En enkel komposit Fenotyp Scoring System för utvärdering musmodeller av cerebellär ataxi

Summary

Vi beskriver ett protokoll för snabbare och känsligare kvantifiering av sjukdomens svårighetsgrad i musmodeller av cerebellär ataxi. Åtgärderna omfattar bakbenen knäppa, avsats test, gång och kyfos. Detta protokoll diskriminerar effektivt mellan drabbade och icke drabbade, och upptäcker utvecklingen av drabbade individer över tid.

Abstract

Vi beskriver ett protokoll för snabbare och känsligare kvantifiering av sjukdomens svårighetsgrad i musmodeller av cerebella ataxi. Den härrör från de tidigare publicerade fenotyp bedömningar i flera sjukdomar modeller, inklusive Spinocerebellar ataxias, Huntingtons sjukdom och spinobulbar muskelatrofi. Åtgärderna omfattar bakbenen knäppa, avsats test, gång och kyfos. Varje åtgärd registreras på en skala från 0-3, med sammanlagt 0-12 för alla fyra åtgärder. Resultaten diskriminerar effektivt mellan drabbade och icke drabbade, samtidigt kvantifiera tidsmässiga utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar fenotyper. Åtgärder kan analyseras var för sig eller kombineras till en sammansatt fenotyp poäng för ökad statistisk styrka. Den ideala kombinationen av de beskrivna fyra åtgärder kommer att bero på sjukdomen i fråga. Vi presenterar ett exempel på det protokoll som används för att bedöma sjukdomens svårighetsgrad i en transgen musmodell av Spinocerebellar ataxi typ 7 (SCA7).

Albert R. La Spada och Gwenn A. Garden bidragit till detta manuskript lika.

Protocol

För att förhindra fördomar, bör försöksledaren utför bedömningar inte har kunskap om djurets genotyp. Enskilda åtgärder poängsätts på en skala från 0-3, där 0 representerar en avsaknad av relevanta fenotyp och 3 representerar de allvarligaste manifestationen. Varje test utförs flera gånger för att säkerställa att resultatet är reproducerbart. Övervikt försvårar tolkningen av alla beskrivna åtgärder. Utredaren kan behöva väga möss efter fenotyp poäng för att bedöma möjliga roll fetma i resultaten.

Ledge testa

Kanten test är ett direkt mått av samordning, som är nedsatt i lillhjärnan ataxias och många andra neurodegenerativa sjukdomar. Denna åtgärd är den mest direkt jämförbar med människans tecken på cerebellär ataxi.

1. Lyft musen ur buren och placera den på Cages kanten. Möss kommer vanligtvis gå längs kanten och försök att stiga tillbaka in i buren.
2. Observera musen som det promenader längs buren kunskap och sänker sig själv i sin bur. En vildtyp mus normalt promenad längs kanten utan att förlora sin balans, och kommer att sänka sig tillbaka in i buren graciöst, med hjälp av tassarna. Detta är tilldelad en 0 poäng. Om musen förlorar sin fot när hon gick längs kanten, men annars verkar samordnade, får den en poäng på 1. Om det inte effektivt använda sina bakben, eller landar på huvudet snarare än dess tassar vid nedgång in i buren, får den en poäng på 2. Om det faller av kanten, eller nästan så, när hon gick eller försöker sänka sig, eller skakar och vägrar att röra sig alls, trots uppmuntran, får det en poäng på 3. Vissa möss kommer att kräva en mild knuff för att uppmuntra dem att gå längs kanten eller ner i buren.
3. Anteckna poäng avsatsen testet.

Bakdelen fast grepp om varandras

Bakdelen knäppa är en markör för sjukdomsprogression i ett antal musmodeller för neurodegeneration, inklusive vissa cerebellär ataxias [1].

1. Ta tag i svansen nära basen och lyfta musen klara av alla omgivande föremål.
2. Observera bakdelen positionen i 10 sekunder. Om de bakre extremiteterna är genomgående utspärrade utåt, bort från buken, är det tilldelas en 0 poäng. Om man bakdelen dras tillbaka mot buken för mer än 50% av de suspenderade tid, får den en poäng på 1. Om båda bakben är delvis indragna mot buken för mer än 50% av tiden tills vidare får den en poäng på 2. Om dess bakben är helt indragen och att röra buken för mer än 50% av de suspenderade tid, får den en poäng på 3.
3. Placera musen tillbaka till sin bur och anteckna bakdelen knäppa poäng.

