Summary
레쉴리 III의 미로가 자극 aversive 또는 Visual 단서에 의존하지 않는 경로 학습 작업입니다. 그것은 따라서 특히 노화 생쥐의하거나 어디에 스트레스가 고려, 학습 및 메모리를 평가하기위한 매우 매력적인 옵션입니다.
Abstract
학습과 설치류에서 메모리를 평가하기위한 많은 동작 시험, 특히 마우스는 작업 취득 동기를 부여하기 위해 시각적 단서, 음식 및 / 또는 물 부족, 또는 다른 aversive 자극에 의존하고 있습니다. 동물 나이, 감각 modalities가 저하. 예를 들어, 마우스의 여러 변종이 결손이나 백내장을 듣고 개발할 수 있습니다. 작업 취득하는 동안 마우스를 안내하는 데 필요한 감각 시스템의 변화는 노화 동물의 학습 변화를 해석의 가능성을 제시 confounds. 스트레스 차동 감성과 쥐를 비교하면 또한 작업을 배울 동물 동기를 부여하기 위해 aversive의 자극의 사용 가능성이 혼란함을 주죠입니다. 혼란함을 주죠 효과 이러한 종류를 최소화하기 위해, 우리는 레쉴리 III의 미로의 수정된 버전을 구현합니다. 이 미로는 쥐가 그들이 0으로 의사 가정 케이지로 시작하는 위치에서 경로를 탐색하거나 때까지 낮은 스트레스 조건, 예를 들어 어두운 단계, 식량 / 물 부족, 아래의 반복 노출을 통해 미로를 탐색 배울 의하여 경로 학습에 의존 연속 2 실험 1 오류 (들). 그것은 작업의 미로와 교육의 탐구를 장려하는 aversive의 자극에 의존하지 않기 때문에 우리는 낮은 스트레스 행동 테스트로 분류. 장치는 모듈 시작 상자 4 암 미로 기관 및 목표 상자로 구성되어 있습니다. 목표 상자의 하단에있는 동물의 홈 케이지에서 발견 미로 테스트 기간 동안 각 동물에 따라 다릅니다 비슷한 침구를 포함하는 의사 가정 케이지입니다. 그것이 의사 가정 케이지가 미로를 탐색하는 법을 배워야 마우스 동기를 부여하기에 충분한 보상을 제공 이전에 입증되었습니다
Protocol
1. 준비 :
- 레쉴리 III의 미로는 플렉시의 건설이며, 그림 1에 표시됩니다. 시작 상자 미로의 팔, 그리고 목표 상자가 미로의 청소 및 modifiability 수 있도록 모듈입니다. 시작 상자 미로의 팔, 그리고 목표 상자의 벽은 외부와 미로 내부 영상 신호를 제거하기 위해 블랙 플렉시의 건설입니다. 메이즈 팔, 긴 7cm 높이 45cm이며, 5cm 폭. 미로의 연속 무기로 이어지는 문은 X 4cm 4cm이며 미로의 외벽에서 11cm에 위치하고 있습니다. 목표 상자 X 높이 7cm X 5cm 폭 19.5 cm 길이입니다. 시작 상자 8cm X 9.5 cm X 7cm입니다. 별도의 명확한 플렉시 조각은 탈출 생쥐를 방지하면서 그것이 미로를 통해 진행 각 마우스의 시각화 수 있도록 시작 상자, 미로, 그리고 목표 상자의 상단에 표시됩니다. 미로는 미로 플러스 동물의 표준 홈 케이지와 같은 크기 의사 가정 케이지의 세 조각을 가질 정도로 큰 붉은 플렉시의 건축 기초에 달려있다.
- 전에 첫 번째 미로 재판, 문 앞에 (2cm X 2cm) 측면에 상처가 발생 개별 케이지 바닥에 추가 동물 '홈 새장에서 사용되는 것과 같은 종류의 신선한 침대 자료 의사 가정 새장을 준비합니다. 플레이스 와이어 이러한 케이지 보틈스 개별적으로 숫자들을, 테스트 일대의 각 동물에 대해 하나에 기껏해야. 이 케이지는 시험 기간의 기간 동안 각 동물에 대한 개별 의사 가정 버팀대 역할을합니다. 우리가 스트레스의 역할 및 / 또는 학습과 기억의 행동 불안 관련을 조사하고 있기 때문에, 우리는 개별적으로 자신의 홈 새장에 주택 마우스를 피하기 위해 가짜 가정 새장을 사용합니다. 그러나 이러한 요소가 주요 관심사되지 않은 경우, 동물은 단독으로 성공 미로 탐색을위한 홈 연습장으로 사용할 수있는 문 앞에 이러한 케이지와 함께 수정된 홈 새장에서 지내게 될 수 있습니다.
