Summary
Lashley III labirent caydırıcı uyaran ya da görsel ipuçları dayanmaz bir rota-öğrenme görevi. Bu nedenle, özellikle yaşlanma fareler ya da başka stres dikkate, öğrenme ve hafıza değerlendirmek için son derece cazip bir seçenek.
Abstract
Kemirgenler öğrenme ve bellek değerlendirmek için tasarlanmış birçok davranış testleri, özellikle fare, görev satın motive etmek için görsel ipuçları, gıda ve / veya su kısıtlaması ya da başka bir caydırıcı stimuli güveniyor. Hayvanların yaş, duyu modaliteleri bozulabilir. Örneğin, farelerin birçok suşları işitme açıkları ya da katarakt gelişir. Görev edinimi sırasında fareler kılavuzu için gerekli olan sinir sistemi değişiklikleri, yaşlı hayvanlarda öğrenme değişiklikleri yorumlamak potansiyel boşa mevcut. Ayrıca, farelerin stres diferansiyel hassasiyetleri ile karşılaştırırken hayvanların görevleri öğrenmek için motive etmek için caydırıcı stimuli kullanımı potansiyel karıştırıcı. Bu tür kafa karıştırıcı etkileri en aza indirmek için, biz Lashley III labirentin değiştirilmiş bir versiyonu hayata geçirdik. Bu labirent fareler 0 ile bir yol, bir sözde ev kafesine başlangıç konumum gezinmek kadar veya düşük stres koşulları, örneğin karanlık faz, hiçbir gıda / su kısıtlaması altında tekrarlanan maruz kalma ile bir labirent gezinmek için öğrenmek sayede rota öğrenme, dayanmaktadır iki ardışık çalışmalar hakkında 1 hata (lar). Bu keşif, görevin labirent ve öğrenme teşvik etmek için caydırıcı stimuli dayanmaz çünkü bu, düşük bir stres davranış testi olarak sınıflandırmak. Cihaz modüler bir başlangıç kutusu, 4 kol labirent vücut ve bir gol kutusu oluşur. Hedefi kutusunun sonunda hayvanın evde kafes içinde bulunan ve labirent test süresi için her hayvan için belirli benzer yataklar içeren bir pseudo-ev kafes. Bu pseudo-ev kafes yön öğrenmek için fareler motive etmek için yeterli ödül sağladığı daha önce gösterilmiştir oldu
Protocol
1. Hazırlanması:
- Lashley III labirent Pleksiglas inşa edilmiştir ve Şekil 1'de gösterilmiştir. Başlangıç kutusu, labirent silah ve hedef kutusu labirent temizlik ve değiştirilebilirlik izin vermek için modüler. Dışarıdan ve labirent içinde görsel ipuçları ortadan kaldırmak için siyah pleksiglas başlangıç kutusu, labirent silah ve hedef kutusu duvarları inşa edilmiştir. Labirent silah, uzun 7 cm yüksekliğinde 45 cm ve 5 cm genişliğinde. Labirent ardışık silah önde gelen Kapılar x 4 cm, 4 cm ve dış duvarlardan labirent 11 cm bulunmaktadır. Amacı kutusu 19,5 cm uzunluğunda x 7 cm x 5 cm genişliğinde. Başlangıç kutusu 8 cm x 9,5 cm x 7 cm. Ayrı açık Pleksiglas adet kaçan fareler önlerken labirent aracılığıyla ilerledikçe her fare görselleştirme izin başlangıç kutusu, labirent, ve hedef kutusu üstüne yerleştirilir. Labirent üç adet labirent artı hayvan standart ev kafes gibi aynı boyutta bir pseudo-ev kafes içine alabilecek kadar büyük olan kırmızı pleksiglas inşa edilen bir temel üzerinde durmaktadır.
- Pseudo-ev kafesleri öncesi, ilk labirent deneme, kapı (2 cm x 2 cm), yanlarda oyulmuş olan bireysel kafes dipleri eklenir gibi hayvanların ev kafeslerde kullanılan aynı tür taze yatak malzemesi hazırlamak için. Yeri tel bu kafes dipleri ve sayısı onları, bir test kohort her hayvan için ayrı ayrı başında yer alıyor. Bu kafesler, test zaman diliminde süresi için her hayvan için ayrı bir pseudo-ev kafesleri olarak hizmet verecek. Stres rolleri ve / veya öğrenme ve hafıza davranışların anksiyete ilgili soruşturma olduğundan, biz tek tek evlerine kafesleri konut fareleri önlemek için pseudo-ev kafesleri kullanın. Ancak, bu faktörlerin temel kaygısı değilseniz, hayvanlar, başarılı bir labirent navigasyon için ev kafesleri olarak hizmet verebilir kapı ve bu kafesleri ile modifiye ev kafeslerde tek başına ev sahipliği olabilir.
