Summary
우리가 공기 - 액체 인터페이스에서 차별화된 성장을 포함한 인간 기관지기도 조직의 explants에서 기본 인간 기관지 상피 세포의 성장에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 이 방법은 인간의 폐 건강과 질병의기도 상피의 역할을 조사하는 주요 세포의 풍부한 소스를 제공합니다.
Abstract
인간 기관지 상피 세포는 질병의 세포 모델에 필요한이며 기능과 인간의 상피 세포의 구조에 excipients 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사합니다. 여기 자세히 폐 수술 (예 : 폐암이나 폐 볼륨 감소 수술)의 시대에서 외과 의사에 의해 수확이다 기관지기도 조직의 기관지 상피 세포를 성장하는 방법을 설명합니다. 윤리 승인 및 통지 동의, 외과 병리에 필요한 무엇 소요되며 병에 걸린 지역에서 원격 기관지 부분으로 우리를 제공합니다. 조직은 다음 문화의 주요 기관지 상피 세포를 성장 사용할 수 explants의 소스로 사용됩니다. 0.5 - 1cm 길이 직경 ≤ 1cm에 대한 기관지 구간은 추위 EBSS 및 초과 parenchymal 조직 제거와 씻어서 있습니다. 세그먼트는 개방 절단 2~3mm에 다진 아르
Protocol
인간 기관지 구간 기본 기관지 상피 세포의 풍부한 소스를 제공합니다. 이 문서에서 우리는 성장과 갓 고립된 인간 기관지 세그먼트의 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 확장을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다섯 섹션으로 구성되어 있습니다 :
- 코팅 및 100mm 문화 번호판을 긁는
- 기관지 조직 Explants 준비
- 기관지 조직 이식
- HBE 셀의 통과
- Transwells에 성장 솜털이있는 HBE 셀
당신은 모든 단계가 별도로 명시되지 않는 한 생물 안전 캐비닛 (BSC)에 완료됩니다을 시작하기 전에. 이 절차에 필요한 모든 자료를 가지고 있는지 확인하십시오. 재료, 시약 및 준비 섹션을 읽고 무균 (생물 안전 캐비넷 또는 BSC에서 IE)는 다음을 준비했는지 확인하십시오 :
코팅 주식 솔루션 : fibronectin (10 μg / ML), 얼의 균형 소금 용액에 BSA (10 μg / ML)과 콜라겐 (30 μg / ML) (EBSS, 멸균).
문화 매체 : 항생제 - antimycotic 첨가제 (1 %)와 FBS와 DMEM / 햄 F - 12 (1 %)
분리 솔루션 : 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 주식 솔루션과 FBS와 DMEM/F-12 (10 %)
1. 코팅 및 100mm 문화 번호판을 긁는 : Explants가 100mm 문화 접시에 도금 것입니다. 코팅 솔루션 코팅 100mm 문화 접시에 의해 시작합니다. 이것은 모든 불임 유지, BSC에 완료해야합니다.
- BSC의 멸균 100mm 문화 접시와 코팅 솔루션 (콜라겐 / fibronectin / BSA)을 놓으십시오.
- 100mm 판에 코팅의 피펫 2.0 ML는 솔루션입니다.
- 코팅 접시의 기반을 주위에 소용돌이. 코팅 솔루션은 균일하게 접시의 바닥을 커버 있는지 확인하십시오.
- 남은 용액을 피펫와 코트 두 번째 100mm 판을 그것을 사용합니다. 많은 접시가 필요한 동안 반복합니다. 필요한 접시의 수는 조직 explants의 개수에 따라 다릅니다.
- 코팅 솔루션이 균일으로 보여주 접시의 기지를 다루고 있는지 확인하십시오.
- 자신의 커버로 번호판을 커버. 접시 1-2 시간 동안 인큐베이터에서 건조하고 기관지 조직 explants 사용하기 전에 여분의 솔루션을 대기음 수 있습니다. 사용하지 않는 코팅 문화 플레이트가 멸균 봉투에 삽입할 수, 봉인 및 4에 저장된 ° C 나중에 사용하기 위해 (냉장고에서 한달까지 저장할 수 있습니다.) 사용하기 전에 실온에 가져와.
