Summary
نحن هنا وصف طريقة مفصلة لزراعة القصبات الإنسان الأولية من الخلايا الظهارية explants الأنسجة البشرية القصبات الهوائية بما في ذلك النمو المتباينة على واجهة الهواء السائل. هذا الأسلوب يوفر مصدر وفيرة من الخلايا الأولية للتحقيق في دور ظهارة مجرى الهواء في الرئة صحة الإنسان والمرض.
Abstract
وهناك حاجة الإنسان الخلايا الظهارية القصبية لنماذج خلية من المرض ودراسة تأثير السواغات وكلاء الصيدلانية على وظيفة وهيكل الخلايا الظهارية البشرية. نحن هنا تصف بالتفصيل طريقة تنامي الخلايا الظهارية القصبات الهوائية من نسيج الشعب الهوائية التي يتم حصادها من قبل الجراح في أوقات جراحة الرئة (مثل سرطان الرئة أو جراحة خفض حجم الرئة). مع الموافقة على الأخلاق والموافقة المستنيرة ، الجراح يأخذ ما هو بحاجة لعلم الأمراض ، ويوفر لنا مع جزء الشعب الهوائية التي هي بعيدة من المناطق المصابة. ثم يتم استخدام النسيج كمصدر للexplants التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا الظهارية القصبية الأساسي في الثقافة. يتم شطف شرائح الشعب الهوائية نحو 0.5 - 1cm طويلة و≤ 1cm في قطر مع EBSS الباردة وتتم إزالة الأنسجة الزائدة متني. تقطع شرائح فتح والمفروم إلى 3mm - 2
Protocol
شرائح الشعبي الإنسان توفير مصدر وفيرة من الخلايا الأولية الظهارية القصبية. في هذه المقالة وصفنا بروتوكولا للنمو والتوسع في الشعب الهوائية الخلايا البشرية (HBE) الظهارية من شرائح الشعب الهوائية المعزولة حديثا الإنسان. هذا البروتوكول يتكون من خمسة أقسام :
- طلاء لوحات الخدش والثقافة 100mm
- إعداد Explants الأنسجة القصبي
- زرع أنسجة الشعب الهوائية
- مرور خلايا HBE
- تنامي خلايا مهدبة HBE على Transwells
قبل أن تبدأ لاحظ أن تتم جميع الخطوات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) ما لم ينص على خلاف ذلك. الرجاء تأكد من وجود جميع المواد اللازمة لهذا الإجراء. يرجى قراءة المواد ، وقسم تحضير الكواشف وتأكد أن لديك جو معقم و مطهر (أي في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو BSC) التي أعدت ما يلي :
طلاء حل المخزون : فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل) ، BSA (10 ميكروغرام / مل) ، والكولاجين (30 ميكروغرام / مل) في محلول الملح المتوازن ليالي ايرل (EBSS ، معقمة).
متوسطة الثقافة : DMEM / هام F - 12 مع الإضافات و مضاد فطري للمضادات الحيوية (1 ٪) وFBS (1 ٪)
تفارق الحلول : التربسين / EDTA الأسهم الحل وDMEM/F-12 مع FBS (10 ٪)
1. طلاء لوحات والخدش 100mm الثقافة : سيتم مطلي Explants الثقافة في لوحات 100mm. بدء بواسطة طلاء لوحات ثقافة 100mm مع الحل الطلاء. وينبغي أن يتم ذلك في BSC ، والحفاظ على كل شيء العقيمة.
- مكان معقم لوحات والثقافة 100mm حل طلاء (الكولاجين / فبرونيكتين / BSA) في ش.
- ماصة 2.0 مل من طلاء الحل في لوحة 100mm.
- دوامة في جميع أنحاء لمعطف قاعدة اللوحة. تأكد من أن الحل الطلاء يغطي قاعدة لوحة بالتساوي.
- ماصة الحل متبقية من أصل واستخدامه لمعطف لوحة second 100mm. تكرار لكثير من لوحات حسب الحاجة. عدد من لوحات حاجة يختلف مع عدد من explants الأنسجة.
- تأكد من أن الحل الطلاء يغطي أسس لوحات بالتساوي كما هو موضح.
- تغطي لوحات مع أغلفتها. السماح لوحات لتجف في الحاضنة لمدة 1-2 ساعات ، ونضح حل قبل الاستخدام الزائد للأنسجة explants الشعب الهوائية. يمكن وضعها غير المستخدمة لوحات ثقافة مغلفة في كيس معقم ، مختومة وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا (ويمكن تخزين تصل الى شهر في الثلاجة). تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- رذاذ تنظيف مقص حاد صغير ، مشرط ، وملقط مع الايثانول 70 ٪ ويدخل في ش. الصفر لوحات مغلفة بضغط بحزم مع مشرط صغير لتشكيل العميق العاشر ق (على الأقل 4). إذا كانت نقطة الصفر ليست عميقة بما فيه الكفاية ، وقطع النسيج لا تستقر في التلال وسوف تطفو.