2. Test:
- Her gün onları test ortamı gelmesini bekleyin test etmeden önce, hayvanların davranış test odası en az bir saat taşınır.
- Otuz dakika önce test başlangıç zamanı, gıda ve su tüm ev kafesleri kaldırılır. Farelerin ulaşabileceği davranışını test odası ama dışarı yiyecek ve su tutun. Gıda ve su genellikle tepe besleme meydana geldikten sonra, karanlık faz ışık aşamasından değişiklikten sonra 30 dakika kaldırılır. Bu hayvanların çoğu gıda ve su tok Test öncesinde, ancak bu dönemde test görevin tamamlanmasından sonra hiçbir aşikar yiyecek veya su ödül olsa bile, labirent gezinmek için küçük ek bir motivasyon sağlar.
- 30 dakika öntest süre geçtikten sonra, labirent% 70 etanol ile temizleyin. Başlangıç kutusu önde gelen kapı kollarını kapalı labirentin içine bırakın. Hedef kutusunun her iki ucunda kapıları açık bırakılır.
- Hedefi kutusunun sonunda ilk hayvan karşılık gelen sözde ev kafes yerleştirin.
- Elinizde yuvarlayarak, labirent ilk fare taşıyın. Başlangıç kutusuna fare koyun ve kapağı değiştirin.
- Pozisyonda engel olmadan labirent gözlemlemek için, başlangıç kutusu kapağını açın ve hemen üç stopwatches başladığınızda.
- Fare dört pençeleri başlangıç kutusu yapmamışlar, başlangıç kutusunun kapağını kapatın ve ilk Sayacı durdurmak.
- Elle fare labirent gider olarak yolculuk yolun kaydedin. Bir fare, dört patisinin (Bkz. Şekil 1) bu alana geçti labirent yeni bir bölge veya kol girer.
- Dört pençeleri hedef kutusu girdiğinizde, labirent ve hedef kutusu arasında önde gelen kapıyı kapatın ve ikinci kronometreyi durdurmak.
- Hedef kutusu ve kafes arasındaki fare tamamen pseudo-ev kafes girdiğinde, kapıyı kapatın. Üçüncü kronometre durdurun.
- Üç stopwatches kez kaydedin. Fare yaptı hataların sayısını. (Örneğin, kol L bölge K; Şekil 1) bir hata, bir çıkmaz cul-de-sac bölgeye bir giriş olarak tanımlanır (örneğin, giden labirent zaten gitti, bir kolu ile geçmişe yolculuk kol için kol C F; Şekil 1). Oluştuğunu olarak fare performans skoru, göz veya otomatik yazılım yoluyla sonraki puanlama izin vermek için, video kaset için mümkün ya da başka rekor labirent çalışmalarda. Deneyci takdirine uygun bir yöntem seçmek için kullanılmalıdır.
- 1 dakika için pseudo-ev kafeste hayvan evde kafes dönmeden önce bırakın.
- Test kohort tüm fareler için 2.3 ve 2.12 adımları tekrarlayın.
- Kohort son fare evde kafes iade edildiğinde, 30 dakika zamanlayıcı başlar. Bu 30 dakika süre sonunda, kohort tüm fareler yiyecek ve su geri ve hayvanlar, sonra onların koloni odasına geri.
