Summary
Abbiamo descritto un protocollo per la quantificazione rapida e sensibile della gravità della malattia in modelli murini di atassia cerebellare. Le misure includono dell'arto posteriore stringendo, sporgenza di prova, andatura e cifosi. Questo protocollo discrimina in modo efficace tra individui affetti e non affetti, e rileva la progressione delle persone colpite nel corso del tempo.
Abstract
Abbiamo descritto un protocollo per la quantificazione rapida e sensibile della gravità della malattia in modelli murini di cervello dei atassia. È derivato da valutazioni fenotipo precedentemente pubblicato in modelli di malattie, tra cui atassie spinocerebellari, malattia di Huntington s spinobulbar e atrofia muscolare. Le misure includono dell'arto posteriore stringendo, sporgenza di prova, andatura e cifosi. Ogni misura viene registrato su una scala da 0-3, con un totale combinato di 0-12 per tutte le quattro misure. I risultati effettivamente discriminare tra individui affetti e non affetti, ma anche di quantificare la progressione temporale dei fenotipi malattia neurodegenerativa. Le misure possono essere analizzati singolarmente o combinati in un fenotipo punteggio composito per una maggiore potenza statistica. La combinazione ideale delle quattro misure descritte dipende dalla patologia in questione. Vi presentiamo un esempio di protocollo utilizzato per valutare la gravità della malattia in un modello murino transgenico di atassia spinocerebellare di tipo 7 (SCA7).
Albert R. La Spada e Gwenn A. Giardino contribuito a questo manoscritto allo stesso modo.
Protocol
Per evitare bias, lo sperimentatore di eseguire le valutazioni non dovrebbe essere a conoscenza del genotipo dell'animale. Le singole misure sono segnati su una scala 0-3, dove 0 rappresenta l'assenza del fenotipo rilevanti e 3 rappresentano la manifestazione più grave. Ogni test viene eseguito più volte ad assicurare che il punteggio è riproducibile. L'obesità si complicare l'interpretazione di tutte le misure descritte. L'investigatore può voler pesare topi seguente punteggio fenotipo per valutare il possibile ruolo di adiposità nei risultati.
Ledge prova
Il test sporgenza è una misura diretta di coordinamento, che è ridotto in atassie cerebellari e molte altre malattie neurodegenerative. Questa misura è la più direttamente comparabili ai segni umani di atassia cerebellare.
- Sollevare il mouse dalla gabbia e posizionarlo sul bordo della gabbia. I topi in genere passeggiata lungo la sporgenza e cercare di scendere di nuovo nella gabbia.
- Osservare il mouse mentre cammina lungo la sporgenza gabbia e si abbassa nella sua gabbia. Un topo wild-type in genere camminare lungo la cengia, senza perdere il suo equilibrio, e si parte inferiore della schiena nella gabbia con grazia, con le zampe. Questo viene assegnato un punteggio pari a 0. Se il mouse perde il suo piede mentre si cammina lungo la sporgenza, ma per il resto sembra coordinato, riceve un punteggio di 1. Se non utilizzare efficacemente le sue zampe posteriori, o atterra sulla sua testa piuttosto che le sue zampe quando si scende nella gabbia, riceve un punteggio di 2. Se cade giù dal bordo, o quasi, mentre si cammina o il tentativo di abbassare se stesso, o scuote e si rifiuta di muoversi affatto, nonostante l'incoraggiamento, riceve un punteggio di 3. Alcuni topi richiederà un colpetto leggero per incoraggiarli a camminare lungo la sporgenza o scendere nella gabbia.
- Registrare il punteggio del test sporgenza.
Arti posteriori stringendo
Arti posteriori stringendo è un marker della progressione della malattia in un certo numero di modelli murini di neurodegenerazione, tra cui alcune atassie cerebellari [1].
- Afferrare la coda vicino alla sua base e sollevare il mouse chiara di tutti gli oggetti circostanti.
- Rispettare la posizione degli arti posteriori per 10 secondi. Se le zampe posteriori sono costantemente aperte verso l'esterno, lontano dal ventre, è assegnato un punteggio pari a 0. Se uno degli arti posteriori è ritirato verso l'addome per oltre il 50% del tempo sospeso, riceve un punteggio di 1. Se entrambe le zampe posteriori sono parzialmente ritrattato verso l'addome per oltre il 50% del tempo sospeso, riceve un punteggio di 2. Se i suoi arti posteriori sono completamente retratti e toccare l'addome per oltre il 50% del tempo sospeso, riceve un punteggio di 3.
- Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia e registrare il punteggio degli arti posteriori stringendo.
Andatura
Andatura è una misura di coordinamento e funzione muscolare.
- Rimuovere il mouse dalla gabbia e collocarla su una superficie piana con la testa rivolta verso l'investigatore.