- 스프레이는 70 % 에탄올로 작은 날카로운 메스 가위, 그리고 집게를 청소하고 BSC에 가져와. 깊은 작은 X s을 (최소한 4) 형태로 메스로 단단히 눌러 코팅 접시를 스크래치. 스크래치 충분히 깊게하지 않으면 조직 조각 산등성이에 정착되지 않고 떠 것입니다.
2. 기관지 조직 Explants 준비
수술 후 24-36시간 이내에 얻은 기관지 조직을 사용합니다. 사용을위한 준비까지 EBSS 얼음 속에서 조직을 유지.
- BSC 외부 : 페트리 접시에 넣어 조직. EBSS에서 철저하게 고립된 인간 기관지 조직 표본 린스.
- 초과 주변 조직을 해부하다.
- 기관지 조각을 잘라 냈어.
- 감기 DMEM/HamF12와 살균 100mm 조직 배양 플레이트에 BSC 및 전송에 조직을 가지고 + 1% antimycotic / 항생제.
- 2~3밀리미터 3 조각으로 조직을 잘라 작은 날카로운 가위를 사용합니다.
- 포셉 및 언론 부드럽게 각 X의 중심에 상처 조직 플레이스 한 조각.
- 조직 조각 (explants)가 몇 초 동안 판을 준수하자, 그리고 부드럽게 완성 미디어 10ml (DMEM/HamF12 + 첨가제 1퍼센트 antimycotic / 항생제 + 1% FBS)을 추가합니다. 조직 미디어를 삽입한 후 수레 경우, 산등성이 충분히 깊은하지 않는 경우 그것은 새로운 X S를 만들기 위해 필요한 수있는 X의 산등성이에 조직을 추진하거나 새 X를 만들기 위해 집게를 사용합니다.
- 보육과 변화 미디어 플레이스 판 매 3-4일.
- 조직은 충분한 상피 세포가 1-2cm 영역을 커버하기 위해 조직 explants 주위에 어른이되면 이식 준비가 된 것입니다. 이것은 약 4 주가 소요.
3. 기관지 조직 이식
- 100mm 코팅 및 흠집 접시를 사용합니다. 일부 조직 explants 성공하지 않을 수도 있기 때문에, 접시의 숫자는 이식 얼마나 많은 조각의 조직에 따라 다릅니다. 당신은 이전에 4 코팅 및 저장되었습니다 ° C를 접시를 사용하는 경우 사용하기 전에 실온에 가져와.
- 포셉를 사용하면, 조심스럽게 새 접시에 X의 중앙에 원본 판과 장소에서 조직을 픽업하고, 부드럽게 누르십시오. 없음 파생물과 조직은 폐기되어야합니다.
- 미디어를 추가하고 같은 설명 귀 품어, 조직 몇 초 동안 판을 준수합시다explants (2.7-2.9)에 대한 lier.
4. 인간 기관지 상피 (HBE) 세포의 통로
- 각 100mm 조직 배양 플레이트에 대한 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 재고 솔루션 2ml를 녹여. 무균 0.01M PBS의 6ml로 주식을 희석 (예 : 6 ML PBS (트립신의 최종 농도 2 ML 주식 솔루션을 추가 250 μg / ML이며 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 대한) 100 μg / ML입니다.
- 새 접시에 explants 이동 후, 세포의 1-2cm 반지와 함께 접시에서 미디어를 대기음.
- 3-15분에 대한 보육 각 100mm 판과 장소 (37 ° C)로 예열 희석 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 8ml를 추가합니다. 너무 오래 세포를 손상시킬 수에 트립신을 떠나 자주 확인하십시오.
- 세포의 대부분이 해제되어 있는지이 될 수있는 현미경으로 접시를 확인합니다. 세포가 둥근하고 그림과 같이 분리합니다.
- 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 inactivate하는 플레이트 당 미디어 예열 10% FBS의 8ml를 추가합니다.
- 한 튜브 (또는 별도의 튜브에 다른 조직하는 경우)에 모든 접시의 볼륨을 결합합니다. hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 5 분 100g에 원심 분리기. 세포 펠렛은 튜브의 바닥에 형성됩니다.
- 원하는 세포 농도로 다시 중단 세포 전체 미디어 펠릿 (DMEM / 햄 F12 + 모든 첨가제 + 1% 항생제 - antimycotic + 1퍼센트 FBS).
- T75 플라스크마다 각 2-3000000 세포를 장소와 필요한 완전한 미디어를 추가할 수 있습니다. 품어 모든 3~4주 미디어를 변경합니다. 세포는 약 4 주 동안 T75 flasks의 하위 합류 (80-90%)로 성장합니다. 세포는 해제 및 확장 또는 노화를 방지하기 위해 하위 합류에서 사용해야합니다.
5. Transwells에 솜털이있는 인간 기관지 상피 (HBE) 세포를 성장.
조직 explants / 이식에서 자란 차 상피 세포는 세 번까지 확대하고 사용할 수 있습니다. cm 2 50,000 100,000 세포의 시딩 밀도가 1,2를 권장합니다. 높은 밀도는 빠르고 차별을 촉진합니다.
참고 : 세포 현탁액을 준비하고 숫자를 측정합니다. 2ml 당 백만 세포에서 배지에 다시 일시 중지합니다.
- 사용하기 전에 매체 (DMEM / 햄 F12)와 세포 배양 삽입을 미리는 잠복기로 transwells의 투과 세포막을 준비와 함께 시작합니다. 이 단계는 이러한 민감한 세포로 필요하고 셀 첨부 파일을 도움이 될 것입니다.
- 24 잘 다중 잘 접시에 맞는 6.5 mm 삽입을 사용합니다.
- 막 양쪽 (6.5 mm 삽입 위에 0.1ml, 0.6ml 하단에 사용하기 위해)로 매체를 추가합니다. 세포 문화 인큐베이터에서 1 시간 품어.
- 조심스럽게 먼저 기초 볼륨 시작 막 양쪽에서 (기음) 매체를 제거합니다.
조심스럽게 의미 : 멤브레인 쉽게 손상될 수 있으므로, 문화 삽입의 측면 아래 매체를 피펫, 권장 볼륨을 사용합니다. 이렇게하지 않으면 다른 우물 미디어 이상의 누수가 발생합니다.
- 투과 지원 사전 부화 후 시드 세포
- 조심스럽게 피펫 막의 혀끝의 측면에 세포 현탁액 : 6.5mm 우물은 막의 혀끝의 측면에 세포 현탁액의 0.1 ML (예 : 50,000 셀)을 추가하십시오.
- 멤브레인의 기저 측면에 피펫 0.6ml 매체.
- 잘 차별화된 문화를 확립하기 위해 10 일간 꼭대기의 양쪽과 기저로부터 세포를 공급 : 교환 매체를 증명 방법을 사용하여 일주일에 두 번 :
- 첫째 기초 볼륨을 제거합니다
- 혀끝의 볼륨 (0.1ml 매체를) 교체
- 멤브레인의 기저 측면 매체의 0.6 ML를 추가합니다.
이 방법은 막에 세포 부착을 촉진하고 오랜 기간 (교환 매체 신속하고 인큐베이터에 다시 넣어)를 공기에 노출되는 세포를 방지할 수 있습니다. - 다음 멤브레인의 기저 측면에 매체의 0.6 ML 교체, 혀끝의 매체를 제거하여 10 일째에 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)를 만듭니다.
- 육주에 대한 ALI의 세포를 유지, 일주일에 두 번씩 미디어를 변경합니다. 속눈썹이있는 세포는 ALI 창조 후 4 주 게재가 시작됩니다. 세포는 6 주 ALI 창조 이후에 솜털이있는 세포에 균일 차별을 달성할 것입니다.
재료 준비 :
1. 코팅 주식 솔루션의 작성 (BSC에서이 작업을 수행) :
기본 인간 기관지 상피 세포는 fibronectin / BSA / 콜라겐 3 코팅된 표면에서 잘 자랍니다. 코팅 주식 솔루션은 explant하고 위에서 설명한 것처럼 이식 문화 100mm 조직 문화 플레이트에 사용됩니다. 또한 코팅 솔루션 셀 첨부 파일을 속도를 외투 coverslips하는 데 사용할 수있는, coverslips은 다음 실험을 immunostaining 활용하실 수 있습니다.
- Fibronectin (1mg/ml 주식 솔루션) : 시그마에서 사용 F2006 - 2mg. 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 0.2 μm의 주사기 필터와 필터 살균 얼의 밸런스드 소금 솔루션 (EBSS, 시그마 28,888)의 2mls에 2mg을 디졸브. 스토어 나중에 사용하기 위해 -20 ° C의 냉동고에 1ml하고 코팅 솔루션의 100 MLS 준비 1 ML을 사용합니다.
- BSA (1mg/ml 주식 솔루션) 사용 시그마 A4919 - 1g. 20 MG BSA를 저울질하고 BSC에서 0.2 μm의 주사기 필터와 필터 20 MLS 살균 EBSS에 디졸브. 1ml 튜브 필요한 때까지 -20 ° C의 냉장고에 저장으로 나누어지는. 코팅 솔루션의 100mls를 만들기 위해 주식 1ml를 사용하십시오.
- . 콜라겐 주식 솔루션 (0.1 % 또는 시그마 C8919에서 1mg/ml로 제공) 참고 : 냉장고로 돌아오기 전에 꽉 BSC 날인에서만 엽니다. 코팅 용액의 100 ML를 만들기 위해 주식 3 ML을 사용합니다.
- 코팅 주식 솔루션 : BSC의 : 1ml Fibronectin (1mg/ml)와 1ml BSA (1mg/ml), 플러스 95 MLS EBSS (살균)을 (1mg/ml) 3mls의 콜라겐을 추가합니다. 필요한 때까지 -20 ° C의 냉동고 2 ML 튜브 및 저장소로 잘하고 나누어지는 섞는다. 코팅 주식 솔루션에 최종 농도 : fibronectin (10 μg / ML), BSA (10 μg / ML)과 EBSS의 콜라겐 (30 μg / ML).
2. 문화 매체 (BSC에서 준비)의 준비 : 중간 아래에 표시된 다른 첨가제와 소 뇌하수체 추출 (15 μg / ML)와 표피 성장 인자 (10 NG / ML)과 시그마에서 DMEM / 햄 F - 12로 구성되어 있습니다. antimycotic / 항생제 (1 %)와 FBS (1 %) 갓 문화 매체가 변경될 때마다 추가됩니다. 이 매체는기도 상피 세포의 문화 3-9에 설명된 여러 방법을 검토하여 컴파일되었습니다. 우리의 매체는 인간 기관지 상피 세포의 최적 성장을위한 것입니다.
- 보빈 뇌하수체 추출 (BPE 1mg/ml 주식 솔루션) : 시그마 P1476 (14mg/ml 살균 및 필터링 솔루션에서 2.5 ML BPE) : 1mg/ml의 최종 농도 주식 희석 2.5 MLS (14mg/ml). 즉 1mg/ml의 주식 살균 EBSS의 32.5 ML 2.5 ML의 BPE 주식을 추가합니다. 7.5 ML의 aliquots (7.5 ML의 aliquots 4 튜브 5 ML의 나누어지는 중 하나 튜브)로 나눕니다. 희석 후, -20 ° C에서 저장 aliquots이 필요까지. 장기 재구성 제품의 저장 및 동결 융해 반복은 권장되지 않습니다.
- 표피 성장 인자 (EGF 10 μg / ML 재고 솔루션) : 시그마 E9644 - 0.2mg. Reconstitute 0.1 %를 포함하는 20 0.2 mm의 MS 필터링된 10 MM 초산의 내용 (0.2mg) BSA (예 : 10 MM 초산 20 ML 20 MG BSA를 해산하고 reconstitute의 EGF를 사용 후 필터). 0.5 ML aliquots 및 -20의 냉장고에 저장으로 나누어지는. 100 ML 미디어 100μl를 사용합니다.
- 에피네프린 (5mg/ml 주식 솔루션) : 시그마 E1635. 1M 필터링 염산 (HCL), 50 μl 튜브 및 냉동 (-20 ° C)로 나누어지는의 2ml에 10mg을 디졸브.
