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Neuroscience

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

doi: 10.3791/1773 Published: May 25, 2010
* These authors contributed equally

Summary

यह वीडियो एक विधि काटना और संस्कृति E13 चूहे पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स को दर्शाता है. Dissociated commissural न्यूरॉन्स अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं.

Abstract

Commissural न्यूरॉन्स को व्यापक रूप से किया गया है भ्रूण रीढ़ की हड्डी के विकास के दौरान अक्षतंतु मार्गदर्शन अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. इन न्यूरॉन्स सेल निकायों पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी में स्थित हैं और उनके axons भ्रूण विकास के दौरान टकसाली trajectories का पालन करें. Commissural axons शुरू floorplate की ओर ventrally परियोजना. Midline पार करने के बाद, इन axons मस्तिष्क की ओर बारी पूर्व से और परियोजना. इन कदमों के प्रत्येक कई मार्गदर्शन cues के कार्रवाई द्वारा विनियमित है. Commissural न्यूरॉन्स में अत्यधिक समृद्ध संस्कृतियों आदर्श कई मोड़ assays, immunochemistry और जैव रसायन सहित, अक्षतंतु pathfinding के तंत्र को संबोधित प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं. यहाँ, हम काटना और संस्कृति E13 चूहे पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स विधि का वर्णन करता है. सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी अलग है और पृष्ठीय स्ट्रिप्स बाहर dissected कर रहे हैं. पृष्ठीय ऊतक तो trypsinization और यांत्रिक विघटन से एक सेल निलंबन में अलग है. न्यूरॉन्स पाली एल lysine लेपित गिलास coverslips या ऊतक संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया जाता है. 30 घंटे के बाद

Protocol

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1. भ्रूण चूहे पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के विच्छेदन

जनरल सिफारिशें

बर्फ पर L-15 मध्यम रखें और अक्सर विच्छेदन पकवान में मध्यम बदलने के भ्रूण को शांत रखने के. यह ऊतक अखंडता बनाए रखने में मदद करता है. सभी चरणों Dumont # 5 संदंश के दो जोड़े के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक कहा गया है. संक्रमण से बचने के लिये, 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों और काम कर सतहों स्प्रे और विच्छेदन मध्यम बोतल बंद रखना. व्यंजन के बीच भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए, एक कट प्लास्टिक विंदुक या एक छिद्रित चम्मच का उपयोग करें. यह रीढ़ की हड्डी (nicking, खींच) नुकसान नहीं विच्छेदन के लिए सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है.

तैयार

  • शीत एल 15-मध्यम
  • L-15 के 50 एमएल + 10% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम (HiHS). बर्फ पर रखें.

स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन

  1. एक गर्भावस्था E13-मंचन चूहा (E0 = संभोग दिन के बाद पहले दिन) एक सीओ 2 संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चैम्बर के साथ . euthanize
  2. पेट पर 70% इथेनॉल स्प्रे. चुटकी और संदंश और शल्य कैंची से कटौती के साथ निचले उदर क्षेत्र की त्वचा को खींच. मांसपेशियों और peritoneal परतों के माध्यम से कटौती करने के लिए उदर गुहा तक पहुँचने के लिए दोहराएँ. पेट के पक्ष के साथ ऊतक काटने, छाती के लिए एक चीरा वी आकार बनाएँ. लिफ्ट और वापस खींच ऊतक उदर गुहा का पर्दाफाश.
  3. गर्भाशय तीन स्थानों पर जुड़ा हुआ है: कम केंद्र पेट में, और दोनों ऊपरी पार्श्व कोनों पर. भ्रूण थैलियों के बीच ऊतकों को हथियाने के द्वारा गर्भाशय लिफ्ट. संयोजी ऊतक कट और बर्फ पर L-15 के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय जगह हटायें.
  4. अगले कदम एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे किया जाता है. एक भ्रूण extraembryonic ऊतकों और भ्रूण झिल्ली से अलग करने के लिए, गर्भाशय की थैलियों के बीच ऊतक संदंश की एक जोड़ी के साथ ले लो,. अन्य जोड़ी के साथ, थैली के और अधिक पारदर्शी पक्ष चुटकी सतही झिल्ली (काले पक्ष नाल है) के माध्यम से कटौती. धीरे थैली की नाल की ओर दबाकर भ्रूण दबाओ. बर्फ पर L-15 के साथ भरा एक पेट्री डिश में सभी भ्रूण और जगह निकालें.
  5. प्लेस एक 10 सेमी पेट्री ठंडा एल 15 से भरा पकवान में एक भ्रूण. Microscissors का प्रयोग, दूर और आंकड़ा 1a में दिखाए गए कोण पर सिर पीछे भागों में कटौती.