2. 시험 :
- 그들이 테스트 환경에 적응하도록 테스트하기 전에 매일은 동물 행동 테스트 룸 1 시간 최소 이동됩니다.
- 시험 시작 시간, 음식과 물을 전에 삼십 분은 모든 홈 케이지에서 제거됩니다. 생쥐의 도달의 동작 테스트 룸지만, 밖에서 음식과 물을 보관하십시오. 음식과 물은 일반적으로 피크 먹이가 발생한 후, 어둠의 단계로 빛의 단계에서 변경 후 30 분 제거됩니다. 이것은 동물이 대부분 유지됩니다 식량과 물 만족을 했소 이전 테스트에 있지만,이 기간 동안 테스트하는 작업이 완료되면 더 명백한 음식이나 물이 보상이없는 경우에도 미로를 탐색하는 소정의 추가 동기 력을 제공합니다.
- 30 분 pretest 기간이 경과 후 70 % 에탄올로 미로를 청소하십시오. 무기가 닫힌 미로에 시작 상자에서 이어지는 문을를 남겨주세요. 목표 상자의 양쪽에있는 문은 열려 남아 있습니다.
- 목표 상자의 끝에 최초의 동물에 해당하는 의사 가정 케이지를 놓습니다.
- 손에 그것을 컵, 미로 가장 먼저 마우스를 운반. 시작 상자에 마우스를 넣고 뚜껑을 교체하십시오.
- 방해없이 미로를 관찰하는 위치에서 시작 상자 문을 열고 즉시 세 스톱워치를 시작하면.
- 마우스의 모든 푸르 포스가 시작 상자를 떠난 경우, 시작 상자 문을 닫고 첫번째 타이머를 중지합니다.
- 손으로 그것이 미로를 탐색으로 마우스가 여행 경로를 기록합니다. 마우스는 모든 푸르 포스가 (그림을 참조하십시오. 1) 그 지역에 건너가 미로의 새로운 영역이나 팔을 들어갑니다.
- 모든 푸르 포스가 목표 상자를 입력하면, 미로와 목표 상자 사이에 최고의 문을 닫고 두 번째 스톱워치를 중지합니다.
- 마우스 완전히 의사 가정 케이지를 입력했을 때, 목표 상자와 새장 사이에 문을 닫습니다. 세 번째 스톱워치를 중지합니다.
- 세 스톱워치의 시간을 기록합니다. 마우스가 만들었 오류의 개수를 계산합니다. (. 예를 들어, 암 L에서 영역 K려고, 그림 1) 오류는 막다른 궁지 영역에 항목으로 정의하거나 (예에서가는 미로의 이미 여행을 팔로 다시 여행 암 C로 암 F, 그림 1).. 그것이 발생으로 우리가 마우스 성능을 점수 있지만, 그것은 눈 또는 자동 소프트웨어 중 후속 점수 있도록 녹화하는 것이 가능하거나 기록 미로의 재판이다. 실험자의 판단은 적절한 방법을 선택하는 데 사용해야합니다.
- 자사 홈 케이지에 반환하기 전에 1 분에 대한 의사 가정 케이지에있는 동물을 둡니다.
- 테스트 일대의 모든 마우스에 대해 2.12 단계 2.3를 반복합니다.
- 일대의 마지막 마우스의 홈 케이지에 반환되면, 30 분 타이머를 시작합니다. 이 30 분 기간의 끝에, 일대의 모든 마우스에 음식과 물을을 반환하고 그들의 식민지 룸으로 동물을 반환합니다.
- 일대의 모든 마우스가 정의된 학습 기준에 도달하거나 미리 정해진 N 때까지 때까지, 동물 테스트를 하루에 한 재판과 박이 절차를 반복테스트 실험의 엄버가 발생했습니다. 마우스가 연속 2 시련에 0 또는 1 오류 (들)과 함께 작업을 수행할 수있을 때 미로를 배운 데로 분류됩니다. 생쥐는 연속 실험에서 같은 순서로 테스트합니다.
