A Simple Composite Fenotype Scoring System voor het evalueren van muismodellen van cerebellaire ataxie

Summary

Beschrijven we een protocol voor de snelle en gevoelige kwantificering van de ernst van de ziekte in muismodellen van cerebellaire ataxie. De maatregelen omvatten achterste ledematen clasping, richel te testen, manier van lopen en kyphose. Dit protocol discrimineert effectief tussen de getroffen en niet-getroffen individuen, en detecteert de progressie van de getroffen personen in de tijd.

Abstract

Beschrijven we een protocol voor de snelle en gevoelige kwantificering van de ernst van de ziekte in muismodellen van cerebella ataxie. Het is afgeleid van eerder gepubliceerde fenotype assessments in diverse ziekte-modellen, waaronder spinocerebellaire ataxieën, Huntington en ziekte en spinobulbar spieratrofie. De maatregelen omvatten achterste ledematen clasping, richel te testen, manier van lopen en kyphose. Elke maatregel is opgenomen op een schaal van 0-3, met een totaal van 0-12 voor alle vier de maatregelen. De resultaten effectief onderscheid maken tussen aangetast en niet-getroffen individuen, terwijl ook het kwantificeren van de tijdelijke progressie van neurodegeneratieve ziekte fenotypes. Maatregelen kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd of gecombineerd in een samengestelde fenotype score voor een grotere statistische power. De ideale combinatie van de vier beschreven maatregelen zal afhangen van de aandoening in kwestie. We presenteren een voorbeeld van het protocol gebruikt om de ernst van de ziekte te beoordelen in een transgene muis-model van spinocerebellaire ataxie type 7 (SCA7).

Albert R. La Spada en Gwenn A. Tuin bijgedragen aan dit manuscript ook.

Protocol

Om te voorkomen dat vooroordelen, moet de onderzoeker het uitvoeren van de beoordelingen niet kennis hebben van het genotype van het dier. Individuele maatregelen zijn gescoord op een schaal van 0-3, waarbij 0 een afwezigheid van de desbetreffende fenotype en 3 die de meest ernstige manifestatie. Elke test wordt uitgevoerd meerdere keren om ervoor te zorgen dat de score reproduceerbaar is. Obesitas zal bemoeilijken de interpretatie van alle beschreven maatregelen. De onderzoeker wenst te muizen af ​​te wegen na fenotype scoren om de mogelijke rol van adipositas te beoordelen in de resultaten.

Ledge-test

De rand test is een directe meting van coördinatie, die wordt verstoord in de kleine hersenen ataxieën en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Deze maatregel is het meest direct vergelijkbaar met de menselijke tekenen van een cerebellaire ataxie.

1. Til de muis uit de kooi en plaats het op rand van de kooi is. Muizen zal meestal langs de richel en proberen om terug te dalen in de kooi.
2. Let op de muis als het wandelingen langs de kooi richel en verlaagt zich in zijn kooi. Een wild-type muizen zal typisch wandeling langs de rand, zonder verlies van de balans, en zal een lagere zichzelf terug in de kooi sierlijk, met behulp van zijn poten. Dit is een score van 0. Als de muis verliest zijn voet tijdens een wandeling langs de rand, maar verder lijkt gecoördineerd, ontvangt een score van 1. Als dit niet effectief zijn achterpoten, of akkers te gebruiken op zijn hoofd in plaats van de poten bij het afdalen in de kooi, ontvangt een score van 2. Als het valt van de richel, of bijna, tijdens het lopen of een poging om zichzelf te verlagen, of shakes en weigert om überhaupt te verplaatsen, ondanks aanmoediging, ontvangt een score van 3. Sommige muizen zal een zacht duwtje hen aan te moedigen langs de richel of daal af in de kooi.
3. Noteer de richel-test score.

Achterbeen clasping

Achterbeen clasping is een marker van de progressie van de ziekte in een aantal muismodellen van neurodegeneratie, met inbegrip van bepaalde cerebellaire ataxieën [1].

1. Pak de staart aan de onderkant en til de muis vrij is van alle omliggende objecten.
2. Let op de achterbeen positie 10 seconden. Als de achterpoten consequent gespreid naar buiten, weg van de buik, krijgt het een score van 0. Als een achterbeen wordt teruggetrokken in de richting van de buik voor meer dan 50% van de tijd opgeschort, ontvangt een score van 1. Als beide achterpoten zijn gedeeltelijk teruggetrokken in de richting van de buik voor meer dan 50% van de tijd opgeschort, krijgt een score van 2. Als zijn achterpoten zijn volledig teruggetrokken en het aanraken van de buik voor meer dan 50% van de tijd opgeschort, ontvangt een score van 3.
3. Plaats de muis in zijn kooi en neem het achterbeen clasping score.