    इन कोणों पर काटना जब "उदर नीचे चेहरा" रखा भ्रूण स्थिति में मदद मिलेगी.

  6. स्थिति (पूर्वकाल दूर ओर इशारा करते हुए, पश्च experimenter की ओर इशारा) भ्रूण "उदर नीचे चेहरा" (छवि 1b).
  7. मजबूती से एक तरफ से भ्रूण पकड़, संदंश का उपयोग करने के लिए "नीचे पिन" भ्रूण (fig. -1 सी). संदंश ले जाने के, के रूप में यह ऊतक आंसू जाएगा मत करो. संदंश के अन्य जोड़ी के साथ, त्वचा से छील "पकड़" संदंश (अंजीर 1d - ई) के बीच में क्षेत्र से शुरू भ्रूण के पीछे कवर. यह रीढ़ की हड्डी है, जो इस बिंदु पर, झिल्ली (meninges) द्वारा लपेटा है बेनकाब करेंगे.

    पक्षों से त्वचा के बजाय रीढ़ की हड्डी के ऊपर से रीढ़ की हड्डी nicking से बचने को पकड़ो.

  8. आंशिक रूप से रीढ़ की हड्डी (छवि 1f) के दाईं ओर के ऊतकों अलग. पकड़े संदंश के स्तर पर शुरू, बंद संदंश के साथ ऊतक प्रहार के रूप में रीढ़ की हड्डी के लिए संभव के रूप में बंद है. फिर, धीरे धीरे संदंश को खोलने के लिए ऊतक आंसू. यह रीढ़ की हड्डी से पृष्ठीय रूट ganglia (DRGs) को अलग करना चाहिए, और उदर अंगों को बाधित करना चाहिए. कुछ पूर्वकाल और कूल्हों समाप्त होता है छोड़कर. संलग्न ऊतक भ्रूण के लिए वजन कहते हैं में संलग्न ऊतक छोड़ दो, इस प्रकार यह किया जा रहा है अगले कदम के दौरान ऊपर की ओर खींच से रोकने. इसके अलावा, कि ऊतक के भ्रूण के लिए पर बाद के चरणों में पकड़ प्रयोग किया जाता है.
  9. पूर्वकाल अंत से शुरू, टंगस्टन हुक के आकार सुई का उपयोग करें meninges कटौती और roofplate (छवि 1g) के साथ रीढ़ की हड्डी को खोलने के.
  10. भ्रूण 180 डिग्री (पीछे दूर ओर इशारा करते हुए, experimenter की ओर पूर्वकाल ओर इशारा करते हुए) (1 छवि) घुमाएँ.

    यह experimenter एक ही हाथ का उपयोग करने के लिए भ्रूण के दूसरी तरफ से ऊतक अलग अनुमति देता है.

  11. पहले अलग पक्ष पर कब्जाने द्वारा भ्रूण पकड़ो, और शेष ओर एक ही विधि (1.8 देखें.) का उपयोग से ऊतक को बाधित. जब किया, पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के दोनों पक्षों पर ऊतक अलग.
    वैकल्पिक: पूरी तरह बाईं ओर शेष ऊतक अलग है, लेकिन कुछ सही पक्ष पर पूर्वकाल और कूल्हों अंत में संलग्न ऊतक छोड़. यह कभी कभी 1.12 चरण में स्थिति में रीढ़ की हड्डी को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं.
  12. अपने पक्ष पर रीढ़ की हड्डी प्लेस और शेष mesenchymal ऊतक और DRGs के सबसे (1i छवि) को हटाने.
  13. इस चरण में, meninges और रीढ़ की हड्डी ऊतक के दो चादरें "" एक दूसरे पर apposed हैं. नीचे meninges की रीढ़ की हड्डी भ्रष्टाचार से कम खंड बंद बड़ा है, रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल सबसे भाग, और छील पिनडी (1j छवि, बाएं). अब, संदंश के साथ भर हथियाने के द्वारा दो अलग क्षेत्रों पकड़ है, और एक चिकनी, लगातार आंदोलन (1j छवि) के साथ meninges बंद छील.
    असमान "छीलने" रीढ़ की हड्डी और / या meninges परत के टूटना करने के लिए नेतृत्व करेंगे. यह आमतौर पर रीढ़ की हड्डी अभी भी meninges से जुड़ी गर्भनाल के हिस्से को ठीक करना संभव नहीं है.
  14. एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग, एक पेट्री एल 15 + 10% HiHS युक्त पकवान पृथक रीढ़ की हड्डी हस्तांतरण और बर्फ पर छोड़ दें. आमतौर पर, सभी भ्रूण की रीढ़ की हड्डी डोरियों पृष्ठीय भाग विदारक से पहले एकत्र कर रहे हैं.

पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी की हड्डी विच्छेदन

  1. प्लेस एल -15 10% HiHS युक्त, एक "खुली किताब" विन्यास में फ्लैट झूठ बोल रही एक पेट्री डिश में एक रीढ़ की हड्डी. व्यापक, पूर्वकाल भाग (जो hindbrain का हिस्सा भी शामिल है) (छवि 1K के) दूर काटें.
  2. पृष्ठीय ऊतक रीढ़ की हड्डी (1l अंजीर, बाएं) की सबसे पार्श्व भागों में स्थित है. जबकि एक सीधे टंगस्टन सुई के साथ गर्भनाल लगाए, टंगस्टन एल के आकार सुई का उपयोग करने के लिए एक स्ट्रिप है कि आधा रीढ़ की हड्डी के 1/5th चौड़ाई में कटौती. (छवि 1l, सही). 15 एमएल की प्लास्टिक बर्फ पर एल 15 + 10% HiHS युक्त ट्यूब में पृष्ठीय स्ट्रिप्स रखें.
    पृष्ठीय ~ 12 E13 भ्रूण न्यूरल ट्यूब वर्गों हदबंदी के बाद चढ़ाना के लिए ~ 3.5-4 मिलियन कोशिकाओं निकलेगा. अधिक कोशिकाओं पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी (व्यापक पृष्ठीय स्ट्रिप्स काटने) के एक मोटे विच्छेदन प्रदर्शन करके प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन commissural न्यूरॉन पवित्रता कम हो जाएगा .

2. Commissural न्यूरॉन संस्कृति

जनरल सिफारिशें

सभी कदम जब तक अन्यथा न कहा गया टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. ताजा मध्यम और हौसले से thawed खुराक और अभिकर्मकों का उपयोग करें. पृथक्करण और trituration कदम + / 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS Ca कम से कम 2 + / 2 मिलीग्राम + निर्भर आसंजन 2 Ca में प्रदर्शन कर रहे हैं.

तैयार

  • लेपित (जर्मन Desag कांच का उपयोग) coverslips या टिशू कल्चर प्लेटें (कोटिंग नीचे प्रक्रिया देखें).
  • गर्म Neurobasal चढ़ाना मीडिया (नीचे देखें), टिशू कल्चर व्यंजन और सीओ 2 चढ़ाना से पहले कम से कम 1.5 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में equilibrated में .
  • 37 ° सी waterbath में 2.5% trypsin
  • HBSS Ca 2 + + 2 मुक्त / मिलीग्राम, एक 4 में सी. डिग्री सेल्सियस, एक 37 ° 2 बोतलें
  • दो आग पॉलिश कांच पाश्चर आधा सामान्य आकार एक व्यास के साथ, और एक थोड़ा आधे से अधिक छोटे व्यास के साथ एक pipettes. निष्फल पाश्चर pipettes का उपयोग करें. Pipettes आग पॉलिश करने के लिए, एक Bunsen बर्नर का उपयोग करें (हल्के नीले रंग की लौ के ऊपर) टिप पिघल थोड़ा व्यास कमी. क्योंकि इस कदम टिशू कल्चर हुड के बाहर किया जाता है, 70% इथेनॉल के साथ टिशू कल्चर हुड के नीचे रखने से पहले pipettes स्प्रे. अधिक न्यूरॉन्स, कोट बस trituration कदम से पहले हदबंदी या (मीडिया के साथ pipettes भरने के लिए और 30 सेकंड के लिए रख) की शुरुआत से पहले सीरम युक्त मीडिया के साथ पाश्चर pipettes. के कुशल वसूली के लिए यह trituration दौरान पाश्चर विंदुक के अंदर करने के लिए चिपके से कोशिकाओं को रोकने जाएगा.
  • PLL लेपित व्यंजन या coverslips धोने के लिए बाँझ milliQ पानी
  • 12.5% ​​HBSS में MgSO 4 समाधान

पाली - एल lysine कोटिंग

कांच coverslips, 24 घंटे के लिए एसिड धोने और चढ़ाना के लिए पहले बाँझ (Kaech और बैंकर, 2006 देखें) का उपयोग कर यदि. जर्मन Desag कांच coverslips का प्रयोग करें.