2. إعداد Explants الأنسجة القصبي
استخدام نسيج الشعب الهوائية التي تم الحصول عليها في غضون 24-36 ساعة بعد الجراحة. إبقاء الأنسجة على الجليد في EBSS حتى جاهزة للاستخدام.
- خارج ش : نسيج مكان في طبق بتري. شطف عينات الأنسجة البشرية معزولة تماما في الشعب الهوائية EBSS.
- تشريح الأنسجة المحيطة بها فائض.
- قطع قطعة فتح الشعب الهوائية.
- إحضار الأنسجة في BSC ونقل الى 100mm الأنسجة المعقمة لوحة الثقافة مع DMEM/HamF12 الباردة + 1 ٪ للمضادات الحيوية / مضاد فطري.
- استخدام مقص حاد صغير لقطع الانسجة الى قطع 2-3 3 مم.
- مكان واحد قطعة من قطع النسيج في مركز كل X مع ملقط واضغط بلطف.
- ترك قطعة نسيج (explants) الالتزام لوحة لبضع ثوان ، ثم إضافة بلطف 10ML كاملة من وسائل الإعلام (DMEM/HamF12 + المضافات +1 ٪ المضادات الحيوية / مضاد فطري FBS + 1 ٪). إذا كان النسيج يطفو بعد إضافة وسائل الإعلام ، واستخدام ملقط لدفع الأنسجة في التلال من X أو تقديم عاشرا جديدة قد يكون من الضروري لجعل جديد X ق إذا التلال ليست عميقة بما فيه الكفاية.
- لوحات مكان في الحاضنة وسائل الإعلام تغيير كل 3-4 أيام.
- النسج على استعداد لزرع الخلايا الظهارية كافية عندما نمت حول explants الأنسجة لتغطية 1 - 2cm المجالات. هذا يستغرق حوالي 4 أسابيع.
3. زرع أنسجة الشعب الهوائية
- استخدام لوحات 100mm المغلفة وخدش. منذ بعض explants الأنسجة قد لا تكون ناجحة ، وعدد من لوحات تعتمد على كم قطعة من النسيج كنت زرع. إذا كنت تستخدم لوحات التي سبق لها أن المغلفة وتخزينها في 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- باستخدام الملقط ، واختيار بعناية من نسيج لوحة والمكان الأصلي في وسط X s في لوحة جديدة ، واضغط بلطف. يجب التخلص من أنسجة من دون ثمرة.
- اسمحوا الأنسجة التمسك وحة لبضع ثوان ، إضافة وسائل الإعلام واحتضان الأذن كما هو موضحالكذاب لexplants (2،7-2،9).
4. مرور الإنسان القصبي الخلايا (HBE) الظهارية
- أذاب 2ml من محلول المخزون التربسين / EDTA لكل صفيحة الأنسجة الثقافة 100mm. تمييع الأسهم مع 6ml من برنامج تلفزيوني العقيمة 0.01M (أي إضافة 2 مل من محلول المخزون PBS مل 6 (تركيز النهائي من التربسين هو 250 ميكروغرام / مل وEDTA هو 100 ميكروغرام / مل).
- بعد انتقاله إلى لوحة explants جديدة ، نضح من وسائل الاعلام مع لوحات 1 - 2cm حلقات من الخلايا.
- إضافة 8ml من حرارة حل التربسين / EDTA المخفف إلى كل لوحة 100mm ووضعه في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 3-15 دقائق. الاختيار في كثير من الأحيان ، وترك التربسين لفترة طويلة جدا وسوف تدمر خلايا.
- الاختيار لوحات تحت المجهر للتأكد من تم رفع معظم الخلايا. وسوف تصل الخلايا المستديرة وفصل كما هو مبين.
- إضافة 8ml FBS 10 ٪ من حرارة في وسائل الإعلام في لوحة لتعطيل الحل التربسين / EDTA.
- الجمع بين وحدات التخزين لجميع لوحات في أنبوب واحد (أو أنابيب منفصلة إذا أنسجة مختلفة). عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- الطرد المركزي في 100G لمدة 5 دقائق. وسوف بيليه شكل خلية في القاعدة من الأنبوب.
- اعادة تعليق خلية بيليه في وسائل الإعلام كاملة (DMEM / هام + F12 جميع الإضافات + 1 ٪ للمضادات الحيوية مضاد فطري + 1 ٪ FBS) إلى تركيز الخلية المطلوبة.