- Kohort tüm fareler tanımlanan bir öğrenme kriterlere ulaşmış veya önceden belirlenmiş bir n kadar kadar, hayvan başına günlük test başına bir deneme ile, arka arkaya geceleri bu prosedürü tekrarlayın.test çalışmaların koyu kahverengi oluştu. 0 veya 1 hata (lar), birbirini takip eden iki çalışmalarda görev gerçekleştirebilirsiniz labirent öğrenilen bir fare olarak sınıflandırılır. Fareler başarılı çalışmalar hakkında aynı sırayla test edilmektedir.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
(Ölçüt ulaşmak) öğrenmek için gün analiz edilebilir ve farklı gruplar belirli bir çalışmada (Şekil 2A ve 3A) arasında karşılaştırıldı. Ayrıca, labirent satın alma karakterize bir öğrenme indeksi (oranı öğrenme), test süresi (Şekil 2B ve 3B), ilk dört gün içinde değerlendirilebilir. Öğrenme endeksi doğru yolu segmentlerinin sayısı oranı yolu segmentlerinin toplam sayısı, her deneme için gitti gitti. Ortalama öğrenme indeksi fareler labirent ilk maruz kalan ve şans eseri navigasyon deneme 1, yaklaşık 0,5 olmalıdır. Belirten çalışmalarda 2 ve 4 arasında öğrenme indeksi artar ve yaklaşımlar 1 öğrenme gerçekleşiyor. Şekil 2, genç (2 ay) ve yaşlanma (24 ay), erkek C57Bl/6NCr fareler 15 denemeler için Lashley labirent konusunda eğitilmiştir. Genç farelerde (± 1.5) 7.2 d. labirent öğrendim Buna karşılık, yaşlanma hayvanların aldı 11.7 (± 2.1) d kriter ulaşmak için. Tek uçlu t-testi, a priori bir hipotez öğrenmek için gün yaşlanma daha uzun olduğunu; labirent ([t (23) = 1.59, P = 0.056] öğrenmek için daha uzun sürebilir yaşlanma C57Bl/6NCr fareler için güçlü bir eğilim vardı fareler). Öğrenme indeksi hesaplandığında, her iki yaş grupları çalışmalarda 2, 4 (p <0.001 kez önemli bir temel etkisi) yoluyla öğrenme endeksi istikrarlı bir artış göstermektedir . Ancak, öğrenme indeksi genç C57 fareler ve eski C57 fareler (yaş P = 0.58 ana etkisi) arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar vardı.
Şekil 3 davranış öğrenme arka plan suşu etkilerini inceleyen çalışmalar temsilcisidir. Genç erkek C57Bl/6NCr elde edilen veriler Şekil. 2 genç CRL verileri ile karşılaştırıldığında: CD-1 (ICR) BR farelerde [CD-1, 4-5 ay]. CD-1 fareler (± 1.4) 4.5 Lashley III labirent öğrendim d, ancak öğrenmek için (gün suşları arasında anlamlı bir fark yoktu Şekil 3A, [t (18) = 1,328, P = 0.20]; iki kuyruklu t-testi). Kontrast, sınav tüm hayvanlar tesadüfen ilk deneme labirent seyreden iken, CD-1 fareler (suşu p <0.001 ana etkisi) daha hızlı bir şekilde görev öğrendim, öğrenme indeksi gösterir. Bu C57Bl/6NCr farelere kıyasla CD-1 farelerde çalışmalarda 2 ile 4 arasındaki öğrenme indeksi istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterilmiştir. İlginçtir, CD-1 farelere kriter ulaşma noktanın ötesinde labirent yetiştirilmek üzere devam ederse, bunlar aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır (Şekil 4) overtraining göstergesidir davranış sergilerler.
Şekil 1: Lashley III labirent labirent çıkmaz cul-de-sac bölgeleri sadece bilgi amaçlıdır için bu şemada kırmızı boyalı. Taban ve gerçek labirent silah katı renk (inset). Labirent (metin boyutları) ölçekli çizilir.
Şekil 2: 2 ve 24 aylık erkek C57Bl/6NCr fareler Lashley III labirent performans Lashley III labirent rota genç (2 ay) ve yaşlanma (24 ay) erkek C57Bl/6NCr farelerin öğrenme değerlendirmek için kullanılmıştır. Ölçülen parametreler kriteri, bir fare labirent 0 hataları veya 1 hata ile iki gece üst üste çalıştırmak için gerekli gün sayısı (bir) gün; ve (b) öğrenme indeksi, doğru dört pençe kol girişlerin sayısı Lashley III labirent testi, 1-4 gün yapılan kol girişleri toplam sayısı karşısında yaptı. Grup başına hayvan sayısı n = 10, 24 aylık fareler için aylık 2 ve n = 15 için.
Şekil 3: Lashley, genç erkek C57Bl/6NCr ve CD-1 farelere III labirent performans Lashley III labirent 2 aylık C57Bl/6NCr ve 4-5 aylık bir CD-1 farelerin öğrenme yolu değerlendirmek için kullanılmıştır. Ölçülen parametreler kriteri, bir fare labirent 0 hataları veya 1 hata ile iki gece üst üste çalıştırmak için gerekli gün sayısı (bir) gün; ve (b) öğrenme indeksi, doğru dört pençe kol girişlerin sayısı Lashley III labirent testi, 1-4 gün yapılan kol girişleri toplam sayısı karşısında yaptı. Grup başına hayvan sayısı, CD-1 fareler için C57Bl/6NCr ve n = 10 n = 10 idi. İstatistiksel anlamlar: * p <0.05, ** p <0.01 karşı C57Bl/6NCr fareler.