3. 대표 결과 :
(기준에 도달) 배우 일을 분석하고 특정 연구에서 다른 그룹 (Figs. 2A와 3A) 사이 비교할 수 있습니다. 또한, 미로 수집을 특징 학습 색인 (비율을 학습), 테스트 기간 (Figs. 2B와 3B)의 처음 4 일 동안 평가할 수 있습니다. 학습 지수는 올바른 경로 세그먼트의 개수의 비율은 각 재판을 위해 여행 경로 세그먼트의 총 숫자로 여행을합니다. 평균 학습 지수는 생쥐가 먼저 미로에 노출 기회가 탐색 아르 재판 1, 약 0.5하여야한다. 표시 시련이와 4 사이의 학습 인덱스 증가 및 접근 방법 1 학습이 발생합니다. 그림 2, 젊은 (2 MO)과 노화 (24 MO)에서 남성 C57Bl/6NCr 마우스는 최대 15 실험을위한 레쉴리의 미로에서 훈련했다. 젊은 쥐들이 (± 1.5) 7.2에서 디 미로를 배웠습니다 반대로, 노화 동물 11.7했다 (± 2.1) D 기준에 도달합니다. 한 꼬리 T - 테스트, 사전 가설을 배울 수 일 노령화에 오래되어 있으며, 미로를 ([t (23) = 1.59, P = 0.056] 배우 걸릴 노화 C57Bl/6NCr 마우스에 대한 강력한 추세가 발생했습니다 쥐). 학습 인덱스 계산하면, 두 연령 그룹 4 (P는 <0.001 시간의 중요한 주요 효과)를 통해 실험 2에서 학습 인덱스에서 꾸준한 증가를 보여줍니다. 그러나, 젊은 C57 마우스 및 오래된 C57 생쥐 (연령 P = 0.58의 주요 효과) 사이의 학습 인덱스에 통계적으로 의미있는 차이가 없었다.
그림 3은 동작을 학습에 대한 배경 변형율의 영향을 조사 연구의 대표입니다. 젊은 남성 C57Bl/6NCr에서 데이터 그림에 표시됩니다. 2 이제 젊은 CRL의 데이터에 비해 다음과 같습니다 CD - 1 (ICR) BR 마우스 [CD - 1, 4-5 MO]. CD - 1 마우스 (± 1.4) 4.5에서 레쉴리 III의 미로를 배운 D 있지만, (배우 일 변종 사이에 상당한 차이가없는 그림 3A, [T (18) = 1.328, P = 0.20], 2 꼬리 T - 테스트). 모든 동물들이 우연히 최초의 재판에 미로를 탐색하는 동안, CD - 1 마우스가 (변형 P <0.001의 주요 효과) 더 빨리 작업을 배운, 학습 인덱스 쇼의 대비 시험으로. 이 C57Bl/6NCr 마우스에 비해 CD - 1 마우스에서 4 시련 2 학습 색인에 통계적으로 의미있는 증가에 의해 그림입니다. 흥미롭게도, CD - 1 마우스가 기준에 도달되는 지점을 넘을 미로에서 훈련을 계속한다면, 그들은 아래에보다 자세히 설명하고있는 (그림 4) overtraining 나타내는 동작을 나타냅니다.
그림 1 :. 레쉴리 III의 미로 미로의 막다른 궁지 영역은 설명의 목적으로만이 다이어그램에서 붉은 색입니다. 기본과 실제 미로의 무기 고체 색상 (삽입된 페이지)입니다. 미로는 (텍스트 크기) 규모로 그린 것입니다.
그림 2 : 2 및 24 개월 된 남자 C57Bl/6NCr 마우스의 레쉴리 III의 미로 성능 레쉴리 III의 미로가 경로 젊은 (2 MO)과 노화 (24 MO) 남성 C57Bl/6NCr 마우스에서 학습 평가하는 데 사용되었다.. 측정 매개 변수 기준, 0 오류 또는 1 오류가 연속 2 일간 미로를 실행하는 마우스에 필요한 일수에 (A) 일했다, 및 (b) 학습 지수, 올바른 안경 포 팔 항목의 수를 레쉴리 III의 미로 테스트 일 1-4에 만들어 팔 항목의 총 수를 비교했다. 그룹당 동물의 숫자가 N되었습니다 24개월 된 생쥐에 대한 개월 2와 N = 15 = 10.