- وضع كل الخلايا في 2-3000000 T75 القارورة وإضافة وسائل الإعلام كاملة كما هو مطلوب. احتضان وتغير وسائل الاعلام كل 3-4 أسابيع. تنمو الخلايا لالتقاء الفرعي (80-90 ٪) في قوارير T75 في حوالي 4 أسابيع. وينبغي رفع الخلايا واستخدامها في توسيع أو التقاء الفرعية لمنع الشيخوخة.
5. تزايد الإنسان الشعبي مهدبة طلائي (HBE) الخلايا على Transwells.
الخلايا الظهارية الابتدائية ارتفع من الأنسجة explants / زرع ، ويمكن توسيعها حتى ثلاث مرات ، ثم استخدامها. ينصح كثافة البذر من 50،000 إلى 100،000 الخلايا لكل سم 2 ، 1،2. أعلى كثافة يعزز التمايز أسرع.
ملاحظة : إعداد تعليق الخلايا وقياس أعدادهم. في مستنبت إعادة تعليق ، بمبلغ 1 مليون خلية لكل 2ml.
- تبدأ إعداد نفاذية الأغشية من قبل transwells التي يحتضنها يدرج مع خلية ثقافة المتوسط (DMEM / هام F12) قبل استخدامها. هذه الخطوة كانت ضرورية مع هذه الخلايا الحساسة وسيساعد مرفق الخلية.
- استخدام إدراج 6.5 ملم التي تناسب في 24 لوحات جيدة جيدا متعددة.
- إضافة المتوسطة لكلا الجانبين من الغشاء (مقابل 6.5 ملم يدرج استخدام 0.6ml على القاع ، وعلى رأس 0.1ml). 1 ساعة احتضان الثقافة في الخلية الحاضنة.
- إزالة بعناية (نضح) ومتوسطة من الجانبين للغشاء بدءا من حجم القاعدية الأولى.
يعني بعناية : يمكن أن يكون غشاء تلف بسهولة ، وبالتالي فإن المتوسط ماصة أسفل الجانب من إدراج الثقافة ، واستخدام وحدة التخزين الموصى بها. ولن تفعل ذلك نتيجة تسرب في وسائل الإعلام لأكثر من الآبار الأخرى.
- خلايا البذور بعد الحضانة التمهيدية للدعم نافذ
- ماصة بعناية تعليق صومعتك في الجانب قمي في الغشاء : 6.5mm للآبار إضافة 0.1 مل من التعليق الخلية (أي 50000 الخلايا) إلى الجانب قمية من الغشاء.
- ماصة 0.6ml المتوسطة على الجانب القاعدي من الغشاء.
- تغذية الخلايا من الجانبين قمية والقاعدية لمدة 10 يوما لتأسيس ثقافة مختلفة تماما : متوسط الصرف مرتين في الأسبوع باستخدام الأسلوب أثبت :
- إزالة حجم القاعدية first
- استبدال حجم القمي (0.1ml متوسطة)
- إضافة 0.6 مل من المتوسط إلى الجانب القاعدي من الغشاء.
هذا الأسلوب يشجع مرفق غشاء الخلية ، ويمنع الخلايا من التعرض للهواء لفترات طويلة من الزمن (تبادل وسائل الإعلام بسرعة واعادة وضع في حاضنة). - إنشاء واجهة الهواء السائل (علي) في يوم 10 عن طريق إزالة المتوسطة قمي ، لتحل محل ثم 0.6 مل من المتوسط على الجانب القاعدي من الغشاء.
- المحافظة على الخلايا في ALI لمدة 6 أسابيع ، وتغير وسائل الإعلام مرتين في الأسبوع. وسوف تبدأ في الظهور خلايا مهدبة 4 أسابيع بعد خلق علي. وتمايز الخلايا تحقيق موحدة في خلايا مهدبة 6 أسابيع بعد خلق علي.
مواد التحضير :
1. إعداد محلول المخزون طلاء (القيام بذلك في BSC) :
القصبي الإنسان الأساسية الخلايا الظهارية تنمو جيدا على الأسطح المطلية مع فبرونيكتين / جيش صرب البوسنة / 3 الكولاجين. يستخدم محلول المخزون طلاء لوحات 100 ملم زراعة الأنسجة لازدراع والثقافات زرع على النحو المبين أعلاه. أيضا يمكن أن تستخدم لطلاء الحل coverslips معطف لتسريع مرفق الخلية ، ويمكن عندئذ أن تستخدم لcoverslips immunostaining التجارب.
- فبرونيكتين (1mg/ml حل الأسهم) : استخدام F2006 - 2mg من سيغما. 2mg في حل من الحلول العقيمة 2mls ايرل ق الملح المتوازن (EBSS ، سيغما 28888) ، مع فلتر تصفية 0.2 ميكرومتر حقنة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). 1ml تخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا ، واستخدام 1 مل لإعداد حل ملل 100 من الطلاء.