- Osservare il mouse da dietro mentre cammina. Se il mouse si muove normalmente, con il suo peso corporeo supportato su tutte le arti, con il suo addome non toccare il suolo, e con entrambe le zampe posteriori partecipanti in modo uniforme, riceve un punteggio pari a 0. Se mostra un tremore o sembra zoppicare mentre si cammina, riceve un punteggio di 1. Se mostra un tremore grave, zoppicare grave, abbassato bacino, i piedi o punto lontano dal corpo durante la locomozione ("piedi d'anatra"), riceve un punteggio di 2. Se il mouse ha difficoltà di movimento in avanti e trascina il suo addome lungo la terra, riceve un punteggio di 3.
- Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia e il suo punteggio record di andatura.
Cifosi
La cifosi è una caratteristica curvatura dorsale della colonna vertebrale, che è una manifestazione comune di malattie neurodegenerative in modelli di topo [2]. E 'causata da una perdita di tono muscolare nei muscoli della colonna vertebrale secondaria alla neurodegenerazione.
- Rimuovere il mouse dalla gabbia e collocarla su una superficie piana.
- Osservarlo mentre cammina. Se il mouse è in grado di raddrizzare con facilità la sua spina dorsale mentre cammina, e non ha cifosi persistente, riceve un punteggio pari a 0. Se il mouse mostra cifosi mite, ma è in grado di raddrizzare la sua spina dorsale, riceve un punteggio di 1. Se è in grado di raddrizzare la sua spina dorsale completamente e mantiene cifosi persistente ma delicato, che riceve un punteggio di 2. Se il mouse mantiene cifosi pronunciata mentre cammina o mentre si siede, gli viene assegnato un punteggio pari a 3.
- Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia e il suo punteggio record di cifosi.
Rappresentante risultati
Con un numero sufficiente di animali, questa procedura è in grado di rilevare le differenze tra i ceppi di fenotipo e all'interno della stesso ceppo nel corso del tempo. Per l'analisi dei dati, calcolare il punteggio per ciascuna misura, prendendo ilmedia delle tre misurazioni in ogni individuo. Le misure possono essere analizzati separatamente o combinati in un fenotipo punteggio composito per ogni individuo.
Grafico i dati e applicare i metodi statistici appropriati per determinare significato. La Figura 1 mostra i risultati di una valutazione composita fenotipo di un modello murino transgenico SCA7. In questo floxed-SCA7-92Q modello transgenico, l'uomo atassina gene-7 con 92 ripetizioni CAG è fiancheggiato da siti loxP ed espresso da un cromosoma batterico artificiale. Il punteggio fenotipo composito comprende la stringe, camminando sporgenza, andatura e valutazioni cifosi per un punteggio massimo di 12. La progressiva SCA7 fenotipo nei topi transgenici floxed-SCA7-92Q è dimostrato da un punteggio crescente fenotipo composito, che è coerente con la natura progressiva della malattia umana.
. Figura 1 floxed-SCA7-92Q topi mostrano un progressivo SCA7 fenotipo che è significativamente diverso dal non-transgenici fratellini con inizio alle 20 settimane (2-way ANOVA: Bonferroni post-hoc; *** p <0,001). I topi sono stati valutati su una scala 0-3 per ogni prova sporgenza, stringendo, andatura e cifosi. Valutazione media composito per ciascun genotipo ad ogni età è stata calcolata. Barre rappresentano SEM.
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Discussion
Questo protocollo è progettato per essere una valutazione sensibile e facilmente eseguibile della gravità della malattia in modelli murini di atassia cerebellare. Singoli componenti del sistema di punteggio sarà più o meno efficace in modelli murini di neurodegenerazione diversi.
Elementi di questo sistema di punteggio siano stati effettivamente utilizzati per valutare una varietà di modelli murini di malattie umane neurodegenerative, tra cui atassie cerebellari, malattia di Huntington s e spinobulbar atrofia muscolare [1-3]. La combinazione ideale di test dipende dalla malattia in questione. Questo protocollo è stato progettato dagli autori per valutare i modelli di topi transgenici di atassia spinocerebellare di tipo 7 (SCA7).
Nel modello di SAC7 impiegati per generare i dati qui presentati, gli animali sono stati sacrificati all'età di 40-43 settimane o anche prima, se le anomalie comportamentali ad uno stadio che un animale non è più sufficientemente mobili per mantenere autonomamente la nutrizione o idratazione.
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Disclosures
Questi studi sono stati approvati dalla University of Animal Care Washington e del Comitato Istituzionale Usa.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH NS052535 a GAG e EY014061 & EY014997 a ARL, così come un premio UL1DE019583-02 consorzio.
References
- Chou, A. H. Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation. Neurobiol Dis. 31 (1), 89-101 (2008).
- Thomas, P. S. Jr Loss of endogenous androgen receptor protein accelerates motor neuron degeneration and accentuates androgen insensitivity in a mouse model of X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet. 15 (14), 2225-2238 (2006).
- Ditzler, S., Stoeck, J., LeBlanc, M., Kooperberg, C., Hansen, S., Coppin, L., Olson, J. M. A Rapid Neurobehavioral Assessment Reveals that FK506 Delays Symptom Onset in R6/2 Huntington's Disease Mice. Preclinica Research Articles. 1 (3), 115-126 (2003).