कोट कांच coverslips या प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन पर पाली एल lysine के लिए:

  • एक टिशू कल्चर हुड के नीचे, 100 / 1.75-2 घंटे के लिए मिलीलीटर PLL के समाधान स्नातकीय का एक छोटा सा गुंबद के साथ सतहों को कवर.
  • milliQ पानी, धोने के प्रति कम से कम 5 मिनट (सेल हदबंदी नीचे कदम के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है है) के साथ दो बार धो लो.
  • पानी में उपयोग करें जब तक दुकान. PLL - लेपित सतह सूखी मत देना.
    Coverslips कोटिंग के लिए PLL अपव्यय को कम करने के लिए, बाँझ बैक्टीरियल पेट्री डिश में coverslips जगह. कोट और coverslips पर तरल पदार्थ की एक गुंबद रखकर coverslips धोने. बैक्टीरियल पेट्री डिश hydrophobic रहे हैं, ताकि तरल कांच coverslips पर रहना चाहिए. टिशू कल्चर व्यंजन कोशिकाओं चढ़ाना पहले सिर्फ coverslips स्थानांतरण.
    प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन पर मढ़वाया न्यूरॉन्स के लिए, आसंजन सामान्य उच्च है, इस प्रकार neurite बढ़ाव कम किया जा सकता है.

पृथक्करण और चढ़ाना

  1. सत्यापित करें कि पृष्ठीय स्ट्रिप्स नीचे ट्यूब के नीचे करने के लिए तय हो चुका है. पाश्चर विंदुक के साथ एल 15% 10 HiHS के सबसे निकालें. जल्दी पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब स्ट्रिप्स ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS 3 मिलीलीटर जोड़कर एक बार धोने.
  2. पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब स्ट्रिप्स 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए, तो एक पाश्चर विंदुक के साथ HBSS हटायें.
  3. 4.7 मिलीलीटर की मात्रा को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) HBSS जोड़ें. टीमुर्गी 2.5% trypsin के 0.3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए 0.15% trypsin के अंतिम एकाग्रता दे.
  4. ° 37 पर 7 मिनट के लिए waterbath में सी सेते हैं. ऊष्मायन के माध्यम से एक बार आधे मार्ग में धीरे मिलाएं.
  5. 150 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 30 μl DNase (25 000 यू / एमएल) जोड़ें. MgSO 4 के 60 μl जोड़ें और संक्षेप में 0.15% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, मिश्रण.
    मोटे dissections से ऊतक, 37 पर एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए सेते ° सी waterbath में.

