Summary
כאן אנו מתארים את שיטת מפורט לגידול העיקרי בתאים אנושיים אפיתל הסימפונות מ explants של רקמה אנושית דרכי הנשימה הסימפונות כולל גידול הבדיל על ממשק אוויר נוזלי. שיטה זו מספקת מקור שופע של תאים ראשוניים על חקירת תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה בריאות מחלת ריאות האדם.
Abstract
האדם תאים אפיתל הסימפונות יש צורך מודלים התא של המחלה כדי לחקור את ההשפעה של excipients וסוכני תרופתי על תפקוד ומבנה של תאים אפיתל אנושיים. כאן אנו לתאר בפירוט את השיטה של גידול בתאי אפיתל הסימפונות מרקמות דרכי הנשימה הסימפונות כי הוא שנקטפו על ידי המנתח על פי ניתוחים הריאות (סרטן ריאות למשל או ניתוח הקטנת נפח הריאה). באישור אתיקה הסכמה מדעת, המנתח לוקח את מה שדרוש על פתולוגיה מספק לנו חלק הסימפונות כי הוא מרוחק מאזורי החולות. הרקמה משמשת אז כמקור explants כי ניתן להשתמש לגידול העיקרי לתאי האפיתל הסימפונות בתרבות. קטעי הסימפונות על 0.5-1cm ארוך ≤ 1cm בקוטר הם שטופים עם EBSS קר רקמות parenchymal עודף מוסר. מגזרי נחתכים פתוח טחון לתוך 2-3mm
Protocol
קטעי הסימפונות האדם לספק מקור שופע של העיקרי בתאי אפיתל הסימפונות. במאמר זה נתאר את פרוטוקול לצמיחה והרחבה של האדם הסימפונות (HBE) לתאי האפיתל של הסימפונות קטעים בודדים טרי האדם. פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים:
- ציפוי ומגרד צלחות תרבות 100mm
- הכנת Explants רקמת ריאות
- השתלת רקמות הסימפונות
- מעבר של תאים HBE
- גידול תאים HBE ריסי על Transwells
לפני שאתה מתחיל שים לב כי כל הצעדים נעשים הממשלה בטיחות ביולוגית (BSC) אלא אם צויין אחרת. אנא ודא שיש לך את כל החומרים הדרושים לצורך הליך זה. אנא קרא את החומרים, ריאגנטים סעיף הכנה וודא שיש לך בסביבה נקייה מחיידקים (כלומר בארון בטיחות ביולוגית או BSC) הכין את הפעולות הבאות:
מניות פתרון ציפוי: פיברונקטין (10 מיקרוגרם / מ"ל), ארגון ה-BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו קולגן (30 מיקרוגרם / מ"ל) של תמיסת מלח מאוזן של ארל (EBSS, סטרילי).
בינוני תרבות: DMEM / חם ה-F-12 עם תוספים, אנטיביוטיקה antimycotic (1%) ו FBS (1%)
דיסוציאציה פתרונות: טריפסין / EDTA מניות פתרון DMEM/F-12 עם FBS (10%)
1. ציפוי ומגרד צלחות תרבות 100mm: Explants תהיה מצופה בלוחות תרבות 100mm. התחל על ידי 100mm ציפוי צלחות תרבות עם פתרון הציפוי. זה צריך להיעשות ב BSC, לשמור על הכל סטרילי.
- מקום סטרילי צלחות תרבות 100mm פתרון ציפוי (קולגן / פיברונקטין / BSA) ב BSC.
- פיפטה 2.0 מ"ל של ציפוי פתרון צלחת 100mm.
- מערבולת סביב מעיל הבסיס של הצלחת. ודא כי פתרון ציפוי מכסה את הבסיס של הצלחת באופן שווה.
- פיפטה הפתרון שאריות החוצה ולהשתמש בו כדי מעיל צלחת 100mm השני. חזור על הצלחות כמו רבים לפי הצורך. מספר צלחות הדרוש משתנה בהתאם למספר explants רקמות.
- ודא כי פתרון ציפוי מכסה את הבסיסים של הצלחות באופן שווה כפי שמודגם.