- BSA (1mg/ml حل الأسهم) : استخدام سيغما A4919 - 1G. تزن 20 ملغ ، وتذوب في جيش صرب البوسنة EBSS 20 مليليتر عقيمة ، مع فلتر تصفية 0.2 ميكرومتر حقنة في ش. قسامة في قارورة 1ml وتخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. 1ml استخدام المخزون لجعل 100mls حل الطلاء.
- . الكولاجين حل سهم (0.1 ٪ كما هو منصوص عليه أو من 1mg/ml سيغما C8919) ملاحظة : فتح فقط في BSC وختم ضيق قبل ان يعود الى البراد. استخدام 3 مل من الأسهم لجعل 100 مل من محلول الطلاء.
- طلاء محلول المخزون : في ش : إضافة 3mls الكولاجين (1mg/ml) إلى [فيبرونكتين] 1ml (1mg/ml) و1ml BSA (1mg/ml) ، بالإضافة إلى 95 مليليتر EBSS (معقمة). مزيج جيد وقسامة في قارورة 2 مل وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. الحل النهائي التركيزات في الأسهم طلاء : فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل) ، BSA (10 ميكروغرام / مل) ، والكولاجين (30 ميكروغرام / مل) في EBSS.
2. إعداد متوسطة الثقافة (في إعداد BSC) : متوسطة تتألف من DMEM / هام F - 12 من سيغما مع استخراج الغدة النخامية البقري (15 ميكروغرام / مل) ، وعامل نمو البشرة (10 نانوغرام / مل) مع الإضافات الأخرى كما هو مبين أدناه. مضاد حيوي / مضاد فطري (1 ٪) وFBS (1 ٪) تضاف طازجة في كل مرة يتم تغيير ثقافة المتوسط. وقد تم تجميع هذه الوسيلة من خلال استعراض أساليب متعددة الثقافات التي وصفت الهوائية الخلايا الظهارية 3-9. والمقصود لدينا المتوسطة لتحقيق النمو الأمثل للخلايا الظهارية البشرية القصبية.
- استخراج الغدة النخامية البقري (BPE محلول المخزون 1mg/ml) : سيغما P1476 (2.5 مل BPE في حل 14mg/ml معقمة وتصفيتها) : خفف 2.5 مليليتر من الأسهم (14mg/ml) إلى التركيز النهائي لل1mg/ml. أي بإضافة 2.5 مل BPE الأسهم إلى 32.5 مل من EBSS العقيمة للمخزون من 1mg/ml. الفجوة في aliquots مل 7.5 (4 أنابيب من 7.5 مل aliquots وأنبوب واحد من قسامة 5 مل). بعد التخفيف ، aliquots تخزين -20 درجة مئوية في حين الحاجة. لا ينصح للتخزين لفترات طويلة من المنتجات المعاد والمتكرر تجميد والذوبان.
- عامل نمو البشرة (EGF 10 محلول المخزون ميكروغرام / مل) : سيغما E9644 - 0.2mg. إعادة محتويات (0.2mg) في 20 مللي من 0.2 ملم تصفيتها حمض الخليك 10 ملم تحتوي على 0.1 ٪ BSA (أي حل جيش صرب البوسنة 20 ملغ في 20 مل من حمض الخليك 10 مم وتصفية ثم استخدامها لإعادة EGF). قسامة إلى 0.5 مل aliquots وتخزينها في الثلاجة -20. استخدام وسائل الإعلام 100μl 100 مل.
- الإيبينيفرين (5mg/ml حل الأسهم) : سيغما E1635. تذوب في 10mg 2ml من حمض الهيدروكلوريك تصفيتها 1M (حمض الهيدروكلوريك) ، قسامة إلى 50 قارورة ميكرولتر وتجميد (-20 درجة مئوية).
- الانسولين (2mg/ml حل الأسهم) : سيغما I6634 50mg. 50mg 25ml في حل تصفية حمض الهيدروكلوريك المخفف (فلتر 0.2μm) (1MM). قسامة في قارورة 1.25ml.
- Tranferrin الإنسان (50 ملغ / مل محلول المخزون) : سيغما T8158 100mg و. تذوب في 100mg 2ml DH20 (تصفيتها مع 0.2 ميكرون فلتر). قسامة إلى كل 100μl (في قنينة 0.5ml).
- Triiodo - L - ثيرونين (1mg/ml حل الأسهم) : سيغما T6397 100mg و. حل 100mg في 1M 100ML تصفيتها حمض الهيدروكلوريك. قسامة في aliquots 1ml. 0.5ml قسامة في aliquots 10μl.