    इस स्तर पर, पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब वर्गों खंडित होना चाहिए. यदि पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब वर्गों टुकड़ा नहीं शुरू कर दिया है, यह आम तौर पर मतलब है कि 2.5% trypsin स्टॉक पुराना है, और नए शेयर thawed होना चाहिए, या ठंड HBSS साथ धोने को प्रभावी ढंग से नमूने से HiHS नहीं निकाल किया.
  6. 4 मिनट के लिए 200 ग्राम पर ऊतक टुकड़े अपकेंद्रित्र.
  7. पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, ट्यूब के नीचे ~ तरल की 50-100 μl छोड़ने.
  8. ट्यूब धीरे झाड़ गोली ढीला है, तो गर्म HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लो. चलो 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बसा है.
  9. 5 मिनट के लिए 200 ग्राम अपकेंद्रित्र.
  10. पाश्चर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, ट्यूब के नीचे ~ तरल की 50-100 μl छोड़ने.
  11. ट्यूब झटका धीरे से गोली ढीला करने के लिए और आंशिक रूप से कोशिकाओं resuspend. फिर गर्म HBSS के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  12. छोटे का प्रयोग करें (आधा व्यास) आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक धीरे से ऊपर और नीचे 4-6 बार pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए. बुलबुले बनाने से बचें, और ट्यूब के पक्ष के खिलाफ तरल विंदुक. पर-triturate नहीं करो.
  13. छोटी आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए आगे धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार कोशिकाओं को अलग कर देना. बुलबुले बनाने से बचें, और ट्यूब के पक्ष के खिलाफ तरल विंदुक. पर-triturate नहीं करो.
    मोटे dissections से ऊतक के लिए, हदबंदी के अंत में ट्यूब के गर्म HBSS का एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ें .
    जब कोशिकाओं को अलग कर, यह सभी सेल clumps और समुच्चय को अलग कर देना आवश्यक नहीं है . ऊपर और नीचे pipetting रोकें या एक छोटे व्यास के साथ एक पाश्चर विंदुक बदल अगर आप आगे pipetting के साथ सेल समुच्चय के आकार में कोई कमी आगे देखते हैं.
  14. 1 मिनट के लिए किसी भी शेष ऊतक टुकड़े ट्यूब में बसा है. यह एक नया ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण के लिए आवश्यक नहीं है.
  15. सेल निलंबन के 20 μl ले लो और trypan नीले के 5 μl जोड़ें. एक haemocytometer पर कक्षों की गणना.
    न्यूरॉन्स ≥ 95% व्यवहार्य trypan नीले अपवर्जन द्वारा किया जाना चाहिए.
  16. प्लेट Neurobasal चढ़ाना मीडिया में न्यूरॉन्स (व्यंजनों नीचे देखें).
    • पृथक न्यूरॉन्स (कम घनत्व संस्कृतियों clumping या एक दूसरे अतिव्यापी न्यूरॉन्स से बचने के लिए) प्राप्त करने के लिए सुझाव चढ़ाना घनत्व:
    • 120 000 180 000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए
    • 60 000 75 000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए
  17. 16-18 घंटे बाद Neurobasal ग्रोथ मीडिया के लिए मीडिया को बदलने (व्यंजनों नीचे देखें)
    का उपयोग करने के लिए संस्कृति डिश से मीडिया aspirate जब मीडिया बदलते नहीं एक वैक्यूम पंप, धीरे से एक विंदुक उपयोग. यह न्यूरॉन्स dislodging से बचा जाता है.

प्रतिनिधि परिणाम:

चार घंटे के बाद चढ़ाना, न्यूरॉन्स (पीएलएल) पाली एल lysine लेपित सतह का पालन होना चाहिए. चरण विपरीत रोशनी के तहत, सेल शरीर पालन कर रहे हैं आमतौर पर अपेक्षाकृत सपाट और अंडाकार आकार (fig. 2a). कक्ष है कि अच्छी तरह से पालन नहीं किया है क्षेत्रों है कि थोड़ा कदम जब पकवान बहुत धीरे पक्ष पर उपयोग किया है के रूप में दिखाई देते हैं. कई कारकों संभावित कोशिकाओं के आसंजन को बाधित कर सकते हैं (चर्चा देखें).

इन विट्रो में 30 घंटे के बाद, सबसे न्यूरॉन्स एक दृश्य विकास शंकु (अंजीर 2c, घ) के साथ एक अक्षतंतु बढ़ाया है. यदि गरीब axonal विकास मनाया जाता है, सत्यापित करें कि Neurobasal ग्रोथ मीडिया ताजा मध्यम और पूरक आहार के साथ बनाया गया है. न्यूरॉन्स इन स्थितियों में कम से कम 6 दिनों के लिए स्वस्थ रहते हैं. इस प्रक्रिया को मज़बूती से उच्च commissural न्यूरॉन्स में समृद्ध तैयारी उपज ~ न्यूरॉन्स की 90% (रतालू एट अल 2009) डीसीसी व्यक्त के साथ साबित कर दी है. पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी की पट्टी है कि सेल निलंबन की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है की चौड़ाई जब पतली स्ट्रिप्स उपयोग किया जाता है अधिक से अधिक शुद्धता के साथ संस्कृति की पवित्रता को प्रभावित करेगा. एक उदाहरण अनुप्रयोग आंकड़ा 3 (immunofluorescence) में दिखाया गया है. रतालू एट अल द्वारा लेख देखें. (2009) और अधिक उदाहरण के लिए.

चित्रा 1
चित्रा 1 रीढ़ की हड्डी विच्छेदन कदम के Schematics. डी = पृष्ठीय, वी = ventral यहाँ क्लिक करें देखने के लिए एक बड़ा आंकड़ा है.

