام الأسلوب نفسه (انظر 1.8). عندما تنتهي من ذلك ، فصل تماما النسيج على كلا الجانبين من الحبل الشوكي.
    البديل : فصل تماما الأنسجة المتبقية على الجانب الأيسر ، ولكن ترك بعض الأنسجة المرفقة في نهاية الأمامي والخلفي على الجانب الأيمن. وهذا يمكن أن يساعد في بعض الأحيان الحفاظ على النخاع الشوكي في الموقف في الخطوة 1.12.
  12. مكان الحبل الشوكي على جانبها وإزالة معظم الأنسجة المتبقية والوسيطة DRGs (الشكل 1i).
  13. في هذه الخطوة ، والسحايا والحبل الشوكي وهما "ورقة" من الأنسجة apposed على بعضها البعض. دبوس باستمرار أكبر ، الأمامي معظم جزء من الحبل الشوكي ، وتقشر قطعة قصيرة من السحايا من مجلس النواب الشوكيد (الشكل 1j ، يسار). الآن ، مع الاستمرار على جزئين مفصولة عبر الاستيلاء على بالملقط ، وتقشر السحايا مع الحركة ، على نحو سلس مستمر (الشكل 1j).
    متفاوت "تقشير" سوف يؤدي إلى كسر في الحبل الشوكي و / أو طبقة السحايا. عادة ما يكون غير ممكن لاسترداد جزء من الحبل الشوكي لا تزال تعلق على السحايا.
  14. باستخدام ماصة بلاستيكية ، ونقل النخاع الشوكي لعزل طبق بتري تحتوي L - 15 + HiHS 10 ٪ وتترك على الجليد. عادة ، يتم جمع النخاع الشوكي من جميع الأجنة قبل تشريح الأجزاء الظهرية.

الظهرية تشريح النخاع الشوكي

  1. مكان واحد في النخاع الشوكي في طبق بتري يحتوي على L - 15 HiHS +10 ٪ ، والكذب شقة في تكوين "مفتوح الكتاب". قطع بعيدا الأوسع ، الجزء الأمامي (الذي يشمل جزءا من الدماغ المؤخر) (الشكل 1K).
  2. يقع الأنسجة الظهرية في الأجزاء الأكثر الاطراف من الحبل الشوكي (التين 1L ، يسار). بينما تعلق الحبل بإبرة التنغستن على التوالي ، واستخدام إبر التنغستن على شكل حرف L لقطع الشريط الذي عرض 1/5th الحبل الشوكي النصف. (الشكل 1L ، يمين). وضع شرائط الظهرية في أنبوب من البلاستيك تحتوي على 15 مل + L - 15 HiHS 10 ٪ على الجليد.
    سوف الظهرية المقاطع الأنبوب العصبي للأجنة 12 E13 ~ ~ العائد 3،5-4٬000٬000 الخلايا للتصفيح بعد التفكك. ويمكن الحصول على المزيد من الخلايا عن طريق إجراء تشريح الخشنة من النخاع الشوكي الظهري (قطع شرائح أوسع الظهرية) ، ولكن سيتم تخفيض صواري نقاء الخلايا العصبية.

2. صواري عصبون الثقافة

توصيات عامة

يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود ما لم ينص على خلاف ذلك. استخدام المكملات الغذائية الطازجة والمتوسطة طازجة المذوبة والكواشف. يتم تنفيذ الخطوات والتفكك في سحن كا 2 + / + 2 ملغ خالية HBSS لتقليل كا 2 + / 2 + المغنيسيوم التي تعتمد على الالتصاق.