- Hydorcortisone (5mg/ml حل الأسهم) : سيغما H0888 زن من 100mg وتذوب في 20ml الايثانول لتصفية المخزون 5mg/ml. قسامة لقوارير 1ml. تقسيم 1ml (5mg/ml) ل50μl aliquots (قنينة 0.5ml).
- حمض الريتينويك (1mg/ml حل الأوراق المالية ، والمخفف ل0.01mg/ml عند استخدامها) : سيغما R2625 100mg). حل 100mg في 10ML من الايثانول. تقسيم لaliquots 1.0ml. الفجوة (1ml) إلى 50 قارورة من أنابيب 20μl لكل منهما. التجميد في -20 درجة مئوية. تأخذ واحدة قنينة 20μl وتمييع ل2000μl مع وسائل الإعلام عن مخزون من 0.01mg/ml عند الحاجة.
- حل ألبومين المصل البقري من ، عقيمة ، تصفية خلية ثقافة ، واختبارها : سيغما A8412. حل تخزين في البرد (4 درجات مئوية) لحين الحاجة إليها. مفتوحة فقط في ش.
- مضاد فطري للمضادات الحيوية ، سيغما A5955 : قسامة إلى وحدات تخزين وتجميد 1ml في حاجة إلى -20 درجة مئوية حتى. التركيز على استخدام النهائي 1 ٪ في المتوسط.
- FBS ، سيغما F1015 : FBS يعطل في 50 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية. السماح لتبرد في ش. قسامة في قوارير معقمة 1ml و 10 مل. التركيز على استخدام النهائي 1 ٪ في المتوسط في الثقافة وتركيز نهائي 10 ٪ في وسائل الاعلام لتحييد التربسين / EDTA الحل.
- دستور مستنبت :
إلى500 مل من استخدام DMEM/HamF12 المتوسط :- 1 أنبوب BPE (كل من 1mg/ml 7.5ml) لتركيز 15μg/ml النهائي.
- 1 أنبوب EGF (0.5ml من 10μg/ml) لتركيز 10ng/ml النهائي.
- 1 أنبوب الإيبينيفرين (50μl من 5mg/ml) لتركيز 0.5μg/ml النهائي.
- 1 فيال من الانسولين (1.25ml من 2mg/ml) لتركيز 5μg/ml النهائي.
- 1 فيال من Transferin (100μl من 50mg/ml) لتركيز 10μg/ml النهائي.
- 5 ميكرولتر من Triiodo - L - ثيرونين (في 1mg/ml) لتركيز 10ng/ml النهائي.
- 1 فيال من الهيدروكورتيزون (50μl من 5mg/ml) لتركيز 0.5μg/ml النهائي.
- 5 ميكرولتر من حمض الريتينويك المخفف ل0.01mg/ml لتركيز 0.1ng/ml النهائي.
- 10 حل ألبومين المصل البقري ميكرولتر من أجل تركيز النهائي من 1.5μg/ml
3. إعداد حلول التفكك :
- إعداد محلول المخزون التربسين / EDTA : حل 100mg التربسين (سيغما T9935 - 100mg) و40mg EDTA (سيغما E6758) في 500 مل 0.01M برنامج تلفزيوني (سيغما E6758). . قسامة في قارورة 2ml وتخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية تمييع الحل المخزون : إضافة 2 مل من محلول المخزون لبرنامج تلفزيوني مل 6 (تركيز النهائي من التربسين هو 250 ميكروغرام / مل وEDTA هو 100 ميكروغرام / مل).
- الحل لوقف التفاعلات الأنزيمية : تحضير الطازجة 10 ٪ FBS في وسائل الإعلام في BSC : إضافة 1 مل مل FBS وسائل الاعلام 9 (DMEM / هام F - 12). لكل لوحة 100mm استخدام 8 مل من FBS 10 ٪ تحسنت لتحييد 8 مل من محلول التفكك.
4. متطلبات خاصة :
- زراعة الخلايا الظهارية عندما تحتاج إلى الحفاظ على كل شيء نظيف وتطهيرها. ينبغي لجميع الكواشف المستخدمة لزراعة الخلايا تكون عقيمة أو تصفيتها مع تصفية 0.2μm. وينبغي أن يتم إعداد المواد والمواد المضافة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC). ينبغي القيام به وسائل الإعلام بالإضافة إلى وسائل الإعلام أو تغيير في ش.
- ربطة الشعر بعيدا ، وارتداء قبعة المتاح إذا كانت متوفرة ، وارتداء معطف المختبر وقفازات.
- إبقاء جميع أسطح العمل خالية من الفوضى. تنظيف أسطح العمل مع الايثانول 70 ٪ بين العمليات وتسمح بحد أدنى من 15 دقيقة بين التعامل مع الثقافات المختلفة.
