Summary
El laberinto Lashley III es una tarea de la ruta de aprendizaje que no se basa en estímulos adversos o las señales visuales. Por tanto, es una opción muy atractiva para evaluar el aprendizaje y la memoria, especialmente en los ratones envejecidos o de otra manera donde el estrés es un factor.
Abstract
Muchas pruebas de comportamiento diseñado para evaluar el aprendizaje y la memoria en roedores, especialmente ratones, se basan en las señales visuales, la privación de alimentos y / o agua, o de otros estímulos negativos para motivar la adquisición de la tarea. A medida que envejecen los animales, las modalidades sensoriales se deterioran. Por ejemplo, muchas cepas de ratones desarrollan audiencia déficit o las cataratas. Los cambios en los sistemas sensoriales necesaria para guiar los ratones durante la adquisición de la tarea actual confunde potencial en la interpretación de los cambios de aprendizaje en animales viejos. Además, el uso de estímulos aversivos para motivar a los animales para aprender tareas es potencialmente de confusión cuando se comparan los ratones con una sensibilidad diferencial al estrés. Para minimizar este tipo de efectos de confusión, se ha implementado una versión modificada del laberinto Lashley III. Este laberinto se basa en el aprendizaje de la ruta, en el que los ratones aprenden a navegar por un laberinto a través de una exposición repetida bajo condiciones de estrés bajo, fase oscura, por ejemplo, no la privación de alimentos / agua, hasta que navegar por una ruta desde el punto de inicio a una jaula de pseudo-casa con 0 o 1 error (s) en dos ensayos consecutivos. Nosotros consideramos esto como una prueba de comportamiento de baja tensión, ya que no se basa en estímulos negativos para fomentar la exploración del laberinto y el aprendizaje de la tarea. El aparato consiste en un cajón de salida modular, un cuerpo laberinto de 4 brazos, y una caja de meta. Al final de la caja de meta es una jaula de pseudo-casa que contiene ropa similar a la encontrada en la jaula del animal y es específico para cada animal durante la duración de las pruebas de laberinto. Se ha demostrado previamente que esta jaula pseudo-casa ofrece una recompensa suficiente para motivar a los ratones para aprender a navegar por el laberinto
Protocol
1. Preparación:
- El laberinto Lashley III está construido de plexiglás y se muestra en la Figura 1. El cajón de salida, brazos del laberinto, y la caja de meta son modulares para permitir la limpieza y la modificabilidad del laberinto. Las paredes de la caja de inicio, brazos del laberinto, y caja de la meta se construyen de Plexiglas negro para eliminar las señales visuales desde el exterior y el interior del laberinto. Brazos del laberinto es de 45 cm de largo, 7 cm de alto y 5 cm de ancho. Puertas que conducen a los brazos del laberinto consecutivos de 4 cm x 4 cm y se encuentra a 11 cm de las paredes exteriores del laberinto. La portería es de 19,5 cm de largo x 7 cm de alto x 5 cm de ancho. El cajón de salida es de 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Separado piezas de plexiglás transparente se colocan en la parte superior de la caja de inicio, el laberinto, y caja de la meta para permitir la visualización de cada ratón a medida que avanza por el laberinto, mientras que la prevención de los ratones se escape. El laberinto se apoya en una base construida de plexiglás de color rojo que es suficientemente grande para contener las tres piezas del laberinto de una jaula pseudo-casa que es del mismo tamaño que la jaula del animal doméstico estándar.
- Para preparar la pseudo-casa jaulas antes del juicio primer laberinto, material de cama nueva del mismo tipo que la utilizada en las jaulas hogar de los animales se añade al fondo de la jaula individuo que tiene las puertas (2 cm x 2 cm), corte en los lados. Alambre de tapas en lugar de estos fondos jaula individual y número de ellos, uno para cada animal en una cohorte de prueba. Estas jaulas individuales servirá como pseudo-jaulas hogar para cada animal, para la duración del plazo de prueba. Debido a que estamos investigando el papel del estrés y / o comportamientos relacionados con la ansiedad en el aprendizaje y la memoria, se utiliza pseudo-casa jaulas individuales para evitar los ratones de la vivienda en sus jaulas. Sin embargo, si estos factores no son de interés primordial, los animales pueden ser alojados individualmente en jaulas de casa modificado con puertas y jaulas que pueden servir como hogar para las jaulas de navegación laberinto éxito.