إعداد

  • المغلفة coverslips (استخدام الزجاج Desag الألمانية) أو زراعة الأنسجة لوحات (انظر الداخلي طلاء أدناه).
  • دافئ وسائل الإعلام التصفيحات Neurobasal (أنظر أدناه) ، في أطباق زراعة الأنسجة ومعايرتها CO 2 في الأنسجة حاضنة للثقافة لا يقل عن 1.5 ساعة قبل الطلاء.
  • 2.5 ٪ في التربسين بالحمام المائي 37 درجة مئوية
  • 2 زجاجات من الكالسيوم HBSS 2 + / + 2 ملغ خالية ، واحد في 4 درجات مئوية ، واحد في 37 درجة مئوية.
  • اطلاق قذائف زجاج مصقول باستور ماصات واحد مع قطرها نصف الحجم المعتاد ، واحد مع قطر أصغر قليلا من النصف. استخدام ماصات باستور تعقيمها. لإطلاق النار تلميع ماصات ، استخدام الموقد بنسن (الجزء العلوي من اللهب الأزرق الخفيف) لإذابة تلميح إلى انخفاض طفيف في القطر. لأن يتم تنفيذ هذه الخطوة خارج النسيج هود الثقافة ، مع رش ماصات الايثانول 70 ٪ قبل ان يضع تحت غطاء نسيج الثقافة. لاسترداد أكثر كفاءة من الخلايا العصبية ، ومعطف من ماصات باستور مع وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل قبل بداية التفكك أو مجرد خطوة قبل سحن (ملء ماصات مع وسائل الاعلام وإبقاء لمدة 30 ثانية). وهذا يمنع الخلايا من الالتصاق إلى الداخل من خلال ماصة باستير سحن.
  • معقمة milliQ المياه لغسل الأطباق PLL المغلفة أو coverslips
  • 12.5 ٪ MgSO 4 الحل في HBSS

بولي - L - يسين طلاء

إذا باستخدام coverslips الزجاج ، وحامض غسل لمدة 24 ساعة وتعقيم قبل الطلاء (انظر Kaech وبانكر ، 2006). استخدام الزجاج Desag coverslips الألمانية.

إلى معطف بولي - L - يسين coverslips على الزجاج أو البلاستيك أطباق زراعة الأنسجة :

  • تحت غطاء محرك السيارة الأنسجة والثقافة ، وتغطي سطوح بقبة صغيرة من 100 ميكروغرام / مل حل PLL ل1،75-2 ساعة.
  • تغسل بالماء مرتين milliQ ، على الأقل 5 دقائق لكل يغسل (لا يمكن أن يؤديها خلال الخلية تفارق خطوة أدناه).
  • تخزين المياه حتى في استخدامه. لا تدع سطح PLL المغلفة الجافة.
    للحد من الهدر PLL لطلاء coverslips ، ضع coverslips في أطباق بتري معقمة البكتيرية. معطف ويغسل coverslips بوضع قبة السائل على coverslips. البكتيرية أطباق بتري ومسعور ، وبالتالي فإن السائل ينبغي أن تظل على coverslips الزجاج. نقل coverslips لزراعة الأنسجة أطباق قبل طلاء الخلايا.
    الخلايا العصبية للأطباق بلاستيكية مطلية على زراعة الأنسجة ، وعادة ما يكون أعلى التصاق ، قد يكون تقلص استطالة neurite بذلك.

تفارق وتصفيح

  1. تحقق من أن يجرد الظهرية استقروا في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة معظم HiHS L - 15 +10 ٪ مع ماصة باستور. يغسل بسرعة الظهرية شرائح الأنبوب العصبي مرة واحدة عن طريق إضافة 3 مل من البرد (4 درجات مئوية) HBSS.
  2. السماح للشرائح الأنبوب العصبي الظهري تسوية لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة HBSS مع ماصة باستور.
  3. إضافة دافئة (37 درجة مئوية) HBSS إلى حجم 4.7 مل. Tالدجاجة إضافة 0.3 مل من التربسين 2.5 ٪ لإعطاء تركيز النهائي من التربسين 0.15 ٪.
  4. احتضان عند 37 درجة مئوية في بالحمام المائي لمدة 7 دقائق. المزيج بلطف مرة واحدة في منتصف الطريق من خلال الاحتضان.
  5. إضافة 30 الدناز ميكرولتر (25 000 U / مل) لتركيز النهائي من 150 U / مليلتر. إضافة ميكرولتر من 60 MgSO 4 و المزيج لفترة وجيزة ، وذلك لتركيز النهائي من 0.15 ٪.
    لأنسجة من تشريح الخشنة ، واحتضان ل1 دقيقة اضافية في 37 درجة مئوية في بالحمام المائي.