- تسمية جميع الكواشف والزجاجات وسائل الإعلام ، وتشمل التاريخ والتاريخ تلقى المعدة.
- دراسة الثقافات وسائل الاعلام بشكل منتظم للحصول على أدلة من إجمالي التلوث الجرثومي أو الفطري.
- اختبار بانتظام لالميكوبلازما (عند الحاجة)
- الاحماء مستنبت إلى 37 درجة مئوية قبل تغيير وسائل الاعلام على الخلايا.
- وينبغي أن المضادات الحيوية / antimycotics FBS واضاف طازجة والمتوسطة.
- تغيير المتوسطة على الأقل كل 3-4 أيام. لا تدع الجلوس الخلايا في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة. تغير وسائل الاعلام والعودة فورا إلى الحاضنة.
ممثل النتائج :
خصائص الثقافة ومورفولوجيا الخلايا الظهارية البشرية القصبية
أظهر الفحص المجهري للخلايا الظهارية البشرية القصبية نحى من شرائح الشعب الهوائية المستخدمة للثقافة ، وذلك قبل زراعة ، شرائط من الخلايا الظهارية كلا مهدبة وغير مهدبة ، مما يدل على أن البشرة العادية (الشكل رقم 1 ، الملحق 1). Immunostaining الاستعدادات cytospin من الخلايا والخلايا من explants المصنفة على coverslips كشفت أن كل الخلايا كانت ايجابية للظهارة cytokeratins محددة (الشكل 3). ثقافات ناجحة من explants من النسيج الشعبي وقعت في 8 من أصل 9 الأنسجة ، كما حصل المصابة واحدة من الثقافات ازدراع. بلغ حلقات الخلايا الظهارية نصف قطرها 1-2 سم في الأسابيع 3-4 (الشكل 2A). وكان المثقف explants الناجحة مرة أخرى تصل إلى 6 مرات. في جميع الثقافات الناجحة ، وهناك أدلة على وجود خلية الهجرة في غضون 48 ساعة من بدء عمليات زرع (الشكل 2B). وكان مظهر الخلايا الحصوه والتي تختلف عن هذه الخلايا الظهارية كما هو موضح في الشكلين 2 و 4 و 5 و 6. وأظهرت شبه مثقف خلايا الشعب الهوائية immunostaining ايجابية وموحدة للcytokeratin E كادهيرين. Immunostaining مع أجسام مضادة محددة ضد أنواع الخلايا الأخرى لم تظهر أي مؤشر على تلوث الثقافات الليفية ، mesenchymal ، أو بطانة الخلايا (α - SMA ، وvimentin CD31 : PECAM البقع - 1 على التوالي) (الشكل 5). الخلايا المستزرعة على الأغشية البوليستر نفاذية (transwells) مع الهواء السائل واجهة مختلفة في ظهارة مهدبة كما هو موضح في الشكل 6. تسجيلات الفيديو ممثل الخلايا الظهارية القصبية نمت على transwells إظهار ظهارة متباينة مع الضرب أهداب (الملحق 2).
وتظهر خصائص الثقافات البشرية القصبية اختبار الخلايا الظهارية في الجدول 1. كان متوسط الوقت اللازم للمرور الأول (P1) 4 أسابيع ، وكان يعني العائد 15.1 ± 2750000 الخلايا (ن = 9 الأنسجة). وتم تقييم جدوى خلايا من explants والاستبعاد من قبل في P1 التريبان الأزرق ، وكان مرتفعا باستمرار (99 ٪) في هذه الثقافات الشعب الهوائية. وكان يتم تجميع شبه مثقف خلايا من الثقافات يزدرع من كل الأنسجة بعد مرور أول استخدام لاحقة. وكان عدد الخلايا يعني تعافى من explants أعلى بكثير من ثقافة ممر اللاحقة (في كل خلايا 2000000 P1 من P2 أسفرت : 6.75 ± 2400000 الخلايا ، ن = 5 الأنسجة). تم تجاهل ثقافة واحدة P2 كما لم تكن نموذجية مورفولوجيا الخلايا الظهارية (7A الشكل). وبالمثل ، تم تجاهل ممرين الأخرى (P2 و P3) من الأنسجة المختلفة (7B الشكل).
الشكل 1 شرائح الأنسجة البشرية والشعب الهوائية المعزولة شريطا حديثا من الخلايا الظهارية مهدبة وغير مهدبة. (أ) صورة الممثل من شرائح الأنسجة البشرية القصبي -- ~ 1 - 2cm طويلة و<1cm القطر المستخدمة للثقافات الأولية من الخلايا الظهارية البشرية القصبية. (ب) شريط من الخلايا البشرية القصبية الظهارية نحى من الجزء القصبي يوضح كل من الخلايا الظهارية مهدبة وغير مهدبة ، 320X التكبير. يتم توفير فيديو لضرب الخلايا التي تحتوي على أهداب كما الملحق 1.