그림 3 : 젊은 남성 C57Bl/6NCr 및 CD - 1 마우스에서 레쉴리 III의 미로 성능 레쉴리 III의 미로는 2 개월 C57Bl/6NCr 및 4-5개월 된 CD - 1 마우스의 학습 경로를 평가하는 데 사용되었다.. 측정 매개 변수 기준, 0 오류 또는 1 오류가 연속 2 일간 미로를 실행하는 마우스에 필요한 일수에 (A) 일했다, 및 (b) 학습 지수, 올바른 안경 포 팔 항목의 수를 레쉴리 III의 미로 테스트 일 1-4에 만들어 팔 항목의 총 수를 비교했다. 그룹당 동물의 숫자는 CD - 1 마우스에 대한 C57Bl/6NCr와 N = 10 N = 10했다. 통계 significances : * P <0.05, ** P <0.01 대 C57Bl/6NCr 쥐.
그림 4 : 4-5개월 된 남성 CD - 1 마우스에서 레쉴리 III의 미로 성능 레쉴리 III의 미로.경로가 15 일 연속에 만불 4-5개월 된 남성 CD - 1 마우스에서 학습 평가하는 데 사용되었다. 측정 매개 변수 4 - 포 막다른 궁지 영역에 항목이나 미로의 이미 여행 팔을 여행으로 정의 오류로, 하루에 만들어진 오류 (A) 숫자했다, 및 (b) 시간은 하루 미로에서 보냈습니다. 기준에 도달했습니다되는 일은 빨간색 화살표로 표시됩니다.
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Discussion
학습과 기억을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 설치류 행동 테스트 모리스 물 미로와 공포 컨디셔닝 2 변종입니다. 이러한 테스트 작업 3 완료 동물 동기를 부여하기 위해 학습과 aversive의 자극 (예, 물, footshock)에 대한 시각 또는 청각 신호에 의존하고 있습니다. 노화 설치류 동물에서 노화 인간과 같이 감각 modalities 시간이 지남에 거절합니다. 마우스의 몇 가지 배경 변종들은 청력을 잃게하거나 나이 백내장을 개발하고, 물 부족의 23.5 H들은 4 나이 마우스의 증가 표시되었습니다 사망률 속도 후. 따라서,이보다 널리 사용되는 검사의 성능 변화는 노화 설치류에서 해석하기 어려울 수 있습니다.
레쉴리 III의 미로 처음 1929 5 칼 레쉴리에 의해 설명되었다. 레쉴리 대뇌 피질의 lesioning 기법을 사용하여 피질에서 메모리 engram 검색이 패러다임을 사용합니다. 우리는 약간 노화 설치류와 관련된 연구는 광범위한 응용 수 있도록 원래의 미로를 수정했습니다. 우리는 미로의 음식 보이기 탐색을 제거하고 의사 가정 케이지 환경 미로 1 탐색할 젊은 노화 모두 마우스 충분한 동기를 제공하는 증명하고있다. 다른 수사관은 또한 레쉴리 III의 미로 7 학습 촉진하는 식품 펠렛의 보상을 활용했습니다. 시각 보이기 navigation, 찾기 모리스 물 미로와 반스 원형의 미로에 필요한 그런식으로, 2,6,8을 최소화했습니다. 마우스로 레이디얼 암 미로, Y - 미로와 T - 미로 작업 2,9-10의 여러 변형에 필요한 자신의 몸무게의 90 %를 박탈 음식되지 않습니다. 오히려, 음식과 물 동물 광고 libitum 사용할 수 있습니다되며 일반적으로 활성 어두운 단계에서 일어나는 테스트 각 테스트 재판 전에 30 분 제거됩니다. 음식은 작업을 완료 일대의 마지막 마우스 후 30 분 반환하고 의사 가정 케이지로 반환에서 temporally만큼 작업을 완료 명백한 보상 역할을하지 않는 dissociated입니다. 중요한 것은, 전체 코호트를 위해 음식과 물을 unavailability 재판 당 4-5 H의 기간을 넘어 연장해서는 안됩니다. 또한 다른 실험 그룹을 나타내는 생쥐 같은 밤, 함께 테스트해야합니다.