चित्रा 2
चित्रा 2 पृथक commissural के प्रतिनिधि परिणाम.न्यूरॉन्स एक गिलास PLL लेपित coverslip पर मढ़वाया. एक, ख) चढ़ाना के बाद 4 घंटे, न्यूरॉन्स की सतह का पालन किया है. बार = 20 सुक्ष्ममापी. ग, घ) चढ़ाना के बाद 30 घंटे, सबसे न्यूरॉन्स दिखाई विकास शंकु के साथ एक अक्षतंतु बढ़ाया है. बार = 20 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 3
चित्रा 3. Commissural न्यूरॉन गामा ट्यूबिलिन (हरा) के लिए एफ actin phalloidin (एफ actin, लाल) और DAPI द्वारा नाभिक (नीला) द्वारा लेबल के साथ, immunostained.

व्यंजनों और टिप्पणियाँ

Neurobasal चढ़ाना मीडिया

  • Neurobasal
  • 10% हिट निष्क्रिय FBS (HiFBS)
  • 2 मिमी एल glutamine (200 मिमी शेयर समाधान से)
    वैकल्पिक: पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं (आधा सामान्य एकाग्रता का उपयोग)

Neurobasal ग्रोथ मीडिया

  • Neurobasal
  • B27 (1 / 50 स्टॉक से कमजोर पड़ने)
  • 2 मिमी एल glutamine (200 मिमी शेयर समाधान से)
  • वैकल्पिक: पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं (आधा सामान्य एकाग्रता का उपयोग)

    एक बार मीडिया बनाया है, यह 4 ° C पर दो सप्ताह के लिए रखा जा सकता है. पहले कम से कम 1.5 घंटे के लिए कोशिकाओं, टिशू कल्चर पेट्री डिश में जगह मीडिया और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में जगह चढ़ाना तापमान और मीडिया के पीएच संतुलित है .

Neurobasal

Neurobasal माध्यम की एक बोतल के बाद खोला गया है, यह एक महीने के लिए 4 में रखा जा सकता ° C अंधेरे में. Neurobasal है जो एक से अधिक महीने के लिए खोल दिया गया है अन्यथा सेल अस्तित्व कम हो जाएगा के निपटान.

हीट निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (HiFBS) या घोड़े सीरम (HiHS)

गर्मी निष्क्रिय 56 पर FBS या एच एस, गर्मी ° सी 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में. भंवर बोतल लगभग हर 10 मिनट या तो. (सटीकता के लिए इसी तरह पानी से भरे आकार की एक बोतल का उपयोग रखें. पानी की बोतल में एक थर्मामीटर को देखने के लिए जब 56 ° C तक पहुँच जाता है. इस बिंदु पर समय शुरू.) हीट - निष्क्रिय FBS precipitates स्पष्ट centrifuged की आवश्यकता हो सकती है, और और aliquoted -20 डिग्री सेल्सियस पर जा सकता है फिर जमी

एल-Glutamine

हमेशा प्रत्येक प्रयोग के लिए एल glutamine की ताजा विभाज्य पिघलना.

B27

B27 के Aliquots 20 पर रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस दीर्घकालिक भंडारण के लिए, या 4 ° C एक महीने के लिए.

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Discussion

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हम एक काटना और संस्कृति भ्रूण चूहे रीढ़ की हड्डी से commissural न्यूरॉन्स की विधि वर्णित है. इस प्रक्रिया को नियमित किया गया है, हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल करने के लिए मज़बूती से न्यूरॉन्स को तैयार अक्षतंतु मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन. कोशिका जीव विज्ञान और immunochemistry प्रयोगों, एक कूड़े के विच्छेदन के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स पैदा करता है. जब अधिक कक्षों की जरूरत है, जैसे कई जैव रसायन प्रयोगों, दो litters के विच्छेदन में आवश्यक हो सकता है. एक प्रशिक्षित व्यक्ति के लिए, विच्छेदन और ~ 20 भ्रूण की हदबंदी कम से कम 4 घंटे में किया जा सकता है. अब timescales ऊतक अखंडता में परिवर्तन के कारण रीढ़ की हड्डी डोरियों के एक और अधिक कठिन विच्छेदन में परिणाम होगा, और भी व्यवहार्य न्यूरॉन्स की प्रभावी वसूली समझौता कर सकते हैं.