2. Pruebas:
- Cada día, los animales son trasladados a la sala de pruebas de comportamiento de un mínimo de una hora antes de la prueba que les permita aclimatarse al ambiente de prueba.
- Treinta minutos antes del inicio de las pruebas del tiempo, la comida y el agua se elimina de todas las jaulas en casa. Mantenga los alimentos y el agua en la sala de pruebas de comportamiento, pero fuera del alcance de los ratones. Alimentos y el agua normalmente se elimina 30 minutos después del cambio de la fase de luz a la fase de oscuridad, después de la alimentación máxima se ha producido. Esto asegura que los animales son en su mayoría de alimentos y el agua sacia antes de la prueba, sin embargo, las pruebas durante este período proporciona una pequeña fuerza adicional de motivar a navegar por el laberinto, aunque no hay comida abierta o recompensa de agua al terminar la tarea.
- Después del período de pre-test de 30 minutos ha transcurrido, limpiar el laberinto con el 70% de etanol. Deje la puerta principal de la caja de inicio en el laberinto de brazos cerrados. Las puertas en ambos extremos de la caja de la meta se dejan abiertas.
- Coloque la jaula pseudo-casa que corresponde al primer animal en el extremo de la caja de la meta.
- Realizar el primer ratón en el laberinto, ventosas en la mano. Ponga el ratón en el cajón de salida y vuelva a colocar la tapa.
- Cuando está en posición de observar el laberinto sin obstáculos, abrir la puerta de la caja de inicio y de inmediato comenzar a tres cronómetros.
- Cuando todas las cuatro patas del ratón ha dejado el cajón de salida, cierre la puerta de la caja de arranque y parada del primer temporizador.
- Registro por parte de la vía el ratón viaja cuando pase por el laberinto. Un ratón entra en una zona nueva o en el brazo del laberinto, cuando las cuatro patas se han cruzado en esa zona (ver fig. 1).
- Cuando todas las cuatro patas entrar en el área chica, cerca de la puerta que conduce entre el laberinto y la caja de la meta y detener el segundo cronómetro.
- Cuando el ratón está completamente entró en la jaula pseudo-casa, cerca de la puerta entre el área chica y la jaula. Detener el cronómetro tercero.
- Registrar los tiempos de los tres cronómetros. Cuente el número de errores con el ratón ha hecho. Un error se define como una entrada en un callejón sin salida callejón sin salida de zona (por ejemplo, al pasar de L del brazo a la zona de K;. Fig. 1), o viajando a través de un brazo ya transitados del laberinto (por ejemplo, al pasar de brazo a brazo F C, Fig. 1).. A pesar de que la puntuación de rendimiento del ratón, ya que se está produciendo, es posible grabar en video o de lo contrario ensayos laberinto registro para permitir la calificación posterior, ya sea por los ojos o de software automatizado. Discreción experimentador debe ser utilizado para elegir un método apropiado.
- Dejar al animal en la jaula de pseudo-casa durante 1 minuto antes de volver a su jaula.
- Repita los pasos 2,3 a 2,12 para todos los ratones en el grupo de prueba.
- Cuando el ratón por última vez en la cohorte ha sido devuelto a su jaula, iniciar el temporizador de 30 minutos. Al final de este período de 30 minutos, el retorno de alimentos y agua a todos los ratones en el grupo y luego regresar los animales a su ambiente colonia.
- Repita este procedimiento en noches consecutivas, con un ensayo por día de pruebas por animal, hasta que todos los ratones en el grupo han llegado a un criterio de aprendizaje definidos o hasta un determinado número de los ensayos de prueba se ha producido. Un ratón se clasifica como de haber aprendido el laberinto cuando se puede realizar la tarea con 0 o 1 error (s) en dos ensayos consecutivos. Los ratones se ponen a prueba en el mismo orden en los sucesivos ensayos.