- מכסים את צלחות עם מכסה שלהם. אפשר הצלחות להתייבש בחממה במשך 1-2 שעות לשאוב פתרון עודף לפני השימוש עבור explants רקמת ריאות. בשימוש צלחות תרבות מצופה יכול להיות ממוקם בתוך שקית סטרילית, אטום ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר (ניתן לשמור עד חודש במקרר). מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- תרסיס לניקוי מספריים חדות קטן, אזמל, ו מלקחיים עם אתנול 70% ולהביא לתוך BSC. Scratch צלחות מצופה על ידי לחיצה בתוקף עם אזמל כדי ליצור עמוק קטן X ים (לפחות 4). אם שריטה אינו עמוק מספיק, פיסות הרקמה לא להתיישב רכסים יצוף.
2. הכנת Explants רקמת ריאות
השתמש רקמת ריאות שהושגו תוך 24-36 שעות לאחר הניתוח. שמור על רקמות קרח EBSS עד מוכן לשימוש.
- מחוץ BSC: רקמה מקום בצלחת פטרי. שוטפים את דגימות רקמה אנושית מבודדת הסימפונות ביסודיות EBSS.
- לנתח את הרקמה שמסביב עודף.
- גזור לפתוח את חתיכות הסימפונות.
- תביאו רקמה לתוך BSC ולהעביר לתוך צלחת רקמה סטרילית 100mm תרבות עם DMEM/HamF12 קר + 1% אנטיביוטי / antimycotic.
- השתמש במספריים חדים קטן כדי לחתוך את הרקמה לתוך מרס 2-3 חתיכות מ"מ.
- מניחים פיסת רקמה לחתוך במרכז X כל אחד עם מלקחיים ולחצו בעדינות.
- תן חתיכות רקמה (explants) לדבוק הצלחת במשך כמה שניות, ואז בעדינות להוסיף 10 מ"ל של מדיה מלאה (DMEM/HamF12 + תוספים 1% אנטיביוטי / antimycotic FBS + 1%). אם הרקמה צף לאחר הוספת מדיה, להשתמש במלקחיים כדי לדחוף את הרקמות לתוך הרכסים של X או לעשות X. חדש זה עשוי להיות נחוץ כדי להפוך את X החדש של רכסים אם הם לא עמוק מספיק.
- המקום צלחות החממה ושינוי בתקשורת כל 3-4 ימים.
- רקמות מוכנים להשתלה כאשר תאים אפיתל מספיק גדלו סביב explants רקמות כדי לכסות 1-2cm אזורים. זה לוקח בערך 4 שבועות.
3. השתלת רקמות הסימפונות
- השתמש צלחות מצופה וגירד 100mm. מאז כמה explants רקמה לא יכול להיות מוצלח, מספר צלחות תלוי כמה חלקים רבים של רקמות אתה השתלה. אם אתה משתמש צלחות כי בעבר מצופה המאוחסן ב 4 ° C, מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- בעזרת מלקחיים, בזהירות להרים רקמות מהצלחת המקום המקורי במרכז X ים בצלחת החדש, ולחצו בעדינות. רקמות עם תוצאה לא אמור להיות מושלך.
- בואו רקמות לדבוק צלחת לכמה שניות, להוסיף מדיה דגירה אוזן כמתוארLier עבור explants (2.7-2.9).
4. המעבר של האדם הסימפונות (HBE) לתאי האפיתל
- הפשירי 2ml של פתרון טריפסין / EDTA מניות עבור כל צלחת רקמות 100mm תרבות. מניות מדולל עם 6ml של סטרילית 0.01M PBS (כלומר להוסיף 2 מניות פתרון מ"ל עד 6 מ"ל PBS (הריכוז הסופי של טריפסין הוא 250 מיקרוגרם / מ"ל ועבור EDTA הוא 100 מיקרוגרם / מ"ל).
- לאחר העברת explants לצלחת חדשה, לשאוב מדיה צלחות עם 1-2cm טבעות של תאים.
- הוסף 8ml של פתרון חימם טריפסין / EDTA בדילול מלא על כל צלחת מקום 100mm ו אינקובטור (37 מעלות צלזיוס) במשך 3-15 דקות. בדוק לעיתים קרובות, עוזב טריפסין על זמן רב מדי תגרום נזק לתאים.
- בדוק צלחות תחת מיקרוסקופ כדי להיות בטוח ביותר של התאים הוסרו. תאים יהיה לאסוף ולנתק כמוצג.
- הוסף 8ml של חימם 10% FBS בתקשורת לכל צלחת כדי להשבית את הפתרון טריפסין / EDTA.
- מערבבים את כל הכרכים של צלחות לתוך צינור אחד (או צינורות נפרדים אם רקמות שונות). ספירת תאים באמצעות hemacytometer.
- צנטריפוגה ב 100 גרם במשך 5 דקות. גלולה תא יהוו בבסיס של הצינור.
- Re-להשעות תא גלולה בתקשורת מלאה (DMEM / חם + F12 כל תוספים + 1% לאנטיביוטיקה antimycotic + 1% FBS) לריכוז התא הרצוי.
- מניחים כל 2-3000000 תאים לכל בקבוק T75 ולהוסיף התקשורת להשלים כנדרש. דגירה ולשנות התקשורת כל 3-4 שבועות. תאים לגדול מפגש קטן (80-90%) ב T75 צלוחיות כ 4 שבועות. התאים צריכים להיות הרים והרחיב או להשתמש בנקודת המפגש קטן כדי למנוע הזדקנות.
5. גידול ריסי אפיתל הסימפונות האדם (HBE) תאים Transwells.
לתאי האפיתל ראשי גדלה מ explants רקמה / השתלות, ניתן להרחיב עד שלוש פעמים, ולאחר מכן השתמשו. צפיפות זריעה של 50,000 עד 100,000 תאים לכל 2 ס"מ מומלץ 1,2. צפיפות גבוהה מקדמת בידול מהר יותר.
הערה: הכן ההשעיה של תאים למדוד את מספרם. Re-להשעות במדיום תרבות ב 1 מיליון תאים לכל 2ml.
- התחל עם הכנת ממברנות חדירות של transwells על ידי מראש דוגרים התרבות מוסיף התא עם מדיום (DMEM / חם F12) לפני השימוש. צעד זה הוא הכרחי עם תאים אלה רגישים יעזור מצורף התא.
- השתמש מוסיף 6.5 מ"מ אשר משתלבים היטב גם 24 לוחות מרובים.
- הוסף בינוני משני צידי הממברנה (עבור מוסיף 6.5 מ"מ להשתמש 0.6ml בתחתית, 0.1ml למעלה). דגירה 1 שעה בתרבות התא חממה.
- מוציאים בזהירות (לשאוב) בינוני משני הצדדים של הממברנה החל נפח הבסיס הראשון.
בזהירות אומר: הממברנה עלולים להיפגע בקלות, לכן פיפטה בינוני ומטה בצד להוסיף את התרבות, השתמש נפח מומלץ. לא כך תגרום דולף על התקשורת לבארות אחרות.
- זרעים תאים לאחר דגירה-Pre של תמיכה חדיר
- פיפטה בזהירות ההשעיה הסלולרי שלך לתוך הצד apical של הממברנה: לבארות 6.5mm להוסיף 0.1 מ"ל של השעיה התא (כלומר 50,000 תאים) לצד apical של הממברנה.
- פיפטה 0.6ml בינוני בצד הבזאלי של הממברנה.
- להאכיל את התאים מן הצדדים apical ואת הבסיס במשך 10 ימים להקים תרבות מובחנים היטב: בינוני חילופי פעמיים בשבוע בשיטת הדגימה:
- הסר נפח הבסיס first
- החלף נפח apical (0.1ml בינוני)
- הוסף 0.6 מ"ל של מדיום לצד הבסיס של הממברנה.
שיטה זו מקדמת מצורף התא קרום התאים ומונע מלהיות חשוף לאוויר לפרקי זמן ארוכים (חילופי המדיה במהירות להחזיר חממה). - יצירת ממשק אוויר נוזלי (עלי) ביום 10 על ידי הסרת apical בינוני, ולאחר מכן להחליף את 0.6 מ"ל של מדיום בצד הבזאלי של הממברנה.
- שמור על תאים עלי במשך 6 שבועות, שינוי התקשורת פעמיים בשבוע. ריסי התאים יתחילו להופיע 4 שבועות לאחר הקמתה של עלי. תאים יהיה להשיג בידול אחיד לתוך התאים ריסי 6 שבועות לאחר הקמתה של עלי.
חומרים אופן ההכנה:
1. הכנת ציפוי פתרון במלאי (לעשות את זה ב BSC):
ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות לגדול גם על משטחים מצופים פיברונקטין / BSA / קולגן 3. הפתרון מניות ציפוי משמש 100 ברקמת מ"מ צלחות תרבות explant ותרבויות השתלת כפי שתואר לעיל. כמו כן, הפתרון ציפוי יכול לשמש coverslips מעיל לזרז מצורף התא, coverslips אז יכול להיות מנוצל עבור immunostaining ניסויים.
- פיברונקטין (פתרון 1mg/ml מניות): השתמש F2006-2mg של סיגמא. ממיסים 2mg ב 2mls של תמיסת מלח סטרילית מאוזן של ארל (EBSS, Sigma 28,888), לסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק בממשלה בטיחות ביולוגית (BSC). 1ml לאחסן במקפיא -20 ° C לשימוש מאוחר יותר, ולהשתמש 1 מ"ל להכנת 100 MLS של פתרון הציפוי.
- ארגון ה-BSA (פתרון 1mg/ml מניות): השתמש Sigma A4919-1g. לשקול 20 מ"ג ו - BSA להמיס 20 EBSS MLS סטרילי, לסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק של BSC. Aliquot לתוך צלוחיות 1ml ולאחסן במקפיא עד -20 ° C הצורך. השתמש 1ml של המניה לעשות 100mls של פתרון הציפוי.
- . פתרון קולגן המניות (כאמור 0.1% או 1mg/ml מן Sigma C8919) הערה: פתוח רק BSC ולאטום היטב לפני החזרה אל המקרר. השתמש 3 מ"ל של המניה לעשות 100 מ"ל של תמיסת ציפוי.
- מניות פתרון ציפוי: ב BSC: להוסיף קולגן 3mls (1mg/ml) כדי 1ml פיברונקטין (1mg/ml) ו 1ml BSA (1mg/ml), בתוספת 95 MLS EBSS (סטרילי). מערבבים היטב aliquot לתוך צלוחיות 2 מ"ל ולאחסן במקפיא עד -20 ° C הצורך. ריכוזים גמר המלאי פתרון הציפוי: פיברונקטין (10 מיקרוגרם / מ"ל), ארגון ה-BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו קולגן (30 מיקרוגרם / מ"ל) ב EBSS.
2. הכנת בינוני תרבות (להכין את BSC): בינוני מורכב DMEM / Ham-F-12 של סיגמא עם תמצית בלוטת יותרת המוח שור (15 מיקרוגרם / מ"ל) ו - גורם גדילה אפידרמיס (10 ng / ml) עם תוספים אחרים כמפורט להלן. אנטיביוטי / antimycotic (1%) ו FBS (1%) מתווספים טרי בכל פעם בינוני התרבות משתנה. בינוני זה נערך על ידי בדיקת מספר שיטות אשר תיאר אפיתל דרכי הנשימה תא תרבויות 3-9. בינוני שלנו מיועדת לצמיחה אופטימלית של האדם תאים אפיתל הסימפונות.
- תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE פתרון 1mg/ml המלאי): Sigma P1476 (2.5 מ"ל BPE לפתרון 14mg/ml סטרילית מסוננים): לדלל 2.5 MLS של המניה (14mg/ml) לריכוז סופי של 1mg/ml. כלומר, להוסיף 2.5 BPE מניות מ"ל ל 32.5 מ"ל של EBSS סטרילי עבור מלאי של 1mg/ml. מתחלקים 7.5 aliquots מ"ל (4 שפופרות של 7.5 מ"ל aliquots אחד שפופרת של aliquot 5 מ"ל). לאחר דילול, aliquots חנות ב -20 ° C עד הצורך. אחסון ממושך של המוצר מחדש וחזר מקפיא הפשרה אינם מומלצים.
- גורם הגדילה עוריות (EGF 10 מיקרוגרם / מ"ל פתרון המלאי): Sigma E9644-0.2mg. מחדש את התוכן (0.2mg) ב 20 חומצה ms של 0.2 מ"מ 10 מסוננים mM אצטית המכיל 0.1% BSA (כלומר להמיס 20 מ"ג BSA ב 20 מ"ל של חומצה אצטית 10 mM ולסנן ואז להשתמש בו כדי לשקם EGF). Aliquot לתוך 0.5 aliquots מ"ל ולאחסן במקפיא -20. השתמש 100μl מדיה עבור 100 מ"ל.
- אפינפרין (פתרון 5mg/ml המלאי): Sigma E1635. להמיס 10 מ"ג ב 2ml של חומצה הידרוכלורית 1M מסוננים (HCL), aliquot לתוך צלוחיות 50 μl ולהקפיא (-20 ° C).
- אינסולין (פתרון 2mg/ml המלאי): Sigma I6634 50 מ"ג. להמיס 50 מ"ג ב 25ml מסוננים (מסנן 0.2μm) מדולל HCl (1mm). Aliquot לתוך צלוחיות 1.25ml.
- Tranferrin אנוש (50 מ"ג / מ"ל פתרון המלאי): Sigma T8158 100 מ"ג. ממיסים 100 מ"ג ב 2ml DH20 (מסוננים עם 0.2 מיקרומטר מסנן). Aliquot כדי 100μl כל (ב 0.5ml צלוחיות).
- Triiodo-L-thyronine (פתרון 1mg/ml המלאי): Sigma T6397 100 מ"ג. ממיסים 100 מ"ג ב 100 מ"ל 1M HCl מסונן. Aliquot לתוך aliquots 1ml. Aliquot 0.5ml לתוך aliquots 10μl.
- Hydorcortisone (פתרון 5mg/ml מניות). סיגמא H0888 לשקול את 100 מ"ג ו להתמוסס באתנול מסוננים 20ml עבור המניות 5mg/ml. Aliquot על צלוחיות 1ml. הפרד 1ml (5mg/ml) כדי 50μl aliquots (0.5ml צלוחיות).
- Retinoic חומצה (פתרון 1mg/ml מניות, מדולל כדי 0.01mg/ml בעת שימוש): Sigma R2625 100 מ"ג). ממיסים 100 מ"ג ב 10 מ"ל של אתנול. מחלקים ל aliquots 1.0ml. (1ml) מחלקים בקבוקון של 50 צינורות של 20μl כל אחד. להקפיא ב -20 ° C. קח אחד בקבוקון 20μl ו לדלל את 2000μl עם התקשורת מלאי של 0.01mg/ml בעת הצורך.
- פתרון אלבומין בסרום מתרבות שור, סטרילי, מסוננים התא נבדק: Sigma A8412. חנות פתרון בקור (4 ° C) עד הצורך. פתוח רק BSC.
- לאנטיביוטיקה Antimycotic, Sigma A5955: aliquot כדי כרכים 1ml ולהקפיא ב -20 ° C עד הצורך. השתמש בריכוז הסופי 1% בטווח הבינוני.
- FBS, Sigma F1015: להשבית FBS על 50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. אפשר לקרר את BSC. Aliquot לתוך 1ml ו 10 בקבוקונים סטריליים מ"ל. השתמש בריכוז סופי של 1% בינוני תרבות בריכוז הסופי 10% בתקשורת כדי לנטרל טריפסין / EDTA פתרון.
- החוקה של המדיום תרבות:
עבור500 מ"ל של שימוש בינוני DMEM/HamF12:- 1 שפופרת של BPE (כל 7.5ml של 1mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 15μg/ml.
- 1 שפופרת של EGF (0.5ml של 10μg/ml) לצורך ריכוז סופי של 10ng/ml.
- 1 שפופרת של אפינפרין (50μl של 5mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 0.5μg/ml.
- 1 בקבוקון של אינסולין (1.25ml של 2mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 5μg/ml.
- 1 בקבוקון של Transferin (100μl של 50mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 10μg/ml.
- 5 μl של Triiodo-L-thyronine (ב 1mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 10ng/ml.
- 1 בקבוקון של הידרוקורטיזון (50μl של 5mg/ml) לצורך ריכוז סופי של 0.5μg/ml.
- 5 μl של החומצה הרטינואית מדולל כדי 0.01mg/ml ריכוז סופי של 0.1ng/ml.
- 10 פתרון אלבומין μl מ בסרום שור ריכוז סופי של 1.5μg/ml
3. הכנת דיסוציאציה פתרונות:
- הכנת פתרון טריפסין / EDTA המניות: להמיס 100 מ"ג טריפסין (Sigma T9935-100 מ"ג) ו 40 מג EDTA (Sigma E6758) ב 500 מ"ל 0.01M PBS (Sigma E6758). . Aliquot לתוך צלוחיות 2ml ולאחסן במקפיא של -20 ° C מדולל פתרון המניות: להוסיף 2 מניות פתרון מ"ל עד 6 מ"ל PBS (הריכוז הסופי של טריפסין הוא 250 מיקרוגרם / מ"ל ועבור EDTA הוא 100 מיקרוגרם / מ"ל).
- פתרון להפסקת תגובות אנזימטיות: הכן טרי 10% FBS בתקשורת ב BSC: להוסיף 1 מ"ל FBS ל 9 מ"ל מדיה (DMEM / חם F-12). במשך כל צלחת 100mm להשתמש 8 מ"ל חימם 10% FBS לנטרל 8 מ"ל של הפתרון דיסוציאציה.
4. דרישות מיוחדות:
- כאשר תאים culturing אפיתל, אתה צריך לשמור על הכל נקי וחיטוי. כל ריאגנטים המשמש בתרבות התא צריך להיות סטרילי או מסוננים עם מסנן 0.2μm. הכנת חומרים ותוספים צריך להיעשות בממשלה בטיחות ביולוגית (BSC). בנוסף Media או שינוי של התקשורת צריך להיעשות BSC.
- עניבה ושיער משם, לחבוש כובע חד פעמי אם זמין, ללבוש מעיל מעבדה וכפפות.
- שמור את כל משטחי עבודה ללא עומס. נקו את משטחי העבודה עם אתנול 70% בין פעולות לאפשר מינימום של 15 דקות בין טיפול תרבויות שונות.
- לייבל כל ריאגנטים ובקבוקי התקשורת, כולל תאריך קיבל ותאריך מוכן.
- בדוק תרבויות מדיה בקביעות עדות לזיהום חיידקי או פטרייתי ברוטו.
- מבחן בקביעות mycoplasma (במידת הצורך)
- חימום בינוני תרבות 37 ° C לפני שינוי התקשורת על התאים.
- אנטיביוטיקה / antimycotics ו FBS יש להוסיף טרי עד בינוני.
- שנה בינונית לפחות כל 3-4 ימים. אל תתנו התאים בטמפרטורת החדר במשך זמן רב. שינוי התקשורת ומיד לחזור חממה.
נציג תוצאות:
תרבות המאפיינים ומורפולוגיה של אדם בתאי אפיתל הסימפונות
מיקרוסקופית של האדם תאים אפיתל הסימפונות מוברש מן המגזרים הסימפונות המשמש בתרבות, לפני culturing, הפגינו רצועות לתאי האפיתל הן ריסי ולא ריסי המעידים על האפיתל הנורמלי (איור 1, תוספת 1). Immunostaining ההכנות cytospin של תאים explants ותאי זרע על coverslips גילה כי כל התאים היו חיוביות עבור אפיתל ספציפי cytokeratins (איור 3). תרבויות מוצלח מ explants של הרקמה הסימפונות התרחשו 8 מתוך 9 של רקמות, כמו אחת התרבויות explant נדבקה. הטבעות של תאים אפיתל הגיע רדיוס 1-2 ס"מ 3-4 שבועות (איור 2 א). Explants מוצלח היו בתרבית שוב עד 6 פעמים. בכל התרבויות מוצלח, היו ראיות של נדידת תאים בתוך 48 שעות ממועד תחילת השתלות (איור 2b). תאים היה מראה המרוצף כי היא נפרדת עבור אלה לתאי האפיתל כפי שמוצג איורים 2, 4, 5 ו - 6. תת בתרבית תאים הסימפונות הראה immunostaining חיובי אחיד cytokeratin ו-E-cadherin. Immunostaining עם נוגדנים ספציפיים נגד סוגי תאים אחרים לא הראו שום סימן של זיהום של תרבויות ידי fibroblasts, mesencתאים hymal, או האנדותל (α-SMA, vimentin ו CD31: PECAM-1 כתמים בהתאמה) (איור 5). על ממברנות תאים בתרבית פוליאסטר חדיר (transwells) עם ממשק אוויר נוזלי הבדיל לתוך קרום ריסי כפי שהודגם באיור 6. הקלטות וידאו נציג של תאים אפיתל הסימפונות גדל על transwells להפגין אפיתל הבדיל עם מכות cilia (נספח 2).
מאפייני התרבות האנושית תא אפיתל הסימפונות נבדק מוצגים בלוח 1. חציון הזמן עד המעבר הראשון (P1) היה 4 שבועות, התשואה הממוצע היה 15.1 ± 2,750,000 תאים (n = 9 רקמות). יכולת הקיום של תאים explants ועל P1 הוערכה על ידי הרחקה כחול trypan, והיה גבוה באופן עקבי (99%) אלו תרבויות הסימפונות. תת בתרבית תאים מן התרבויות explant מרקמות כל היו ונקווה לאחר המעבר הראשון שימוש לאחר מכן. מספר תאים אומר התאושש explants היה גבוה באופן משמעותי מאשר בתרבות המעבר הבאות (כל 2 מיליון תאים מן P1 P2 הניב: 6.75 ± 2,400,000 תאים, רקמות n = 5). אחת תרבות P2 היה מושלך כמו מורפולוגיה לא היה אופייני לתאי האפיתל (7 א איור). כמו כן, שני הקטעים האחרים (P2 ו P3) של רקמות שונות (איור 7 ב) שהושלכו.
איור 1 קטעי רקמת ריאות האדם ואת רצועת אפיתל של תאים מבודדים טרי ריסי ולא ריסי. (א) נציג תמונה של אדם קטעי רקמה הסימפונות - ~ 1-2cm ארוך <1cm בקוטר-המשמשים בתרבויות העיקרי של האדם תאים אפיתל הסימפונות. (ב) רצועה של האדם תאים אפיתל הסימפונות מוברש מן במגזר בתאי אפיתל הסימפונות מדגים שתי ריסי ולא ריסי, 320X ההגדלה. וידאו של תאים עם מכות cilia ניתנת כתוספת 1.
איור 2 תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ explants על צלחות תרבות 100mm רקמות. א) צלחת 100mm עם רקמה 2-3mm3. שים את הטבעת של תאים של כ 1-2cm אשר הופך להיות גלוי לעין לאחר 3-4 שבועות. ב) תמונה של קצה של רקמות ותאי אפיתל explant כפי שהם לעבור מ explant, בר = 100μm. Explants הועבר השתלות צלחת חדש להיות. Explants ניתן להשתיל עד 6 פעמים.
איור 3 תאים גדלה מ explants מוכתם עבור ספציפיים אפיתל cytokeratins. Cytospins של תאים explants היו מוכתמים עבור cytokeratins (ירוק) עם חד שבטיים נגד פאן Cytokeratin-FITC (תערובת) אשר מזהה cytokeratins האדם 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, 19. גרעינים הוכתמו Hoechst כתם (כחול). התמונה מראה כי למזג תאים הסימפונות גדלה מ explants היו בעיקר בתאי אפיתל, בר = 20μm.
איור 4 תת התרבות של האדם תאים אפיתל הסימפונות. ) שימוש טריפסין / EDTA, תאים explants והשתלות הם הרימו מהצלחות 100mm, נספרו seeded ב 2-3000000 תאים לכל בקבוק T75. תאים לגדול מפגש קטן (80-90%) ב T75 צלוחיות בימים 28-30 (ב, ג). הערה מורפולוגיה המרוצף אופייני לתאי האפיתל, בר = 100μm.
איור 5 משנה Cultured תאים הסימפונות אומתו כמו immunostaining באמצעות אפיתל. תאים אלה מוכתם חיובי (ירוק) עבור Cytokeratin-FITC (א, ב), שליטה חיובית cytokeratin-FITC מוצג A549 לתאי האפיתל (ג) ו ביקורת שלילית מודגם fibroblasts (ד). תאים הסימפונות Cultured מוכתם חיובי (אדום כהה) עבור E-Cadherin/Alexa פלואוריד 594 (i, j), ולא כתם עבור α-SMA-cy3 (ה, ו), vimentin / TRITC (מ '), ולא CD31 (PECAM -1/FITC) (o) המציין אין זיהום של תאים בתרבית ראשונית אפיתל הסימפונות עם שריר חלק, mesenchymal, או לתאי אנדותל בהתאמה. בקרה חיובית (אדום כהה) עבור E-Cadherin/Alexa פלואוריד 594 מודגם על A549 לתאי האפיתל (k). בקרה חיובית עבור α-SMA-cy3 (אדום) מודגם fibroblasts (ז, ח). שולטת נוגדנים משני מוצגים בתאי אפיתל הסימפונות עבור Alexa פלואוריד 594 (l); ארנבת אנטי עכבר TRITC (n) חמור נגד עז FITC (p). בר = 20μm.
איור 6 תאים אנושיים בתרבית אפיתל הסימפונות על transwells. הם ריסי התאים בתרבית על קרום חדיר פוליאסטר (6.5mm קוטר) בשעה צפיפות זריעה של cel 50,000ls היטב לכל (א) בר = 100μm. Immunostaining של תאים בתרבית על transwells עם cytokeratin-FITC (ירוק) ו DAPI (כחול) מראה כי תאים אלה הם תאים אפיתל בעיקר, בר = 20μm. בתרבית תאים הם שקועים בתקשורת במשך 10 ימים, התקשורת נמאס אז מלמטה רק עוד 4-6 שבועות כדי ליצור עלי עד cilia גדלים כפי שמוצג (ב), בהגדלה 160x. ראה נספח 2 עבור קטעי וידאו של מכות cilia. (ג) תמונות TEM להפגין צמיחה cilia של תרבויות עלי בגיל 6 שבועות, הגדלה = 150000x.
איור 7 דוגמה של תאים אמור להיות מושלך המבוסס על מורפולוגיה. תאים אלה מופיעים בדרך כלל כאשר הרקמה כבר המושתלים פעמים רבות. שים לב הן תאים להשתלה צריך להיות מושלך. א) תאים שנאספו צלחת אחת עם השתלות שהיו בתרבית 6 פעמים מצופה בבקבוק T75. בתוך שבוע 1 התאים הראו מורפולוגיה ברורה כי לא ייצג את המראה המרוצף של תאים אפיתל. במקום זאת, תאים מאורכים דק צמחו בצפיפות. ב) דוגמאות נוספות של תאים לא צריך להיות ונקווה עם לתאי האפיתל טיפוסי, אבל צריך להיות מושלך. בר = 100μm.
טבלה 1: מאפיינים של הסימפונות התרבויות האנושיות תא אפיתל
| שיעור ההצלחה (# של רקמות) | 09/08 (88.8%) |
| חציון זמן (טווח) ל P1 (שבועות) | 4 (3-5) |
| ממוצע (SEM) לא התאים. על P1 | 15.1 (2.75) x 10 6 |
| ממוצע (SEM) הכדאיות ב P1 | 99% (2%) |
| (P1 = הקטע הראשון) | |
מוסף 1 מציג רצועה של ריסי ולא ריסי בתאי אפיתל הסימפונות מוברש מן קטע הסימפונות אדם המשמש להשתלה, 320X ההגדלה. לחץ כאן עבור וידאו מוסף 1.
מוסף 2 תאים רמות אפיתל הסימפונות גדל על ממשק אוויר נוזלי. וידיאו (2a ו-2b) להראות מכות, cilia הגדלה 160X ו 320X בהתאמה. לחץ כאן עבור וידאו 2A מוסף. לחץ כאן עבור וידאו 2B מוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה הצגנו שיטות מפורטות תרבות והרחבה של האדם תאים ראשוניים אפיתל הסימפונות. הראינו כיצד explants והשתלות של רקמת הסימפונות, תרבותי בתקשורת אשר לקדם גדילת תאים אפיתל, יכולים לספק מקור מתמיד של תאים אפיתל דרכי הנשימה האנושית ללימודי הלא מובחן מודלים תא (שקוע) הבדיל (גדל על ממשק אוויר נוזלי) . תאים אלה יכולים להיות מנוצל מערכות בדיקה תרופה דומים יותר לתאים בסביבות פיזיולוגי האמיתי שלהם. חשוב מאוד כי אתה צופה את התאים לגדול מן explants / השתלות ואשר את המורפולוגיה המרוצף. אם התאים מראים מורפולוגיה שונים, לבטל את הן את התאים explants / השתלות, ולהמשיך השתלת רקמות מוצלח בלבד. תרבויות עלי בידינו לקח יותר זמן שתוקם מאשר דווח בעבר 2. אפשר לשנות את התקשורת בכל יום אחר על עלי עשוי לקדם מהר התמיינות תאים אפיתל וצמיחה של הריסים.
אנו מקווים בשיטות שתוארו כאן יעודד אתכם התרבות האנושית לתאי האפיתל של הסימפונות explants ולהשתמש תאים אלה במערכות העבודה שלך. אחרי הכל, האדם מבוססי תאים נדרשים מחקרים לקביעת מסלולים חשובים של מנגנוני מחלות אנושיות ריאות לפיתוח תא מבוסס רעילות במבחנה הקרנת יעילות עבור תאים אנושיים המוביל הערכה מוקדמת שיעורי הצלחה טובים יותר של תרופות חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים מאוד ד"ר ריצ'רד Inculet למתן הרקמות הסימפונות. מחקר אתיקה האישורים מועצת התקבלו המילטון בריאות סנט ג'וזף של אוניברסיטת מערב אונטריו / לונדון למדעי הבריאות מרכז (ד"ר דוד מקורמק), רקמות ארכיון הוועדה, המחלקה לפתולוגיה. אנו מודים גם ארני שפיצר (מיקרוסקופית אלקטרונים, אוניברסיטת מקמאסטר) למתן TEMs של תרבויות עלי שלנו, פרקש דניאלה למתן חלק מהחומרים הדרושים immunostaining. עבודה זו מומנה על ידי מענק בלוק טווח מהחברה אונטריו בית החזה, ד"ר אסמא יגי נתמכה על ידי מלגה FSORC, בריאות סנט ג'וזף, המילטון, אונטריו, קנדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
|||
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