Gång

Rörelser är ett mått på samordning och muskelfunktion.

1. Ta bort musen från sin bur och placera den på en plan yta med huvudet vänd bort från utredaren.
2. Observera musen bakifrån som det går. Om musen rör sig normalt, med sin kroppsvikt stöds på alla lemmar, med sin mage inte vidrör marken, och med båda bakben deltar jämnt, den får en 0 poäng. Om det visar en darrning eller tycks halta när hon gick, får den en poäng på 1. Om det visar en allvarlig tremor, svår halta, sänkt bäckenet eller fötterna pekar bort från kroppen under rörelseorganen ("anka fötter"), får den en poäng på 2. Om musen har svårt att gå framåt och drar sin buken längs marken, får den en poäng på 3.
3. Placera musen tillbaka till sin bur och spela in sin gång värdering.

Kyfos

Kyfos är ett kännetecken rygg krökning av ryggraden som är en vanlig manifestation av neurodegenerativa sjukdomar i musmodeller [2]. Den orsakas av en förlust av muskeltonus i spinal musklerna sekundärt till neurodegeneration.

1. Ta bort musen från sin bur och placera den på en plan yta.
2. Observera det som det går. Om musen kan lätt räta ut sin rygg som det går, och inte har ihållande kyfos, får den en 0 poäng. Om musen uppvisar milda kyfos, men kan räta ut sin rygg, får den en poäng på 1. Om det inte går att räta ut sin ryggrad helt och upprätthåller ihållande men mild kyfos, får den en poäng på 2. Om musen upprätthåller uttalad kyfos som promenader eller när den sitter, är det tilldelas en poäng på 3.
3. Placera musen tillbaka till sin bur och spela in sin kyfos poäng.

Representativa resultat

Med ett tillräckligt antal djur, är detta förfarande kan upptäcka fenotyp skillnader mellan stammar och inom samma stam över tiden. För analys av data, beräkna poängen för varje åtgärd genom att tamedelvärdet av de tre mätningarna i varje individ. Åtgärder kan analyseras var för sig eller kombineras till en sammansatt fenotyp poäng för varje individ.

Diagram data och tillämpa lämpliga statistiska metoder för att fastställa betydelse. Figur 1 visar resultat från en sammansatt fenotyp bedömning av en mus transgen SCA7 modell. I denna floxed-SCA7-92Q transgena modell, är det mänskliga ataxin-7 gen med 92 CAG upprepar flankerad av loxP platser och uttrycks i en bakteriell artificiell kromosom. Den sammansatta fenotyp poäng inkluderar knäppa, avsatsen promenader, gång och bedömningar kyfos till en högst poäng av 12. Den progressiva SCA7 fenotyp i floxed-SCA7-92Q transgena möss framgår av ett ökande komposit fenotyp poäng, vilket är förenligt med den progressiva naturen av den mänskliga sjukdomen.

. Figur 1 Floxed-SCA7-92Q möss uppvisar en progressiv SCA7 fenotyp som skiljer sig väsentligt från icke-Transgena kullsyskon början på 20 veckor (2-vägs ANOVA: Bonferroni post-hoc, *** P <0,001). Möss bedömdes på en skala 0-3 för vardera kanten test, knäppa, gång och kyfos. Genomsnittlig sammansatt poäng för varje genotyp vid varje ålder har beräknats. Stapel avser SEM.

Discussion

Detta protokoll är avsedd att vara en känslig och lätt kan utföra utvärdering av sjukdomens svårighetsgrad i musmodeller av cerebellär ataxi. Enskilda komponenter av poängsystem kommer att vara mer eller mindre effektiva i olika musmodeller för neurodegeneration.

Delar av detta poängsystem faktiskt har använts för att bedöma en rad olika musmodeller för mänskliga neurodegenerativa sjukdomar, inklusive lillhjärnan ataxias, Huntingtons sjukdom och spinobulbar muskelatrofi [1-3]. Den ideala kombinationen av tester beror på sjukdomen i fråga. Detta protokoll utformades ursprungligen av författarna för att utvärdera transgena musmodeller av Spinocerebellar ataxi typ 7 (SCA7).

I modellen för SAC7 används för att generera data som presenteras här har djur som offras i en ålder av 40-43 veckor eller tidigare om den har anatomiska defekter kommit till ett stadium att ett djur inte längre är tillräckligt rörliga för att självständigt kunna behålla näring eller fukt.