3. Los resultados representativos:
Días para aprender (cumplir con el criterio) pueden ser analizados y comparados entre los distintos grupos en un estudio particular (Fig. 2A y 3A). Además, un índice de aprendizaje (aprender ratio), que caracteriza a la adquisición de laberinto, se puede evaluar en los primeros cuatro días del período de prueba (Fig. 2B y 3B). El índice de aprendizaje es la relación entre el número de segmentos de la trayectoria correcta viajó con el número total de segmentos de la trayectoria recorrida por cada juicio. El índice promedio de aprendizaje debe ser aproximadamente 0,5 para la prueba 1, cuando los ratones son expuestos por primera vez en el laberinto y la navegación por casualidad. Aumenta el índice de aprendizaje y se acerca a 1 entre los ensayos 2 y 4 que indica que el aprendizaje está ocurriendo. En la figura 2, los jóvenes (2 meses) y el envejecimiento (24 meses) los ratones machos C57Bl/6NCr fueron entrenados en el laberinto Lashley para un máximo de 15 ensayos. Los ratones jóvenes aprendieron el laberinto de 7,2 (± 1,5) d. Por el contrario, los animales viejos se 11,7 (± 2,1) d para cumplir con el criterio. Hubo una fuerte tendencia para los ratones C57Bl/6NCr envejecimiento a tomar más tiempo para aprender el laberinto ([t (23) = 1.59, P = 0,056], de una cola t-test, una hipótesis a priori que los días de aprender es más largo en el envejecimiento ratones). Cuando el índice de aprendizaje se calcula, ambos grupos de edad muestran un aumento constante en el índice de aprendizaje de los ensayos del 2 al 4 (efecto principal significativo de tiempo P <0,001). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas en el índice de aprendizaje entre los jóvenes ratones C57 y C57 ratones de edad (principal efecto de la edad p = 0,58).
La figura 3 es representante de los estudios que examinan los efectos de la tensión de fondo en el aprendizaje de la conducta. Los datos de la C57Bl/6NCr hombre joven se muestra en la figura. 2 están ahora en comparación con los datos de los jóvenes Crl: CD-1 (ICR) BR ratones [CD-1, 4-5 mo]. Ratones CD-1 aprendieron el laberinto Lashley III en 4,5 (± 1,4) d, sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las cepas en día para aprender (Fig. 3A, [t (18) = 1,328, P = 0,20], dos colas t-test). Por el contrario, el examen de la muestra índice de aprendizaje, mientras que todos los animales fueron navegar por el laberinto en el primer juicio por casualidad, ratones CD-1 aprendieron la tarea más rápidamente (efecto principal de la cepa P <0,001). Esto se ilustra por el aumento estadísticamente significativo en el índice de aprendizaje en los estudios de 2 a 4 en ratones CD-1 en comparación con los ratones C57Bl/6NCr. Curiosamente, si ratones CD-1 siguen siendo entrenados en el laberinto más allá del punto de llegar a criterio, que exhiben un comportamiento indicativo de sobreentrenamiento (Fig. 4) que se discute en más detalle a continuación.
Figura 1:. El laberinto Lashley III El callejón sin salida callejón sin salida en el laberinto de las zonas son de color rojo en el diagrama con fines ilustrativos. La base y los brazos del laberinto actual son colores sólidos (recuadro). El laberinto es dibujado a escala (dimensiones en el texto).
Figura 2: Lashley rendimiento laberinto III en 2 y 24 meses de edad, los ratones machos C57Bl/6NCr El laberinto Lashley III se utilizó para evaluar la ruta de aprendizaje en jóvenes (2 meses) y el envejecimiento (24 meses) los ratones machos C57Bl/6NCr.. Los parámetros medidos fueron: (a) días de criterio, el número de días necesarios para que un ratón para correr por el laberinto de dos noches consecutivas con 0 errores o error 1, y (b) índice de aprendizaje, el número de corregir las entradas de cuatro brazos de la pata hizo frente al número total de entradas del brazo hechos en los días 1-4 de las pruebas de laberinto Lashley III. El número de animales por grupo n = 10 para el mes de edad 2 y n = 15 para 24 meses de edad, los ratones.