    في هذه المرحلة ، ينبغي أن تكون مجزأة الظهرية المقاطع الأنبوب العصبي. إذا كان الأنبوب العصبي الظهري الفروع لم تبدأ تفتيت ، وهذا يعني عادة أن المخزون التربسين 2.5 ٪ قديمة ، ويجب إذابة أسهم جديدة ، أو تغسل مع HBSS الباردة لم تقم بإزالة بفعالية HiHS من العينة.
  6. الطرد المركزي شظايا الأنسجة في 200 غ لمدة 4 دقائق.
  7. إزالة طاف مع ماصة باستور ، تاركا ~ 5-10 ميكرولتر من السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  8. نفض الغبار الأنبوب برفق لتخفيف بيليه ، ثم تغسل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من HBSS الدافئة. اسمحوا يستقر عند درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  9. الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق.
  10. إزالة طاف مع ماصة باستور ، تاركا ~ 5-10 ميكرولتر من السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  11. نفض الغبار الأنبوب برفق لتخفيف بيليه وresuspend جزئيا الخلايا. ثم يضاف 2 مل من HBSS الدافئة.
  12. استخدام صغيرة (نصف القطر) النار الزجاج المصقول باستور ماصة لفصل الخلايا عن طريق pipetting ببطء ونزولا 4-6 مرات. تجنب الوقوع في فقاعات ، وماصة السائل ضد الجانب من الأنبوب. لا الإفراط في متمزج.
  13. استخدام أصغر النار الزجاج المصقول باستور ماصة لفصل الخلايا عن طريق زيادة pipetting ببطء ونزولا 3-4 مرات. تجنب الوقوع في فقاعات ، وماصة السائل ضد الجانب من الأنبوب. لا الإفراط في متمزج.
    لأنسجة من تشريح الخشنة ، إضافة اضافية 1 مل من HBSS الحارة للأنبوب في نهاية التفكك.
    عند عدم الربط بين الخلايا ، فإنه ليس من الضروري أن ننأى عن كتل الخلايا والمجاميع. pipetting وقف صعود وأسفل أو إلى تغيير ماصة باستور مع أصغر قطرها إذا كنت لا أرى أي مزيد من الانخفاض في حجم الحصى مع pipetting خلية أخرى.
  14. تدع أي شظايا الأنسجة المتبقية تسوية في أنبوب لل1 دقيقة. ليس من الضروري لنقل الخلايا إلى أنبوب جديد.
  15. يستغرق 20 ميكرولتر التعليق الخلية وإضافة 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق. عدد الخلايا في وhaemocytometer.
    وينبغي أن تكون الخلايا العصبية ≥ 95 ٪ قابلة للحياة من خلال استبعاد التريبان الأزرق.
  16. لوحة الخلايا العصبية في وسائل الاعلام التصفيحات Neurobasal (انظر صفات أدناه).
    • كثافة الطلاء للحصول على الخلايا العصبية واقترح معزولة (منخفض الكثافة الثقافات لتجنب تكتل الخلايا العصبية أو متداخلة بعضها البعض) :
    • 000 120 -- 000 180 خلية / كذلك لوحة 6 جيدا
    • 000 60 -- 000 75 خلية / كذلك عن 12 لوحة جيدا
  17. 16-18 ساعة في وقت لاحق ، وتغير وسائل الاعلام الى وسائل الإعلام النمو Neurobasal (أنظر أدناه وصفات)
    لا تستخدم مضخة فراغ لنضح وسائل الإعلام من الطبق عند تغيير ثقافة وسائل الإعلام ، واستخدام بلطف ماصة. هذا يتجنب طرد الخلايا العصبية.

ممثل النتائج :

بعد أربع ساعات من الطلاء ، وينبغي أن يكون الالتزام الخلايا العصبية للبولي - L - يسين (PLL) المغلفة السطح. تحت الإضاءة على النقيض المرحلة ، والهيئات وعادة ما تكون خلية انضمت المسطحة نسبيا وبيضاوية الشكل (الشكل 2A). الخلايا التي لم تنضم كذلك المجالات التي تبدو وكأنها تتحرك قليلا عندما يتم استغلالها بلطف شديد الطبق على الجانب. ويمكن لعوامل عديدة تعرقل احتمال التصاق الخلايا (انظر المناقشة).

بعد 30 ساعة في المختبر ، وسعت معظم الخلايا العصبية محور عصبي مع مخروط النمو مرئية (الشكل 2C ، د). إذا لوحظ نمو محواري الفقراء ، والتحقق من أنه قد تم اتخاذ وسائل الإعلام مع النمو Neurobasal متوسطة جديدة وملاحق. الخلايا العصبية لا تزال سليمة لما لا يقل عن 6 أيام في هذه الظروف. وقد أثبت هذا الإجراء لانتاج اليورانيوم عالي التخصيب موثوق الاستعدادات في الخلايا العصبية صواري ، مع ~ 90 ٪ من الخلايا العصبية معربا عن DCC (يام وآخرون 2009). وعرض الشريط الظهري في النخاع الشوكي التي يتم استخدامها لإعداد تعليق الخلية يؤثر على نقاء الثقافة ، وبمزيد من النقاء عندما تستخدم الشرائط أرق. ويظهر تطبيق المثال في الشكل 3 (المناعي). راجع مقالة كتبها يام وآخرون. (2009) لمزيد من الأمثلة.