الشكل 2 الإنسان الخلايا الظهارية القصبية نمت من explants على لوحات 100mm زراعة الأنسجة. أ) مع لوحة 100mm 2 - 3mm3 الأنسجة. علما حلقة حول خلايا 2cm - 1 التي تصبح مرئية للعين المجردة بعد 3-4 أسابيع. ب) صورة من حافة يزدرع الأنسجة والخلايا الظهارية كما تهاجر من يزدرع ، بار = 100μm. Explants نقلها الى زرع صفيحة جديدة تصبح. يمكن زرعها Explants تصل إلى 6 مرات.
الشكل 3 نمت من خلايا explants الملون لcytokeratins محددة ظهارة. وكانت ملطخة Cytospins من الخلايا من أجل explants cytokeratins (الخضراء) مع وحيدة النسيلة المضادة للعموم Cytokeratin - FITC (خليط) الذي يعترف cytokeratins الإنسان 1 ، 4 ، 5 ، 6 ، 8 ، 10 ، 13 ، 18 ، و 19. وكانت ملطخة النوى مع هويشت صمة عار (الأزرق). صورة مدمجة تبين أن خلايا الشعب الهوائية ونمت من explants أساسا الخلايا الظهارية ، بار = 20μm.
الشكل 4 الفرعية ثقافة الخلايا الظهارية البشرية القصبية. أ) استخدام التربسين / EDTA ، ورفعت من الخلايا وزرع explants من لوحات 100mm ، وعدها المصنف بمعدل 2-3 مليون خلية في T75 القارورة. تنمو الخلايا لالتقاء الفرعي (80-90 ٪) في قوارير T75 في الأيام 28-30 (ب ، ج). لاحظ مورفولوجيا الحصوه نموذجية من الخلايا الظهارية ، بار = 100μm.
وتم التحقق من الرقم 5 الفرعية مثقف الخلايا الظهارية القصبية كما immunostaining به. هذه الخلايا الملون الايجابية (الخضراء) لCytokeratin - FITC (أ ، ب) ، والتحكم إيجابية لcytokeratin FITC - A549 هو مبين في الخلايا الظهارية (ج) ، وأظهرت مراقبة سلبية في الخلايا الليفية (د). ملطخة خلايا الشعب الهوائية مثقف إيجابية (أحمر غامق) لفلور E-Cadherin/Alexa 594 (ط ، ي) ، وصمة عار للم α - SMA - cy3 PECAM (ه ، و) ، Vimentin / TRITC (م) ، ولا CD31 ( -1/FITC) (س) التي تشير إلى عدم وجود تلوث في الخلايا الظهارية القصبية مثقف الأولية مع العضلات الملساء ، الوسيطة ، أو الخلايا البطانية على التوالي. وتتجلى السيطرة الايجابية (أحمر غامق) لفلور E-Cadherin/Alexa A549 594 في الخلايا الظهارية (ك). وتتجلى سيطرة إيجابية لα - SMA - cy3 (الحمراء) في الخلايا الليفية (ز ، ح). وترد ضوابط الضد الثانوي في الخلايا الظهارية القصبية لفلور اليكسا 594 (ل) ؛ أرنب المضادة للماوس TRITC (ن) وحمار المضادة للماعز FITC (ع). = شريط 20μm.
الشكل 6 الإنسان الخلايا الظهارية القصبية مثقف على transwells. يتم استزراع خلايا مهدبة على الأغشية البوليستر نفاذية (6.5mm قطر) في مناطق ذات كثافة البذر من 50000 سلليرة سورية لكل بئر (أ) = 100μm بار. Immunostaining الخلايا المستزرعة على transwells مع cytokeratin - FITC (الخضراء) ودابي (الأزرق) يدل على أن هذه الخلايا هي الخلايا الظهارية أساسا ، بار = 20μm. يتم استزراع خلايا مغمورة في وسائل الاعلام لمدة 10 يوما ، ثم غذت وسائل الاعلام من أسفل فقط لمدة 4-6 أسابيع لتهيئة علي حتى تزرع أهداب كما هو مبين في الفقرة (ب) 160x التكبير. انظر الملحق 2 للفيديو ضرب الأهداب. (ج) إظهار الصور TEM نمو أهداب الثقافات علي في 6 أسابيع ، والتكبير = 150000x.