Şekil 4: 4-5 aylık erkek CD-1 farelere Lashley III labirent performans Lashley III labirent.rota, 15 gün üst üste on 4-5 aylık erkek CD-1 farelerin öğrenme değerlendirmek için kullanıldı. Hergün yapılan hataların dört pençe bir çıkmaz cul-de-sac bölgeye giriş veya labirentin zaten gitti kol seyahat olarak tanımlanan bir hata ile ölçülen parametreler (a) numarası; ve (b) Hergün labirent geçirdi. Kriteri ulaşmıştır hangi gün kırmızı bir ok ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öğrenme ve hafıza değerlendirmek için en sık kullanılan kemirgen davranış testleri Morris su labirenti ve korku klima 2 türevleri. Bu testler, görevleri tamamlamak için 3 hayvanlar motive etmek için, öğrenme ve caydırıcı bir uyarana (örneğin, su, footshock) görsel veya işitsel ipuçları güveniyor. Yaşlanma kemirgenler, yaşlı insanlarda olduğu gibi, duyu modaliteleri zamanla azalacaktır. Farelerde çeşitli arka plan suşları işitme kaybetmek veya onlar yaş olarak katarakt geliştirmek ve su kısıtlaması 23.5 saat 4 yaş olarak farelerde artırdığı gösterilmiştir mortalite oranları sonra. Bu nedenle, bu daha yaygın olarak kullanılan testler performans değişiklikler yaşlanma kemirgenler yorumlamak zor olabilir.
Lashley III labirent ilk 1929 5'te Karl Lashley tarafından tarif edilmiştir. Lashley, kortikal lezyon teknikleri kullanarak kortekste bellek uyarıların beyinde bıraktığı iz aramak için bu paradigma kullandı. Biz biraz yaşlanma kemirgenler ilgili çalışmalara geniş uygulanabilirliği için izin Orijinal labirent değiştirdiniz. Biz labirentin gıda cued navigasyon bertaraf ve bir sözde-ev kafes ortamı labirent 1 gezinmek için genç ve yaşlanma hem de fareler için yeterli motivasyon sağladığını göstermiştir. Diğer araştırmacılar da Lashley III labirent 7 öğrenmeyi kolaylaştırmak için bir gıda pelet ödül kullanmış olurlar. Görme cued navigasyon, Morris su labirenti ve Barnes dairesel labirent gerekli olduğu gibi, 2,6,8 minimize edilmiştir. Fare gibi radyal kollu labirent, Y-labirent ve T-labirent görevleri 2,9-10 çeşitli varyasyonlar için gerekli olan, kendi vücut ağırlığının% 90 yoksun gıda değildir. Aksine, yiyecek ve su hayvanlar ad libitum mevcuttur ve genellikle aktif karanlık aşamasında yer alan test ile her test deneme sadece 30 dakika önce kaldırılır. Gıda 30 dakika görev tamamlandı bir seride son fare sonra geri döndü ve sözde ev kafesine geri dönüş zamansal olarak aşikar görevi tamamlamak için bir ödül olarak hareket etmek değil ayrışmış. Daha da önemlisi, tüm kohort için yiyecek ve su olmaması deneme ortalama 4-5 saat bir süre ötesine olmamalıdır. Buna ek olarak, farklı deney grupları temsil eden fareler aynı gece birlikte test edilmelidir.