Figura 3: Lashley rendimiento laberinto III en C57Bl/6NCr jóvenes hombres y ratones CD-1 El laberinto Lashley III se utilizó para evaluar el aprendizaje en la ruta 2 meses de edad C57Bl/6NCr y 4-5 meses de edad, los ratones CD-1.. Los parámetros medidos fueron: (a) días de criterio, el número de días necesarios para que un ratón para correr por el laberinto de dos noches consecutivas con 0 errores o error 1, y (b) índice de aprendizaje, el número de corregir las entradas de cuatro brazos de la pata hizo frente al número total de entradas del brazo hechos en los días 1-4 de las pruebas de laberinto Lashley III. El número de animales por grupo n = 10 para C57Bl/6NCr y n = 10 para ratones CD-1. Significación estadística: * p <0,05, ** p <0.01 en comparación con los ratones C57Bl/6NCr.
Figura 4: Lashley rendimiento laberinto III en 4-5 meses de edad de sexo masculino ratones CD-1 El laberinto Lashley III.se utilizó para evaluar la ruta de aprendizaje de cada diez 4-5 meses de edad, masculino ratones CD-1 en 15 días consecutivos. Los parámetros medidos fueron: (a) número de errores cometidos por día, con un error se define como una entrada de cuatro pata en un callejón sin salida callejón sin salida de zona o de viaje de un brazo ya transitados del laberinto, y (b) tiempo de permanencia en el laberinto por día. El día en que se llegó a criterio se indica con una flecha roja.
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Discussion
Las pruebas de los roedores más utilizados de comportamiento para evaluar el aprendizaje y la memoria son el laberinto acuático de Morris y las variantes de condicionamiento del miedo 2. Estas pruebas se basan en señales visuales o auditivas para el aprendizaje y los estímulos aversivos (por ejemplo, el agua, estímulo eléctrico plantar) para motivar a los animales para completar las 3 tareas. En los roedores, el envejecimiento, como el envejecimiento en los seres humanos, las modalidades sensoriales disminuyen con el tiempo. Varias cepas de fondo de los ratones pierden la audición o de desarrollar cataratas a medida que envejecen, y las tasas de mortalidad después de 23,5 horas de privación de agua han demostrado que aumenta en los ratones, ya que los 4 años. Así, los cambios en el rendimiento en estas pruebas más utilizadas pueden ser difíciles de interpretar en los roedores de envejecimiento.
El laberinto Lashley III fue descrita por primera vez por Karl Lashley en 1929 5. Lashley utilizó este paradigma para buscar el engrama de memoria en la corteza cortical mediante técnicas de lesionar. Hemos modificado ligeramente el laberinto original para permitir su amplia aplicabilidad de los estudios con roedores envejecimiento. Hemos eliminado los alimentos con claves de navegación del laberinto y ha demostrado que un ambiente pseudo-jaula en casa ofrece una motivación suficiente a los ratones jóvenes y el envejecimiento de navegar por el laberinto 1. Otros investigadores también han utilizado un premio de comida de pellets para facilitar el aprendizaje del laberinto Lashley III 7. Visualmente con claves de navegación, como la exigida en el laberinto acuático de Morris y el laberinto circular de Barnes, se ha minimizado 2,6,8. Los ratones no son privados de alimentos y el 90% de su peso corporal, como se requiere para algunas variaciones del laberinto de brazo radial, Y el laberinto y el laberinto T-tareas 2,9-10. Por el contrario, los alimentos y el agua está disponible para los animales ad libitum y sólo se elimina 30 minutos antes de cada ensayo, las pruebas con las pruebas por lo general tienen lugar durante la fase oscura activo. La comida es 30 minutos después regresó el ratón por última vez en una cohorte haya completado la tarea y se disocia temporalmente de la vuelta a la jaula de pseudo-casa para no actuar como una recompensa abierta para completar la tarea. Es importante destacar que la no disponibilidad de alimentos y agua para toda la cohorte no debe extenderse más allá de un período de 4-5 h por juicio. Además, los ratones que representan a los diferentes grupos experimentales deben ser ensayados junto en las mismas noches.