레쉴리 III의 미로의 모듈화가 유지 학습의 다양한 측면을 테스트하기위한 수정을 허용합니다. 생쥐는 작업, 즉를 완료하려면 반대 방향으로 회전해야하므로 예를 들어, 인수가 특정 구성에서 미로가 발생하면서 한번 인수가 설립, 미로는 회전 수, 마우스 바로 시작 상자에 나오는 바뀝니다 에 성공적으로 취득하는 동안 미로를 탐색하지만, 학습 (리콜)의 유연성은 생쥐가 성공 탐색의 시작 상자 밖으로 좌회전해야하므로 그 미로를 회전하여 측정할 수 있습니다. 시험 절차의 추가 유사 시간 (보통 14 D)의 세트 기간 동안 학습을 수립하고 미로 학습의 보존을 측정하는 후 몇 주간의 지연 간격을 수 있습니다. 고정 간격 파일럿 작업에 의해 설립해야하고 study-/strain-dependent 있습니다. 긴 훈련 세션 이상 보존 간격과 관련된 경향이 있습니다. 레쉴리 III의 미로 절차 자체의 수정이 성공적으로 미로 탐색을위한 추가적인 동기를 제공하기 위해 악취 신호 또는 노이즈 자극을 추가 포함됩니다. 이러한 구속 응력과 같은 스트레스는 동안, 이전에 다른 시간에 적용할 수 있습니다, 또는 인수 후에 주 종속적인 학습과 기억을 조사합니다.
레쉴리 III의 미로를 구현할 때 고려해야 할 중요한 요소는 교육 간격의 기간입니다. C57Bl / 6, 스위스 웹스터, 그리고 재조합 근친 쥐를 BXD 포함하여 근친과 outbred 생쥐의 대부분 사용할 수 계통, 14 일 이내에 학습 기준에 도달할 것입니다. 특히 일부 변종, CD - 1 마우스, 그냥 7 일 후 기준에 도달. 생쥐의 일부 변종의 Overtraining하면 미로의 탈선 행위를 생산, 궁극적 마우스는 시험 시간과 미로를 탐험 지출 당 만들어진 오류의 개수에 꾸준한 신속한 증가를 보여주기 시작합니다. 그림 4 4-5 개월 된 수컷 CD - 1 마우스에서 overtraining의 대표입니다. 미로 가장 먼저 노출 후에, 우리는 각각의 마우스에 대한 재판 당 15 분 컷 - 오프 기간을 연구소. 15 분 후, 마우스는 의사 가정 케이지에 미로를 통해 LED이며, 15 분 표시에 도달했습니다 일단 오류는 계산되지 않습니다. 코호트 또는 큰 연구에 여러 쥐가 학습 기준에 도달 후 미로를 통해 주도해야하는 경우,이 overtraining 나타내는 수 있습니다. overtraining 문제를 회피하고 전반적인 테스트 기간을 단축하기 위해, 우리는 몇 가지 연구에서 네번이나 재판으로 수집 단계를 제한하고 학습 점수를 결정하기 위해 3 번째와 4 번째 실험에서 학습 인덱스를 평균 있습니다. 이 교육 점수는 대신에 비교할 수 있습니다배우 일.
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Disclosures
모든 행동 프로토콜은 펜실베니아 주립 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 보고서에는 재정 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이러한 실험에 사용되는 레쉴리 III의 미로는 팀 Bowmaster, 폴 코먼, 배리 Dutrow, 라이언 Jabco, 그리고 펜실베니아 주립 대학 물리 부서 머신 샵에서 팀 Treaster에 의해 지어졌습니다. 저자는 그림 2-4 제시 실험을 수행 도움을 부인 Shoba Belegundu, 미스 타라 Chrzanowski, 부인과 알렉 산드라 루이스에게 감사를 표합니다. 미스터 월터 잭슨은이 프로토콜의 준비에 소중한 피드백을 제공했습니다. 이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (MH064756와 AMA에 MH077978)에서 기금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 정신 건강이나 국립 보건원의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
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