الشكل 7 مثال من الخلايا التي يجب التخلص منها بناء على شكلها. هذه الخلايا عادة ما تظهر عندما تم زرع أنسجة عدة مرات. علما أنه ينبغي تجاهل كل من الخلايا وزرع الأعضاء. أ) جمعت الخلايا من اللوحة مع الزرع التي تم تربيتها 6 مرات ومطلي في قارورة T75. في حدود 1 في الاسبوع أظهرت خلايا مورفولوجيا المتميزة التي لا تمثل مظهر الحصوه من الخلايا الظهارية. بدلا من ذلك ، كانت خلايا مستطيلة رقيقة متزايد بالسكان. ب) ينبغي تجاهل المزيد من الأمثلة على الخلايا التي لا ينبغي أن تكون مجمعة مع الخلايا الظهارية نموذجي ، ولكن. = شريط 100μm.
الجدول 1 : خصائص الثقافات البشرية القصبية الخلايا الظهارية
| نسبة النجاح (# الأنسجة) | 09/08 (88.8 ٪) |
| متوسط الوقت (المدى) إلى P1 (أسابيع) | 4 (3-5) |
| يعني (SEM) أي الخلية. في P1 | 15.1 (2.75) × 10 6 |
| يعني (SEM) البقاء في P1 | 99 ٪ (2 ٪) |
| (P1 = الممر الأول) | |
الملحق 1 يبين شريط من خلايا مهدبة وغير مهدبة - الظهارية القصبية نحى من الشعب الهوائية جزءا لاستخدامها في عمليات زرع الإنسان ، 320X التكبير. اضغط هنا للفيديو 1 الملحق.
الملحق 2 المتباينة الخلايا الظهارية القصبية نمت على واجهة الهواء السائل. أشرطة الفيديو (2A و 2B) وتظهر الضرب 160X أهداب التكبير ، و320X على التوالي. اضغط هنا للفيديو الملحق 2A. اضغط هنا للفيديو الملحق 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة التي قدمت لنا وسائل مفصلة للثقافة وتوسيع الشعب الهوائية الخلايا الظهارية الإنسان الأساسية. أظهرنا كيف explants وزرع أنسجة الشعب الهوائية ، ومثقف في وسائل الإعلام التي تروج للنمو الخلايا الظهارية ، ويمكن توفير مصدر مستمر من الخلايا الظهارية البشرية الهوائية للدراسات غير متمايزة نماذج الخلية (المغمور) والمتفاوتة (نمت على الهواء السائل واجهة) . ويمكن استخدام هذه الخلايا في نظم اختبار المخدرات أن أكثر شبها الخلايا في بيئاتهم فيزيولوجية حقيقية. من المهم جدا أن تشاهد الخلايا التي تنمو من explants / زرع وتأكيد مورفولوجيا الحصوه. إذا كانت الخلايا تظهر مورفولوجية مختلفة ، وتجاهل كل من الخلايا وexplants / عمليات زرع الأعضاء ، ومواصلة زرع أنسجة ناجحة فقط. أخذت الثقافات علي في أيدينا وقتا أطول لتكون المنشأة مما ذكر في وقت سابق 2. فمن الممكن أن يتغير كل يوم وسائل الإعلام الأخرى على نحو أسرع قد تشجع علي تمايز الخلايا الظهارية ونمو الأهداب.
نأمل أن الأساليب المذكورة هنا سوف نشجعكم على الثقافة الإنسانية من الخلايا الظهارية القصبية explants واستخدام هذه الخلايا في نظم الدراسة. بعد كل شيء ، هناك حاجة الإنسان الخلية المستندة إلى دراسات لتحديد مسارات هامة من آليات أمراض الرئة البشرية وتطوير الخلية التي يوجد مقرها في المختبر وفحص السمية للخلايا البشرية فعالية مما يؤدي إلى التقييم المبكر ومعدلات نجاح أفضل من العقاقير الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون جدا للدكتور ريتشارد Inculet لتوفير أنسجة الشعب الهوائية. تم الحصول على موافقات مجلس البحوث الأخلاقيات الطبية من هاميلتون القديس يوسف وجامعة اونتاريو / لندن الغربية مركز علوم الصحة (الدكتور ديفيد ماكورماك) ، مناديل والمحفوظات اللجنة ، قسم علم الأمراض. ونحن نشكر أيضا إرني سبيتزر (الميكروسكوب الالكتروني ، جامعة ماكماستر) لتوفير إحساس الغانيين علي الثقافات لدينا ، وفاركاس دانييلا لتوفير بعض المواد اللازمة لimmunostaining. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كتلة منحة المدى من جمعية أونتاريو الصدر ؛ وأيد الدكتور ياغي أسماء من قبل منحة FSORC ، والرعاية الصحية سانت جوزيف ، هاميلتون ، اونتاريو ، كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
|||
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