الشكل 1
الشكل 1. مخططات من الحبل الشوكي خطوات تشريح. D = الظهرية ، V = بطني. انقر هنا لرؤية أكبر الشكل.

الشكل 2
الشكل 2. نتيجة ممثل صواري معزولةالخلايا العصبية مطلي على الزجاج ساترة PLL المغلفة. أ ، ب) 4 بعد ساعات من الطلاء ، وانضمت إلى سطح الخلايا العصبية. بار = 20 ميكرومتر. ج ، د) 30 بعد ساعات من الطلاء ، وسعت معظم الخلايا العصبية محور عصبي مع مخروط النمو مرئية. بار = 20 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. immunostained ألف عصبون صواري لتويولين غاما (الأخضر) ، مع أكتين - F صفها phalloidin (F - أكتين ، الحمراء) ، والنواة التي كتبها دابي (الأزرق).

صفات وتعليقات

وسائل الإعلام التصفيحات Neurobasal

  • Neurobasal
  • 10 ٪ الحرارة المعطل FBS (HiFBS)
  • 2 مم L - الجلوتامين (200 ملي من محلول المخزون)
    اختياري : المضادات الحيوية البنسلين / الستبرتوميسين (استخدام نصف التركيز العادي)

وسائط النمو Neurobasal

  • Neurobasal
  • B27 (1 / 50 التخفيف من الأسهم)
  • 2 مم L - الجلوتامين (200 ملي من محلول المخزون)
  • اختياري : المضادات الحيوية البنسلين / الستبرتوميسين (استخدام نصف التركيز العادي)

    وبمجرد التوصل إلى وسائل الإعلام ، يمكن أن يوضع في درجة مئوية لمدة 4 أسابيع. لكي تتوازن درجة الحرارة ودرجة الحموضة وسائل الإعلام قبل طلاء الخلايا ، ووسائل الإعلام في مكان زراعة الأنسجة أطباق بتري ومكان زراعة الأنسجة في الحاضنة لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة.

Neurobasal

بعد أن تم فتح زجاجة من Neurobasal المتوسطة ، ويمكن الاحتفاظ بها لمدة شهر واحد في 4 درجات مئوية في الظلام. التخلص من Neurobasal التي تم فتحها منذ أكثر من شهر واحد على خلاف ذلك بقاء الخلية سوف يكون أقل.

الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (HiFBS) أو مصل الحصان (HiHS)

للحرارة أو HS FBS ، تعطيل للحرارة بلغت 56 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. دوامة الزجاجة تقريبا كل 10 دقيقة او نحو ذلك. (للحصول على دقة استخدام زجاجة من حجم مماثل مملوءة بالماء. ضع ميزان الحرارة في زجاجة الماء لمعرفة متى يتم التوصل الى 56 درجة مئوية. بيغن توقيت في هذه النقطة). الحراري المعطل FBS قد تحتاج إلى أن يكون طرد لمسح رواسب ، و ويمكن إعادة aliquoted ومجمدة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

L - الجلوتامين

تحسن دائما قسامة جديدة من الجلوتامين - L لكل تجربة.

B27

يمكن الاحتفاظ به من Aliquots B27 عند 20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل ، أو على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وصف لنا طريقة لتشريح والثقافة صواري الخلايا العصبية من الحبل الشوكي الفئران الجنينية. وقد تم هذا الإجراء تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لإعداد موثوق الخلايا العصبية لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التوجيه محور عصبي. لبيولوجيا الخلية وتجارب كيمياء مناعية ، تشريح واحدة تنتج خلايا عصبية كافية القمامة. عندما تكون هناك حاجة أكثر من الخلايا ، قد يكون مطلوبا مثل الكيمياء الحيوية في العديد من التجارب ، تشريح اثنين من الفضلات. بالنسبة لشخص تدرب ، يمكن إجراء التشريح والأجنة تفارق 20 ~ في أقل من 4 ساعات. وسوف تعد الجداول الزمنية نتيجة التشريح في أكثر صعوبة من النخاع الشوكي نتيجة لتغيرات في الأنسجة النزاهة ، ويمكن أيضا استرداد تسوية فعالة من الخلايا العصبية قادرة على البقاء.