Lashley III labirentin modülerlik tutma öğrenmenin farklı yönlerini test etmek için tasarlanmış değişiklikler için izin verir. Örneğin, farelerde ters yönde, yani görevi tamamlamak için açmak gerekir, böylece satın alma, belirli bir yapılandırma labirent ile oluşur ederken, bir kez satın alma kurulan labirent döndürülmüş olabilir, fare sağ başlangıç kutusu çıkan dönecek başarıyla satın alma sırasında labirent gezinmek, ama esnekliği öğrenme (hatırlama), farelerin başarılı bir navigasyon için başlangıç kutusu sola dönün böylece labirent dönen ölçülebilir. Zaman (genellikle 14 d) belirli bir süre için öğrenme kurulması ve labirent öğrenme tutma ölçülen birkaç hafta sonra bir gecikme aralığı sağlayarak test prosedürü Ek varyasyonları içerir. Tutma aralıklarla pilot çalışma tarafından kurulmuş olması gerekir ve study-/strain-dependent. Daha uzun eğitim oturumları, uzun tutma aralıkları ile ilişkili olduğu eğilimindedir. Lashley III labirent prosedürü kendisi Değişiklikler, başarılı bir labirent navigasyon için ek bir motivasyon sağlamak için, koku ipuçları ve gürültü uyaranlara ekleyerek içerir. Kısıtlama stresi gibi stres sırasında, önce farklı zamanlarda uygulanabilir, ya da satın alma işleminden sonra devlet-bağımlı öğrenme ve hafıza araştırmak için.
Lashley III labirent uygularken akılda bulundurulması gereken önemli bir faktör, eğitim aralığının süresi. C57BL / 6, İsviçre Webster ve rekombinant kendilenmiş fareler BXD dahil kendilenmiş ve outbred farelerin çoğu suşları, 14 gün içinde öğrenme kriter ulaşacak. Bazı suşları, özellikle CD-1 fareler, sadece 7 gün sonra ölçüt ulaşır. Farelerin bazı suşları Overtraining labirentinde anormal davranış üretir, neyin fareler deneme ve zaman labirenti keşfetmek geçirdi başına yapılan hataların sayısında istikrarlı ve hızlı bir artış göstermeye başlayacak . Şekil 4 4-5 aylık erkek CD-1 farelere overtraining temsilcisidir. Labirent ilk maruz kaldıktan sonra, her bir fare için deneme başına 15 dakika cut-off döneminde enstitüsü. 15 dakika sonra, fare labirent aracılığıyla sözde ev kafesine yönetiliyor ve 15 dakika işareti ulaşıldığında hataları sayılmaz. Bir kohort veya birkaç büyük bir çalışmada, fareler labirent aracılığıyla öğrenme kriterlere ulaştıktan sonra yol açtı gerekiyorsa, bu overtraining göstergesidir. Overtraining ile sorunları aşmak için ve genel test süresini kısaltmak için, satın alma aşamasında bazı çalışmalarda dört denemeler sınırlı ve bir öğrenme skoru belirlemek için üçüncü ve dördüncü çalışmalarda öğrenme indeksi ortalaması var. Bu öğrenme puanı yerine göre olabiliröğrenmek için gün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm davranış protokolleri Pennsylvania State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Rapor için herhangi bir mali açıklamalar vardır.
Acknowledgments
Bu deneyler için kullanılan Lashley III labirent Tim Bowmaster Paul Corman, Barry Dutrow, Ryan Jabco, ve Pennsylvania State Üniversitesi Fizik Bölümü Makine Atölyesi Tim Treaster tarafından inşa edilmiştir. Yazarlar Şekil 2-4 sunulan deneyler konusunda yardım almak için Bayan Shoba Belegundu, Bayan Tara Chrzanowski, Bayan Alexandra Lewis teşekkür etmek istiyorum. Walter Jackson, bu protokolün hazırlanması değerli geribildirim. Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (MH064756 ve MH077978 AMA) fon tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka, Ulusal Ruh Sağlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lashley III maze | PSU Physics Machine Shop | N/A | Maze must be custom-built, not commercially available |
References
- Blizard, D. A. Return to home cage' as a reward for maze learning in young and old genetically heterogeneous mice. Comparative Med. 56, 196-201 (2006).
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse?: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd ed, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2007).
- Blizard, D. A., Klein, L. C., Cohen, R., McClearn, G. E. A novel mouse-friendly cognitive task suitable for use in aging studies. Behav. Genet. 33, 181-189 (2003).
- Warren, J. Appetitive learning by old mice. Exp. Aging Res. 12, 99-105 (1986).
- Lashley, K. Brain mechanisms and intelligence: A quantitative study of injuries to the brain. , University of Chicago Press. Chicago. (1929).
- Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93, 74-104 (1979).
- Matzel, L. D. Individual differences in the expression of a general learning ability in mice. J. Neurosci. 23, 6423-6433 (2003).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Hepler, D. J., Wenk, G. L., Cribbs, B. L., Olton, D. S., Coyle, J. T. Memory impairments following basal forebrain lesions. Brain Res. 346, 8-14 (1985).
- Sci, B. ehavB. rain 2, 313-313 (1979).