La modularidad del laberinto Lashley III permite modificaciones diseñadas para probar los diferentes aspectos del aprendizaje de la retención. Por ejemplo, mientras que la adquisición se produce con el laberinto en una configuración específica, una vez que la adquisición se ha establecido, el laberinto puede ser girada de manera que los ratones que debe girar en la dirección opuesta para completar la tarea, es decir, los ratones se gire a la derecha saliendo de la caja de inicio para navegar con éxito en el laberinto durante la adquisición, pero la flexibilidad de aprendizaje (recuerdo) se puede medir girando el laberinto para que los ratones deben girar a la izquierda de la caja de inicio para navegar con éxito. Otras variaciones del procedimiento de prueba incluyen el establecimiento de aprendizaje para un período determinado de tiempo (generalmente 14 días) y luego permitir un intervalo de demora de varias semanas después de que la retención del aprendizaje de laberintos se mide. Intervalos de retención deben ser establecidos por el trabajo de piloto y se study-/strain-dependent. Ya las sesiones de entrenamiento tienden a ser asociados con intervalos de retención más largo. Modificaciones del procedimiento de laberinto Lashley III se incluyen la adición de señales olfativas o estímulos ruido para ofrecer una motivación adicional para la navegación laberinto éxito. Los factores de estrés como el estrés de retención puede ser aplicado en diferentes momentos antes, durante o después de la adquisición para investigar aprendizaje estado-dependiente y la memoria.
Un factor importante a considerar en la aplicación del laberinto Lashley III es la duración del intervalo de la formación. La mayoría de las cepas disponibles de ratones puras y outbred, incluyendo C57BL / 6, Webster suizos, y BXD recombinante ratones consanguíneos, se llega al criterio de aprendizaje dentro de 14 días. Algunas cepas, especialmente ratones CD-1, después de cumplir con el criterio tan sólo 7 días. Sobreentrenamiento de algunas cepas de ratones produce un comportamiento aberrante en el laberinto, los ratones en el que comenzará a mostrar un aumento constante y rápido aumento del número de errores cometidos por el juicio y el tiempo dedicado a explorar el laberinto. La figura 4 es representante de sobreentrenamiento en 4-5 meses de edad de sexo masculino ratones CD-1. Después de la primera exposición en el laberinto, que un instituto de 15 minutos de corte por periodo de prueba para cada ratón. Después de 15 minutos, el ratón es llevado a través del laberinto de la jaula de pseudo-hogar y los errores no se cuentan una vez que la marca de 15 minutos ha sido alcanzado. Si varios ratones en un grupo o en un estudio más amplio que ser llevado a través del laberinto después de alcanzar los criterios de aprendizaje, esto puede ser indicativo de sobreentrenamiento. Para evitar problemas con el exceso de entrenamiento y para acortar la duración global de la prueba, hemos limitado la fase de adquisición de cuatro ensayos en algunos estudios y en promedio el índice de aprendizaje de los ensayos de tercera y cuarta para determinar un resultado de aprendizaje. Esta puntuación se puede comparar el aprendizaje en lugar dedías para aprender.
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Disclosures
Todos los protocolos de comportamiento fueron aprobados por el Cuidado de Animales del Estado de Pennsylvania Institucional de la Universidad y el empleo. No hay información financiera que reportar.
Acknowledgments
El laberinto Lashley III utilizado para estos experimentos fue construido por Tim Bowmaster, Corman Pablo, Dutrow Barry, Jabco Ryan y Tim Treaster de la Universidad Estatal de Pennsylvania Tienda de la máquina del Departamento de Física. Los autores desean agradecer a la Sra. Shoba Belegundu, la Sra. Tara Chrzanowski, y la Sra. Alexandra Lewis para la asistencia en la realización de los experimentos presentados en las Figuras 2-4. El Sr. Walter Jackson proporcionaron información valiosa en la elaboración de este protocolo. Este trabajo fue financiado con fondos del Instituto Nacional de Salud Mental (MH064756 y MH077978 a AMA). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Salud Mental o los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
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