عند تنفيذ الإجراء لأول مرة ، على أسطح الخلايا وحة PLL المغلفة المختلفة (coverslips الزجاج حمض غسلها ، أطباق زراعة الأنسجة) للمقارنة. عادة ، يجب إرفاق الخلايا بقوة على PLL المغلفة الصحون البلاستيكية أو زراعة الأنسجة لوحات متعددة أيضا. ويمكن استخدام هذا الاختيار بمثابة العامة لبقاء الخلية والصيانة إذا كان هناك مشاكل مع التصاق الخلايا والنمو على coverslips الزجاج. العامل الرئيسي المسؤول عن خلية التصاق الفقراء من الزجاج من نوعية تنظيف الزجاج وساترة (حمض غسل وتعقيم). وسوف يؤثر هذا على التصاق الخلايا في جزء منه عن طريق الحد من كفاءة PLL طلاء. وتشمل العوامل المشتركة الأخرى سيئة PLL طلاء (طلاء وقت قصير جدا أو حل PLL قديمة جدا) ، وتلوث جرثومية أو فطرية ، أو استخدام وسائل الإعلام أو المكملات الغذائية التي أصبحت قديمة أو منتهية الصلاحية.

وقد استخدمنا الثقافات عصبون صواري أعدت وفقا لهذا الإجراء في كتابة العديد من التجارب ، بما في ذلك كيمياء المناعة والكيمياء الحيوية ، والمقايسات للدوران (يام وآخرون 2009). بشكل ملحوظ ، والخلايا العصبية على صواري مطلي PLL المغلفة الزجاج الاحتفاظ بالقدرة على الاستجابة للاشارات التوجيه ، أي أنها سوف تغير اتجاه نموها استجابة لعامل كيميائي التوجه التطبيقية ، مثل القنفذ سونيك ، كما هو موضح سابقا ليكون محور عصبي جديلة التوجيه ( Charron وآخرون ، 2003 ؛ اوكادا وآخرون ، 2006 ؛ يام وآخرون 2009 ؛ فابر وآخرون ، 2010). ولذلك ، وهذا هو نظام قوي لدراسة تأثير اشارات التوجيه محوار في المختبر ، ويسمح للتجارب التي هي غير ممكنة في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ، وبيتر Lougheed للبحوث الطبية ، ومؤسسة برنامج ماكجيل في Neuroengineering ، وفون بحوث دي سانتي ان كيبيك (FRSQ) ، والمؤسسة الكندية للابتكار (CFI ). وأيد سيباستيان دي انجلوا لجائزة التدريب على الماجستير من فون دي سانتي LA RECHERCHE EN كيبيك (FRSQ) وقبل فريدريك وتشارلز بانتينغ جائزة أفضل رسالة ماجستير كندا منح دراسات عليا من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR). ونحن ممتنون لجيسيكا MT فام للحصول على المساعدة وأرقام.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium, liquid Invitrogen 21103-049 See Recipes and Comments
B27 supplement 50X Invitrogen 17504 See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution Sigma-Aldrich P4707
L-15 medium, powder Invitrogen 41300-070
Trypsin 2.5% (10X) Invitrogen 15090-046
DNAse I, 25000 U/mL Worthington Biochemical
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free Invitrogen 14170-112
L-glutamine 200mM, liquid Invitrogen 25030-081 See Recipes and Comments

Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)

  • E13 pregnancy-staged rat
  • Ethanol 70%
  • Surgical scissors, Fine Science Tools
  • Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
  • Petri dishes
  • L-15 medium
  • Dissection microscope, Leica
  • Plastic transfer pipettes
  • Microscissors, Fine Science Tools
  • Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
  • Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
  • 15 ml plastic tubes

Commissural neuron culture (see also Table I)

  • Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
  • German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
  • Poly-L-lysine, Sigma
  • Sterile milliQ H2O
  • Neurobasal, Invitrogen
  • Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
  • L-Glutamine
  • B27, Invitrogen
  • Penicillin/Streptomycin antibiotics
  • 37°C waterbath
  • Sterile Pasteur Pipettes
  • Bunsen gas burner
  • HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
  • DNAse, Worthington
  • MgSO4
  • Centrifuge
  • Hemacytometer
  • Trypan Blue Solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113-1111 (2003).
  2. Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
  3. Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
  4. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  5. Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
  6. Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Langlois, S. D., Morin, S., Yam, P. T., Charron, F. Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (39), e1773, doi:10.3791/1773 (2010).More

Langlois, S. D., Morin, S., Yam, P. T., Charron, F. Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (39), e1773, doi:10.3791/1773 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter