Summary
Burada bir hava-sıvı arayüzü farklılaştırılmış büyüme de dahil olmak üzere insan bronşiyal solunum yolu doku eksplantlar birincil insan bronşiyal epitel hücreleri büyümek için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan akciğer sağlığı ve hastalıkları, solunum yolu epitel rolünü araştırmak için birincil hücreleri bol miktarda kaynak sağlar.
Abstract
İnsan bronşiyal epitel hücreleri hastalığın hücre modelleri için gerekli olan ve insan epitel hücrelerinin işlevi ve yapısı Yardımcı maddeler ve farmakolojik ajanların etkisini araştırmaktı. Burada akciğer ameliyatı (örneğin akciğer kanseri veya akciğer hacim küçültme ameliyatı) zaman cerrah tarafından hasat bronşiyal solunum yolu doku bronş epitel hücreleri büyüyen yöntemi ayrıntılı olarak açıklar. Etik onayı ve bilgilendirilmiş onam, cerrah patoloji için gerekli olan alır ve hastalıklı alanlar uzak bir bronş kısmı ile bize sunuyor. Dokusu primer bronş epitel hücreleri kültürde yetiştirmek için kullanılabilir eksplant kaynağı olarak kullanılır. 0.5-1cm uzunluğunda ve çapı ≤ 1cm hakkında Bronşiyal kesimleri, soğuk EBSS ve aşırı parankimal doku çıkarılır ile durulanır. Segmentler açık kesilmiş ve içine kıyılmış 2-3mm
Protocol
İnsan Bronşiyal bölümleri birincil bronşiyal epitel hücreleri bol miktarda kaynak sağlar. Bu yazıda, taze izole insan bronşiyal segmentleri İnsan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri büyüme ve genişleme için bir protokol açıklar. Bu protokol, beş bölümden oluşmaktadır:
- Kaplama ve 100mm Kültür Tabaklar Kaşıma
- Bronş Doku eksplantlar hazırlanması
- Bronş Doku nakli
- Passage HBE Hücreler
- Transwells büyüyen siliyalı HBE Hücreler
TÜM ADIMLAR aksi belirtilmedikçe, biyolojik güvenlik kabini (BSC) yapılır unutmayın başlamadan önce. Bu prosedür için gerekli tüm malzeme olduğundan emin olun. Malzemeler, Reaktifler ve Hazırlama bölümünde okumak ve aseptik (yani Biyolojik Güvenlik Kabini veya BSC) aşağıdaki hazırlanmış olduğunu emin olun:
Kaplama stok solüsyonu: fibronektin (10 mg / ml), Earle s Dengeli Tuz Çözeltisi BSA (10 mg / ml) ve kolajen (30 mg / ml) (EBSS steril).
Kültür Orta: antibiyotik antimikotik katkı maddeleri (% 1) ve FBS DMEM / Ham F-12 (% 1)
Disosiyasyon çözümleri: tripsin / EDTA stok solüsyonu ve FBS ile DMEM/F-12 (% 10)
1. Kaplama ve 100mm Kültür Tabaklar Kazıma: eksplantlar 100mm kültür plakalar kaplama olacak. Kaplama çözeltisi ile kaplama 100mm kültür plakaları ile başlayın. Bu, her şey steril tutmak BSC yapılmalıdır.
- BSC steril 100mm kültür plakaları ve kaplama çözümü (kollajen / fibronektin / BSA) yerleştirin.
- Pipet 2.0 ml solüsyon 100mm plaka kaplama.
- Kat plaka tabanı etrafında Swirl. Kaplama çözeltisi eşit plaka taban kapsar emin olun.
- Pipet artık çözüm ve ikinci bir 100mm plaka kat kullanabilirsiniz. Birçok tabak gibi gerektiği gibi tekrarlayın. Gerekli plakaların sayısı, doku eksplant sayısı ile değişir.
- Kaplama çözeltisi eşit olarak gösterilen plakalar üsleri kapsar emin olun.
- Plakalar kendi kapakları ile kaplayın. Plakalar 1-2 saat için kuvöz ve kuru bronşiyal doku eksplantlar için kullanmadan önce aşırı çözüm aspire izin verin. Kullanılmayan kaplı kültür plakaları steril bir torbaya konur, kapalı ve 4 saklanan ° C daha sonra kullanmak üzere (buzdolabında bir ay kadar saklanabilir). Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin.
- Sprey,% 70 etanol ile küçük bir keskin makas, neşter ve forseps temiz ve BSC haline getirmek. Derin küçük X (en az 4) oluşturmak için bistüri ile sıkıca basarak kaplı plakalar kazıyın. Sıfırdan yeterince derin değilse, doku parçaları sırtlar içine razı olmaz ve float.
2. Bronş Doku eksplantlar hazırlanması
Ameliyattan sonraki 24-36 saat içinde elde edilen bronşiyal doku kullanın. Kullanıma hazır olana kadar EBSS buz doku tutun.
- BSC dışında: bir Petri kabındaki Yeri doku. EBSS izole insan bronşiyal doku örnekleri iyice durulayın.
- Aşırı çevreleyen doku disseke.
- Bronşiyal parçaları kesilerek açılır.
- DMEM/HamF12 soğuk steril bir 100mm doku kültürü plakasına BSC ve transfer doku getir +% 1 antimikotik / antibiyotik.
- 2-3 mm 3 adet doku kesmek için keskin küçük bir makas kullanın.
- Forseps ve basın hafifçe kesilmiş doku her X merkezinde bir adet.
- Doku parçaları (eksplantlar) birkaç saniye için plaka uyması edelim ve eksiksiz bir medya 10ml (DMEM/HamF12 + katkı maddeleri% 1 antimikotik / antibiyotik +% 1 FBS) yavaşça ekleyin. Doku medya ekledikten sonra yüzer, sırtlar yeterince derin değilse yeni X yapmak için gerekli olabilir doku X sırtlar içine itmek veya yeni bir X yapmak için forseps kullanabilir.
- Kuvöz ve değişim ortamı yerleştirin plakalar her 3-4 gün.
- Dokular yeterli epitel hücreleri, doku eksplantlar yaklaşık 1-2cm alanları kapsayacak şekilde büyüdü nakli için hazırız. Bu, yaklaşık 4 hafta sürer.
3. Bronş Doku nakli
- 100mm kaplı ve çizik tabak kullanın. Bazı doku eksplantlar başarılı olmayabilir beri, plakaların sayısı, kaç adet doku nakli bağlıdır. Daha önce 4 kaplanmış ve saklanan ° C plakaları kullanıyorsanız, kullanmadan önce oda sıcaklığına getirmek.
- Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yeni plaka X s merkezinde orijinal plaka ve yerden doku pick up ve hafifçe bastırın. Dokular herhangi bir akıbet ile atılmalıdır.
- Medya ekleyin ve kulak inkübe olarak tarif edelim, doku, birkaç saniye için plakasına bağlıeksplantlar için lier (2,7-2,9).
4. Passage insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri
- Her 100mm doku kültürü plaka için 2 ml tripsin / EDTA stok solüsyonu çözülme. Steril 0.01m PBS 6ml ile stok seyreltilmiş (yani 6 ml PBS (tripsin nihai konsantrasyonu 2 ml stok solüsyonu 250 mg / ml ve EDTA için) 100 mg / ml 'dir.
- Yeni bir plaka eksplantlar taşındıktan sonra, hücre 1-2cm halkaları ile plakalar medya aspirat.
- Inkübatör her 100mm plaka ve yer (37 ° C) 3-15 dakika ısınmış seyreltilmiş tripsin / EDTA çözeltisi ile 8 ml ekleyin. Çok uzun hücrelere zarar verir tripsin bırakarak, sık sık kontrol edin.
- Hücrelerin çoğu kaldırılmıştır emin olmak için bir mikroskop altında plakaları kontrol edin. Hücreler ve yuvarlak gösterildiği gibi ayırın.
- Tripsin / EDTA çözeltisi inaktive plaka başına medya ısıtılmış% 10 FBS 8 ml ekleyin.
- Bir tüp (ya da eğer farklı dokular ayrı tüpler) Tüm plakaları hacimleri birleştirin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 100g az 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Bir hücre pelet tüpün dibinde oluşturacaktır.
- Istenilen hücre konsantrasyonunu yeniden askıya hücre eksiksiz bir medya pelet (DMEM / Ham F12 + tüm katkı +% 1 antibiyotik-antimikotik +% 1 FBS).
- T75 şişesi ortalama her 2-3 milyon hücre yerleştirin ve gerektiği gibi eksiksiz bir medya. Inkübasyon ve her 3-4 hafta ortamı değiştirmek. Hücreler T75 şişeler yaklaşık 4 hafta içinde alt-izdiham (% 80-90) büyür. Hücreler kaldırdı ve genişletilebilir veya yaşlanması önlemek için alt izdiham kullanılan olmalıdır.
5. Transwells siliyalı İnsan Bronşiyal Epitel (HBE) hücreler büyüyor.
İlköğretim epitel hücreleri, doku eksplantlar / nakli yetişen, üç kata kadar daha genişledi ve daha sonra kullanılan olabilir. Cm 2 başına 50.000 ila 100.000 hücre ekim yoğunluğu 1,2 tavsiye edilir. Yüksek yoğunluklu, hızlı farklılaşmayı teşvik etmektedir.
Not: bir hücre süspansiyon hazırlamak ve bunların sayıları ölçmek. 2ml ortalama 1 milyon hücre kültür ortamında yeniden askıya.
- Kullanmadan önce orta (DMEM / Ham F12) ile hücre kültürü ekler ön kuluçka transwells geçirgen membranların hazırlanması ile başlayın. Bu adım, bu hassas hücreleri ile gerekli ve hücre eki yardımcı olacaktır.
- 24 sıra birden kuyucuğu sığacak 6,5 mm ekler kullanın.
- Membranın her iki tarafında (6.5 mm ekler, alt ve üst 0.1ml 0.6ml kullanan) orta ekleyin. Hücre kültürü inkübatör 1 saat inkübe edin.
- Dikkatle ilk bazal hacmi ile başlayan zarının her iki tarafında (aspirat) orta kaldırmak.
Dikkatle anlamına gelir: membran kolayca zarar görebilir, bu yüzden kültür eklemek yüzü aşağı orta pipetle tavsiye hacmi kullanın. Bunu yapmamak, diğer kuyulara medya üzerinde sızıntı neden olacaktır.
- Geçirgen Destek Ön-kuluçka sonra Tohum Hücreler
- Pipet dikkatle membran apikal tarafında içine hücre süspansiyonu: 6.5mm kuyu membran apikal tarafında hücre süspansiyonu 0.1 ml (yani 50.000 hücreleri) ekleyebilirsiniz.
- Pipet 0.6ml bazal membran tarafında orta.
- Iyi diferansiye bir kültüre kurmak için 10 gün boyunca apikal ve bazal taraftan hücreleri Feed: döviz orta gösterilen yöntemi kullanarak haftada iki kez:
- Önce bazal hacim çıkarın
- Apikal hacmi (0.1ml orta) değiştirin
- 0.6 ml orta bazal membran tarafına ekleyin.
Bu yöntem, hücre eklenti zarı teşvik ve uzun süreler (değişim ortamı hızlı ve inkübatörde geri koymak) için havaya maruz kalma hücreleri engeller. - Sonra bazal membran tarafında 0,6 ml orta yerine 10 günde bir Air-Sıvı arayüzü (ALI), apikal orta kaldırarak oluşturun.
- ALI hücreleri koruyun, 6 hafta boyunca haftada iki kez medya değiştirin. Tüycüklü hücreleri ALI oluşturma 4 hafta sonra görünmeye başlayacaktır. Hücreler ALI oluşturulduktan sonra 6 hafta tüycüklü hücrelerin içine düzgün bir farklılaşma elde edecek.
Malzeme Hazırlığı:
1. Kaplama Menkul Kıymetler Çözüm Hazırlığı (BSC bunu) :
İlköğretim İnsan bronşiyal epitel hücreleri fibronektin / BSA / kollajen 3 ile kaplı yüzeyler üzerinde çok iyi büyür . Kaplama stok solüsyonu eksplant için 100 mm ve yukarıda açıklandığı gibi nakli kültürler doku kültürü plakaları için kullanılır. Ayrıca hücre eklenti kaplama çözümü hızlandırmak için kat lamelleri için kullanılabilir, lamelleri sonra deneyler immün için kullanılacaktır.
- Fibronektin (1mg/ml stok solüsyonu): Sigma Kullanım F2006-2mg. Biyolojik Güvenlik Kabini (BSC) 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre steril Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS Sigma 28888), 2mls 2mg eritin. Store daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C derin dondurucuda 1 ml, 100 ml kaplama çözümün hazırlanması için 1 ml kullanın.
- BSA (1mg/ml stok solüsyonu): Kullanım Sigma A4919-1g. 20 mg BSA tartılır ve BSC 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtre 20 ml steril EBSS içinde çözülür. 1ml şişeleri ve ihtiyaç kadar -20 ° C derin dondurucuda saklayın içine kısım. Kaplama çözüm 100mls yapmak için stok 1ml kullanın.
- Kollajen stok solüsyonu (% 0.1 Sigma C8919 1mg/ml olarak verilmiştir) Not: buzdolabı dönmeden önce sıkı BSC ve mühür sadece açık. Kaplama çözeltisi 100 ml yapmak için 3 ml stok kullanın.
- Kaplama stok solüsyonu: BSC: 1ml Fibronektin (1mg/ml) ve 1 ml BSA (1mg/ml), artı 95 ml EBSS (steril) (1mg/ml) 3mls kollajen eklemek. -20 ° C derin dondurucuda 2 ml flakon ve mağaza içine kadar gerekli ve kısım karıştırın. Nihai kaplama stok çözelti konsantrasyonları: fibronektin (10 mg / ml), BSA (10 mg / ml) ve EBSS kollajen (30 mg / ml).
2. Kültür Orta (BSC hazırlamak) hazırlanması: Orta aşağıda belirtildiği gibi diğer katkı maddeleri ile sığır hipofiz ekstresi (15 mg / ml) ve epidermal büyüme faktörü (10 ng / ml) ile Sigma DMEM / Ham F-12 oluşur. Antimikotik / antibiyotik (% 1) ve FBS (% 1) kültür ortamı değişti her zaman taze eklenir. Bu ortam, hava yolu epitel hücre kültürleri 3-9 açıklanan birden çok yöntem inceleyerek derlenmiştir. Bizim orta insan bronşiyal epitel hücreleri en iyi şekilde büyümesi için tasarlanmıştır.
- Sığır hipofiz ekstresi (BPE 1mg/ml stok solüsyonu): Sigma P1476 (2,5 ml BPE 14mg/ml steril ve filtre edilmiş solüsyon): stokunun sulandırınız 1mg/ml Of final konsantrasyonu 2.5 ml (14mg/ml). yani 1mg/ml bir hisse senedi için steril EBSS 32.5 ml 2.5 ml BPE stok ekleyin. 7.5 ml alikotları (7.5 ml alikotları 4 tüp ve 5 ml kısım tek tüp) içine bölün. Seyreltme sonra, -20 ° C'de mağaza alikotları ihtiyaç kadar. Sulandırılmış ürün Uzun süreli depolama ve dondurma ve çözme tekrarladı tavsiye edilmez.
- Epidermal büyüme faktörü (EGF 10 mg / ml stok solüsyonu): Sigma E9644-0.2 mg. Sulandırın% 0.1 içeren 20 mm 0.2 ms süzülmüş 10 mM asetik asit içeriği (0.2 mg) BSA (yani 20 ml 10 mM asetik asit, 20 mg BSA çözülür ettiğinizde ve sonra sulandırmak EGF için kullanabileceğiniz filtre). Kısım içine 0,5 ml alikotları ve -20 dondurucuda saklayın. 100 ml medya için 100μl kullanın.
- Epinefrin (5mg/ml stok solüsyonu): Sigma E1635. Süzülmüş 1M hidroklorik asit (HCl), 50 ul şişeleri ve dondurma (-20 ° C) içine kısım OF 2ml 10 mg çözülür.
- İnsülin (2mg/ml stok solüsyonu): Sigma I6634 50mg. 25ml süzülmüş (filtre) seyreltilmiş 0.2μm HCl (1mm) 50mg eritin. 1.25ml şişeleri içine kısım.
- Tranferrin İnsan (50 mg / ml stok solüsyonu): Sigma T8158 100mg. (0.2 mikron filtre ile filtrelenmiş) 2ml DH20 100mg eritin. 100μl her (0.5 ml flakon) alikotu.
- Triiodo-L-thyronine (1mg/ml stok solüsyonu): Sigma T6397 100mg. 100ml 1M süzülmüş HCl 100 mg çözülür. 1ml alikotları içine kısım. 10μl alikotları içine kısım 0.5 ml.
- Hydorcortisone (5mg/ml stok solüsyonu): Sigma H0888 100mg tartılır ve 5mg/ml hisse senedi için 20ml süzülmüş etanol içinde çözülür. 1ml şişeleri kısım. Bir 1ml (5mg/ml) 50μl alikotları (0.5 ml flakon) bölün.
- Retinoik Asit (1mg/ml kullanıldığında 0.01mg/ml seyreltilmiş stok solüsyonu): Sigma R2625 100 mg). Etanol 10ml 100mg çözülür. 1.0ml alikotları bölün. Divide (1ml) flakon 20μl her 50 tüp. Freeze az -20 ° C. Bir 20μl göz atın ve gerektiğinde 0.01mg/ml bir hisse senedi için medya ile 2000μl seyreltik.
- Albumin çözüm sığır serum, steril filtreli, hücre kültürü test: Sigma A8412. Mağaza çözüm soğuk (4 ° C) kadar gerekli. BSC sadece açın.
- Antibiyotik antimikotik, Sigma A5955: -20 ° C kadar gerekli 1ml birimlere kısım ve donma. Orta ve% 1 final konsantrasyon kullanın.
- FBS, Sigma F1015: 50 FBS İnaktivasyon ° C 30 dakika. BSC soğumasını bekleyin. 1 ml ve 10 ml steril flakon içine kısım. Tripsin / EDTA çözeltisi nötralize etmek için kültür ortamında nihai konsantrasyonu% 1 ve% 10 medya final konsantrasyon kullanın.
- Kültür ortamı Anayasa:
Için500 ml orta DMEM/HamF12 kullanımı:- 15μg/ml son bir konsantrasyon için BPE 1 tüp (1mg/ml her 7.5ml).
- 10 ng son bir konsantrasyon EGF (10μg/ml, 0.5 ml) 1 tüp.
- 0.5μg/ml son bir konsantrasyon için Epinefrin 1 tüp (5mg/ml, 50μl).
- İnsülin 5μg/ml son bir konsantrasyon için 1 şişe (2mg/ml, 1.25ml).
- 10μg/ml son bir konsantrasyon için Transferin (50mg/ml, 100μl) 1 şişe.
- Triiodo-L-thyronine 10 ng son bir konsantrasyon için 5 ul (1mg/ml).
- Hidrokortizon 0.5μg/ml son bir konsantrasyon için 1 şişe (5mg/ml, 50μl).
- Retinoik Asit 5 ul 0.1ng/ml son bir konsantrasyon için 0.01mg/ml seyreltilir.
- 1.5μg/ml son bir konsantrasyon için, sığır serum 10 ul albümin çözüm
3. Ayrılma Çözümleri hazırlanması:
- Tripsin / EDTA stok solüsyonu hazırlanması: 500 ml 0.01m PBS (Sigma E6758) 100mg tripsin (Sigma T9935-100mg) ve 40 mg EDTA (Sigma E6758) çözülür. 2ml şişeleri ve -20 ° C derin dondurucuda saklayın içine kısım stok solüsyonu sulandırınız: 2 ml 6 ml PBS (tripsin son konsantrasyon EDTA için 250 mg / ml ve 100 mg / ml) stok solüsyonu ekleyin.
- Enzimatik reaksiyonları durdurmak için Çözüm: BSC medya% 10 FBS taze hazırlayın: 9 ml medya (DMEM / Ham F-12) 1 ml FBS ekleyin. Her 100mm plaka için 8 ml ayrışma çözüm nötralize etmek için 8 ml ısındı% 10 FBS kullanın.
4. Özel Şartlar:
- Zaman kültür epitel hücreleri, her şey temiz ve dezenfekte tutmak gerekir. Hücre kültürü için kullanılan tüm reaktifler steril veya 0.2μm filtre ile filtre olmalıdır. Malzemeleri ve katkı maddelerinin hazırlanması Biyolojik Güvenlik Kabini (BSC) yapılmalıdır. Medya Medya eklenmesi ya da değişen bir BSC içinde yapılmalıdır.
- Uzakta saç Kravat, koruyucu bir kap varsa giymek ve bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek.
- Yığılmayı ücretsiz tüm çalışma yüzeyleri tutun. Operasyonlar arasında% 70 etanol ile çalışma yüzeyler temiz ve en az 15 dakika işleme farklı kültürler arasında izin.
- Alındığı tarih ve tarih hazırlanan dahil tüm medya reaktifler ve şişe etiketleyin.
- Kültür ve medya için düzenli brüt bakteriyel veya fungal kontaminasyon kanıtı inceleyin.
- Mycoplasma için düzenli olarak test edin (gerekirse)
- 37 ° C hücreleri ortam değiştirmeden önce kültür ortamı Isınma.
- Antibiyotikler / antimikotikleri ve FBS taze orta eklenmelidir.
- Orta, en azından her 3-4 gün değiştirin. Hücreleri uzun bir süre oda sıcaklığında oturup izin vermeyin. Ortam ve derhal inkübatör dönmek.
Temsilcisi Sonuçlar:
Kültür özellikleri ve insan bronşiyal epitel hücreleri morfolojisi
Önce kültür kültür için kullanılan bronş segmentleri, fırçalanmış insan bronşiyal epitel hücreleri, Mikroskopi siliyalı ve non-siliyalı hem epitel hücreleri normal bir epitel (Şekil 1, Ek 1) gösteren şeritler gösterdi. Tüm hücreleri epitel özel cytokeratins (Şekil 3) için pozitif olduğunu ortaya lamelleri numaralı seribaşı eksplantlar ve hücreler hücreleri sitospin preparatları immün. Eksplant kültürlerin bulaştı bronşiyal doku eksplantlar Başarılı kültürleri, üzerinden 8 9 dokuların meydana. Epitel hücrelerinin halkaları 3-4 hafta içinde 1-2 cm yarıçapı (Şekil 2a) ulaştı. Başarılı eksplantlar 6 kata kadar tekrar kültüre edildi. Başarılı tüm kültürlerde, hücre göçü nakli (Şekil 2b) başlayarak 48 saat içinde kanıt yoktu. Hücreler, Şekil 2, 4, 5 ve 6 da gösterildiği gibi bu epitel hücreleri için farklı bir arnavut kaldırımlı bir görünüm vardı . Alt kültür bronşiyal hücreler sitokeratin ve E-cadherin düzgün pozitif immün gösterdi. Mesenc diğer hücre türlerine karşı özgül antikorlar ile immün, fibroblastlar tarafından kültürlerin kontaminasyon herhangi bir gösterge vermedihymal, ya da endotel hücreleri (α-SMA, vimentin ve CD31: PECAM-1 lekeleri sırasıyla) (Şekil 5) . Hücreler Şekil 6'da gösterildiği gibi tüycüklü epiteline ayrılabilir Hava-Sıvı Arayüz geçirgen polyester membranlar (transwells) kültür. Transwells yetişen bronşiyal epitel hücreleri Temsilcisi video kayıtları kirpikler (Ek 2) yenerek bir farklılaşmış epitel göstermektedir.
Test insan bronşiyal epitel hücre kültürleri özellikleri Tablo 1'de gösterilmiştir. Ilk geçişini (P1) medyan süre 4 hafta oldu ve ortalama verim 15.1 ± 2,75 milyon hücre (n = 9 dokular). Eksplantlar ve P1 hücrelerinin canlılığı tripan mavisi dışlama tarafından değerlendirilir ve bu bronşiyal kültürleri sürekli olarak yüksek (% 99) idi. Sub-kültürlü eksplant kültürlerden gelen her doku hücreleri daha sonra kullanmak üzere ilk geçiş sonra toplandı. Eksplantlar kurtarıldı ortalama hücre sayısı (6.75 ± 2.4 milyon hücreleri, n = 5 dokular her 2 milyon hücre P1 P2 vermiştir) sonraki Passage kültürü daha anlamlı derecede daha yüksekti. Tek P2 kültür morfolojisi epitel hücreleri (Şekil 7a) tipik olarak atılmıştır. Benzer şekilde, farklı dokuların (Şekil 7b) diğer iki pasajlar (P2 ve P3) atıldı.
Şekil 1 İnsan bronşiyal doku segment ve siliyalı ve non-siliyalı hücrelerinin taze izole epitel şerit. (A) insan bronşiyal doku bölümleri Temsilcisi resim - ~ 1-2cm uzun ve <1cm çapında insan bronşiyal epitel hücreleri primer kültürleri için kullanılır. (B) bronşiyal segment fırçalanmış insan bronşiyal epitel hücreleri bir şerit siliyalı ve non-siliyalı hem epitel hücreleri, büyütme uyumlu 320X göstermektedir. Video kirpikler yenerek hücre Ek 1 olarak verilmiştir.
Şekil 100mm doku kültürü plakaları eksplantlar yetişen 2 İnsan bronşiyal epitel Hücreleri. a) 2-3mm3 doku ile 100mm plakası. 3-4 hafta sonra çıplak gözle görünür hale gelir yaklaşık 1-2cm hücreleri halka unutmayın. b) eksplant, bar = 100μm göç eksplant doku ve epitel hücreleri kenarına Resim. Eksplantlarındaki yeni bir plaka haline nakli aktarılır. Eksplantlarındaki 6 kata kadar transplante edilebilir.
Şekil 3 Hücreler epitel özel cytokeratins için lekeli eksplantlar büyüdü. Eksplantlar gelen hücreler, insan cytokeratins 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, ve 19 tanıyan monoklonal anti-pan sitokeratin-FITC (karışım) Cytospins cytokeratins (yeşil) boyandı. Çekirdekler (mavi) leke Hoechst ile boyandı. Birleştirilen görüntünün eksplantlar büyüdü bronşiyal hücreler esas epitel hücreleri, Bar = 20μm olduğunu göstermektedir.
Şekil 4 Alt-kültür, insan bronşiyal epitel hücrelerinin . tripsin / EDTA), eksplantlarında ve nakli hücreleri, 100mm plakalar kaldırılmış sayılır ve T75 şişesi başına 2-3 milyon hücre numaralı seribaşı vardır. Hücreler T75 şişeler 28-30 gün içinde alt izdiham (% 80-90) (b, c) büyür. Epitel hücrelerinin tipik arnavut kaldırımlı morfolojisi, Bar = 100μm unutmayın.
Şekil 5 Sub-Kültür bronşiyal hücreler, epitel kullanarak immün olarak doğrulandı . Bu hücreler sitokeratin-FITC (a, b), sitokeratin-FITC için bir pozitif kontrol A549 epitel hücreleri (c) ve bir negatif kontrol fibroblastlar gösterilmiştir (d) de gösterilmiştir (yeşil) pozitif boyandı. Kültüre Bronşiyal hücreleri E-Cadherin/Alexa Fluor 594 (i, j) (koyu kırmızı) pozitif boyanan ve alfa-SMA-cy3 (e, f), Vimentin / TRITC (m), ne de CD31 (PECAM leke vermedi -1/FITC) (o), düz kas, mezenkimal ya da endotel hücreleri, sırasıyla birincil kültürlü bronşiyal epitel hücreleri hiçbir kirlenme gösteren. E-Cadherin/Alexa Fluor 594 Olumlu (koyu kırmızı) kontrol A549 epitel hücreleri (k) gösterilmiştir. Pozitif kontrol için α-SMA-cy3 (kırmızı), (g, h) fibroblastlar gösterilmiştir. Tavşan anti-fare TRITC (n) ve Eşek anti-keçi FITC (p); Sekonder antikor kontrolleri Alexa Fluor 594 (l) bronşiyal epitel hücrelerinde gösterilmiştir. Bar = 20μm.
Şekil 6 transwells kültüre İnsan bronşiyal epitel hücreleri. Tüycüklü hücreleri 50.000 cel bir ekim yoğunluğu geçirgen polyester membranlar (6.5mm çap) kültürede ortalama ls (a) Bar = 100μm. Sitokeratin-FITC (yeşil) ve DAPI transwells kültür hücreleri immün (mavi), bu hücreler esas epitel hücreleri, Bar = 20μm olduğunu göstermektedir. Hücreler kirpikler (b), büyütme 160x gösterildiği gibi yetiştirilen kadar ALI oluşturmak için daha sonra 4-6 hafta boyunca sadece başka bir alttan beslenen medya, 10 gün boyunca medyada batık kültür. Silya dayak videoları için 2 Ek bakın. (C) TEM görüntüleri, büyütme = 150000x 6 hafta ALİ kültürlerin kirpikler büyüme göstermektedir.
Şekil 7 morfolojisine göre atılmalıdır hücrelerinin Örnek. Bu hücreler genellikle doku birçok kez transplante edildiğinde görünür. Hem hücre ve transplant atılmalıdır unutmayın. a) Hücreler, 6 kez kültürlü ve T75 şişesi kaplama nakli ile bir tabak toplanmıştır. 1 hafta içinde hücreler, epitel hücrelerinin arnavut kaldırımlı görünümünü temsil etmediği ayrı bir morfolojisi gösterdi. Bunun yerine, ince uzamış hücreler yoğun büyüyen edildi. b) tipik epitel hücreleri ile birleştirilemez olmamalıdır hücrelerinin daha fazla örnekler, ancak atılmalıdır. Bar = 100μm.
Tablo 1: insan bronşiyal epitel hücre kültürleri Özellikleri
| Başarı oranı (# dokuların) | 8 / 9 (% 88.8) |
| P1 medyan süre (aralık) (hafta) | 4 (3-5) |
| Hücre yok demek (SEM). P1 | 15.1 (2.75) x 10 6 |
| Ortalama (SEM) P1 canlılığı | % 99 (% 2) |
| (P1 = ilk geçişi) | |
Ek 1 nakli için kullanılan bir insan bronşiyal segment fırçalanmış siliyalı ve non-siliyalı bronşiyal epitel hücreleri bir şerit gösterir, büyütme uyumlu 320X. Ek 1 Video için tıklayın .
Bir hava-sıvı arayüzü üzerinde yetişen 2 Farklılaştırılmış bronşiyal epitel hücreleri tamamlayın. Videolar (2a ve 2b) sırasıyla kirpikler, büyütme 160x ve uyumlu 320X yenerek göstermektedir. Ek 2A Video için tıklayın . Burada Ek 2B Video için tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, kültür ve primer insan bronş epitel hücreleri genişlemesi için ayrıntılı yöntemler sundu. Biz eksplantlar ve epitel hücre büyümesini teşvik medya kültürü bronşiyal doku, nakli, insan hava yolu epitel hücreleri olmayan diferansiye (batık) ve farklı (hava-sıvı arayüzü üzerinde yetişen) hücre modelleri çalışmaları için sürekli bir kaynak sağlamak nasıl gösterdi . Bu hücreler, kendi gerçek fizyolojik ortamlarda hücreler daha yakından benzediği uyuşturucu testi sistemlerinde kullanılabilir. Eksplantlar / nakli büyür ve arnavut kaldırımlı morfolojisi onaylamak hücreleri izlemek çok önemlidir. Hücrelerin farklı bir morfoloji gösteren, hücre ve eksplantlar / nakli atmak ve sadece başarılı dokuların nakli devam etmektedir. Elimizde ALİ kültürleri, daha önce 2 rapor daha kurulacak uzun sürdü . ALI her gün değişen medya hızlı epitelyal hücre farklılaşması ve kirpikler büyüme teşvik olabilir mümkündür.
Biz burada açıklanan yöntemleri eksplantlar insan bronşiyal epitel hücreleri kültürüne teşvik edecek ve bu hücrelerin çalışma sistemlerini kullanmayı umuyoruz. Sonuçta, insan hücre tabanlı çalışmalar, insan akciğer hastalığı mekanizmalarının önemli yolun belirlenmesi için ve gelişimi için gerekli olan hücre tabanlı erken değerlendirilmesi ve yeni ilaçların daha iyi başarı oranları önde gelen insan hücreleri için in vitro toksisitesi ve etkinliği taraması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarların bronşiyal dokular sağlamak için Dr. Richard Inculet müteşekkiriz. Joseph Sağlık Hamilton ve The University of Western Ontario / Londra Sağlık Bilimleri Merkezi (Dr David McCormack), Doku ve Arşivler Komitesi, Patoloji Anabilim Dalı Araştırma Etik Kurul onayı alındı. Ayrıca bazı immün için gerekli malzemelerin sağlanması için ALI kültürlerin dardı ve Daniela Farkas sağlamak için Ernie Spitzer (Elektron Mikroskop, McMaster Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma, Ontario Toraks Derneği Blok vadeli hibe ile finanse edilmiştir; Dr. Esma Yaghi FSORC burs, St Joseph Sağlık, Hamilton, Ontario, Kanada tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
|||
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