Gang

Gait is een zekere mate van coördinatie en spierfunctie.

1. Haal de muis uit zijn kooi en plaats het op een vlakke ondergrond met het hoofd afgekeerd van de onderzoeker.
2. Let op de muis van achter als het loopt. Als de muis beweegt normaal, met zijn lichaamsgewicht ondersteund op alle ledematen, met zijn buik niet de grond raken, en met beide achterpoten deelnemende gelijkmatig, ontvangt een score van 0. Als het toont een tremor of lijkt te slap tijdens het lopen, ontvangt een score van 1. Als het wordt een zware beving, ernstige slap, bekken verlaagd, of de voeten punt uit de buurt van het lichaam gedurende beweging ("eend feet"), ontvangt een score van 2. Als de muis heeft moeite met bewegen naar voren en sleurt haar buik over de grond, ontvangt een score van 3.
3. Plaats de muis in zijn kooi en op te nemen zijn gang score.

Kyfose

Kyfose is een kenmerk dorsale kromming van de wervelkolom, dat is een gezamenlijke manifestatie van neurodegeneratieve ziekte in muismodellen [2]. Het wordt veroorzaakt door een verlies van spierspanning in de wervelkolom spieren secundair aan neurodegeneratie.

1. Haal de muis uit zijn kooi en plaats het op een vlakke ondergrond.
2. Observeer het zoals het loopt. Als de muis is in staat om gemakkelijk recht zijn rug als het loopt, en heeft geen blijvende kyfose, ontvangt een score van 0. Als de muis vertoont milde kyfose, maar is in staat om zijn rug recht te maken, ontvangt een score van 1. Als het niet in staat is om zijn rug volledig recht en onderhoudt, maar aanhoudende milde kyfose, ontvangt een score van 2. Als de muis handhaaft uitgesproken kyfose als het loopt of terwijl hij zit, het is een score van 3.
3. Plaats de muis in zijn kooi en neem het kyfose score.

Representatieve resultaten

Met een voldoende aantal dieren, deze procedure is voor het opsporen van fenotype verschillen tussen stammen en binnen dezelfde stam in de tijd. Voor de data-analyse, berekent de score voor elke maatregel door het nemen van degemiddelde van de drie metingen in elk individu. Maatregelen kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd of gecombineerd in een samengestelde fenotype score voor elk individu.

Grafiek van de gegevens en de toepassing van de passende statistische methoden om significantie te bepalen. Figuur 1 toont de resultaten van een composiet-fenotype beoordeling van een transgeen muis SCA7 model. In deze floxed-SCA7-92Q transgeen model, is het menselijke ataxin-7 gen met 92 CAG herhalingen geflankeerd door loxP sites en uitdrukking van een bacteriële kunstmatig chromosoom. De samengestelde score fenotype omvat de clasping, richel lopen, lopen en kyphose-evaluaties voor een maximale score van 12. De progressieve SCA7 fenotype in de floxed-SCA7-92Q transgene muizen is aangetoond door een toenemende samengestelde fenotype score, die consistent is met het progressieve karakter van de menselijke ziekte.

. Figuur 1 Floxed-SCA7-92Q muizen vertonen een progressieve SCA7 fenotype, dat sterk afwijkt van niet-transgene nestgenoten begint bij 20 weken (2-way ANOVA: Bonferroni post-hoc; *** P <0.001). Muizen werden beoordeeld op een schaal van 0-3 elk voor richel test, clasping, gang, en kyfose. Gemiddelde samengestelde score voor elk genotype op elke leeftijd werd berekend. Balken geven SEM.

Discussion

Dit protocol is ontworpen om een ​​gevoelig en eenvoudig uit te voeren evaluatie van de ernst van de ziekte in muismodellen van cerebellaire ataxie te zijn. Individuele componenten van de scoring systeem zal meer of minder effectief zijn in verschillende muismodellen van neurodegeneratie.

Elementen van dit puntensysteem daadwerkelijk zijn gebruikt om een ​​verscheidenheid van muis modellen van menselijke neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van cerebellaire ataxieën, Huntington en ziekte en spinobulbar musculaire atrofie [1-3] te beoordelen. De ideale combinatie van tests zal afhangen van de aandoening in kwestie. Dit protocol werd oorspronkelijk ontworpen door de auteurs om transgene muis modellen van spinocerebellaire ataxie type 7 (SCA7) te evalueren.

In het model van SAC7 gebruikt om de hier gepresenteerde gegevens genereren, werden de dieren opgeofferd op de leeftijd van 40 tot 43 weken of eerder als de gedragsafwijkingen ontwikkeld tot een stadium dat een dier is niet langer voldoende mobiel om zelfstandig te onderhouden voeding of hydratatie.