जब पहली बार के लिए प्रक्रिया का प्रदर्शन, विभिन्न PLL लेपित सतहों पर थाली तुलना के लिए कोशिकाओं (एसिड धोया कांच coverslips, टिशू कल्चर व्यंजन). आम तौर पर, कोशिकाओं robustly PLL लेपित प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन या बहु अच्छी तरह प्लेटें देते हैं चाहिए. यह सेल व्यवहार्यता और रखरखाव के लिए एक सामान्य जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वहाँ सेल और कांच coverslips पर आसंजन वृद्धि के साथ समस्याएँ हैं. गरीब सेल कांच के लिए आसंजन के लिए जिम्मेदार मुख्य कारक कांच और coverslip सफाई (एसिड धोने और स्टरलाइज़) की गुणवत्ता है. इस PLL - कोटिंग दक्षता को कम करने के द्वारा भाग में कोशिका आसंजन को प्रभावित करेगा. अन्य आम कारकों बुरा (कोटिंग भी कम समय या PLL समाधान बहुत पुराने) - PLL कोटिंग, बैक्टीरियल या फंगल संदूषण, या मीडिया या पूरक है कि पुराने या समाप्त हो रहे हैं का उपयोग शामिल है.

हम commissural न्यूरॉन immunochemistry, जैव रसायन, और निर्णायक assays (रतालू एट अल 2009) सहित प्रयोगों के कई प्रकार में इस प्रक्रिया के अनुसार तैयार संस्कृतियों का इस्तेमाल किया है. उल्लेखनीय है, commissural PLL लेपित गिलास पर मढ़वाया न्यूरॉन्स मार्गदर्शन cues का जवाब, यानी, वे हेज हॉग सोनिक के रूप में एक आवेदन chemotropic कारक, के जवाब में उनके विकास की दिशा बदल जाएगा, पहले से एक अक्षतंतु मार्गदर्शन क्यू होना दिखाया करने की क्षमता को बनाए रखने ( CHARRON एट अल, 2003, Okada एट अल, 2006, रतालू एट अल 2009; Fabre एट अल, 2010).. इसलिए, इस अक्षतंतु इन विट्रो में मार्गदर्शन cues के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है और प्रयोगों है कि vivo में संभव नहीं कर रहे हैं के लिए अनुमति देता है.

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Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), पीटर Lougheed मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, Neuroengineering में मैकगिल कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, डे Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक, और अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI Fonds ). Sebastien डी. Langlois एक मास्टर Fonds से प्रशिक्षण पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया डे ला Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक और फ्रेडरिक Banting और चार्ल्स द्वारा स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों से सर्वश्रेष्ठ कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति मास्टर पुरस्कार. हम जेसिका मीट्रिक टन फाम आंकड़ों के साथ सहायता के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium, liquid Invitrogen 21103-049 See Recipes and Comments
B27 supplement 50X Invitrogen 17504 See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution Sigma-Aldrich P4707
L-15 medium, powder Invitrogen 41300-070
Trypsin 2.5% (10X) Invitrogen 15090-046
DNAse I, 25000 U/mL Worthington Biochemical
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free Invitrogen 14170-112
L-glutamine 200mM, liquid Invitrogen 25030-081 See Recipes and Comments

Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)

  • E13 pregnancy-staged rat
  • Ethanol 70%
  • Surgical scissors, Fine Science Tools
  • Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
  • Petri dishes
  • L-15 medium
  • Dissection microscope, Leica
  • Plastic transfer pipettes
  • Microscissors, Fine Science Tools
  • Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
  • Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
  • 15 ml plastic tubes

Commissural neuron culture (see also Table I)

  • Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
  • German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
  • Poly-L-lysine, Sigma
  • Sterile milliQ H2O
  • Neurobasal, Invitrogen
  • Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
  • L-Glutamine
  • B27, Invitrogen
  • Penicillin/Streptomycin antibiotics
  • 37°C waterbath
  • Sterile Pasteur Pipettes
  • Bunsen gas burner
  • HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
  • DNAse, Worthington
  • MgSO4
  • Centrifuge
  • Hemacytometer
  • Trypan Blue Solution

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References

  1. Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113-1111 (2003).
  2. Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
  3. Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
  4. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  5. Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
  6. Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति
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Langlois, S. D., Morin, S., Yam, P. T., Charron, F. Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (39), e1773, doi:10.3791/1773 (2010).More

Langlois, S. D., Morin, S., Yam, P. T., Charron, F. Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (39), e1773, doi:10.3791/1773 (2010).

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