- 인슐린 (2mg/ml 주식 솔루션) : 시그마 I6634 50mg. 25ml 필터링 (0.2μm 필터) 희석 HCL (1mM)에 50mg을 디졸브. 1.25ml 유리병으로 나누어지는.
- Tranferrin 인간 (50 MG / ML 주식 솔루션) : 시그마 T8158 100mg. (0.2 μm의 필터와 필터) 2ml DH20에 100mg을 디졸브. 100μl 각 (0.5ml 튜브)로 나누어지는.
- Triiodo - L - thyronine (1mg/ml 주식 솔루션) : 시그마 T6397 100mg. HCL을 필터링 100ml 1M에 100mg을 디졸브. 1ml aliquots로 나누어지는. 10μl aliquots로 나누어지는의 0.5ml.
- Hydorcortisone (5mg/ml 주식 솔루션). 시그마 H0888은 100mg을 올리고 돛을 5mg/ml 주식 20ml 필터링 에탄올에 용해. 1ml 유리병으로 나누어지는. 1ml (5mg/ml) 50μl aliquots (0.5ml 튜브)로 나눕니다.
- Retinoic의 산성 (사용할 때 0.01mg/ml로 희석 1mg/ml 주식 솔루션) : 시그마 R2625 100mg). 에탄올의 10ml에 100mg을 디졸브. 1.0ml aliquots을 나누십시오. 나누기 (1ml) 유리병 20μl 각 50 튜브 수 있습니다. -20 ° C.에 프리즈 한 20μl 병을 가지고 필요할 때 0.01mg/ml의 주식 매체와 2000μl로 희석.
- 소 혈청, 살균 - 여과, 세포 배양에서 알부민 솔루션을 테스트 : 시그마 A8412 있습니다. 추위에 저장 솔루션 (4 ° C) 필요까지. BSC에서만 엽니다.
- 항생제 - Antimycotic, 시그마 A5955 : -20 ° C까지 필요에 1ml 볼륨을 나누어지는 및 냉동. 매체 1% 최종 농도로 사용합니다.
- FBS, 시그마 F1015은 50에서 FBS를 Inactivate ° C를 30 분. BSC 시원하고 수 있습니다. 1ml 10 ML 멸균 유리병으로 나누어지는. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 무력화 문화 매체 1퍼센트 최종 농도에서, 미디어에서 10 % 최종 농도로 사용합니다.
- 문화 매체의 헌법 :
에매체 DMEM/HamF12 사용 500 ML :- 15μg/ml의 최종 농도에 대한 BPE 1 튜브 (1mg/ml의 각 7.5ml).
- 10ng/ml의 최종 농도에 대한 EGF (10μg/ml의 0.5ml) 1 관.
- 0.5μg/ml의 최종 농도에 대한 에피네프린 1 튜브 (5mg/ml의 50μl).
- 5μg/ml의 최종 농도에 대한 인슐린의 1 병을 (2mg/ml의 1.25ml).
- 10μg/ml의 최종 농도에 대한 Transferin (50mg/ml의 100μl) 1 유리병.
- 10ng/ml의 최종 농도에 대한 Triiodo - L - thyronine 5 μl (1mg/ml에서).
- 0.5μg/ml의 최종 농도에 대한 하이드로코티손 1 병을 (5mg/ml의 50μl).
- Retinoic 산성 5 μl가 0.1ng/ml의 최종 농도에 대한 0.01mg/ml로 희석.
- 1.5μg/ml의 최종 농도에 대한 소 혈청 10 μl 알부민 용액
3. 분리 솔루션의 준비 :
- 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 재고 솔루션의 준비 : 500 ML 0.01M PBS (시그마 E6758)에 100mg 트립신 (시그마 T9935 - 100mg)과 40mg EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (시그마 E6758)를 해산. . 2ml 튜브 및 -20 ° C의 냉장고에 저장으로 나누어지는 재고 솔루션을 희석 : 6 ML PBS (트립신의 최종 농도 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 250 μg / ML 및 100 μg / ML입니다) 2 ML 주식 솔루션을 추가합니다.
- 효소 반응을 정지에 대한 해결 방법 : BSC 미디어에서 10 % FBS를 신선한 준비 : 9 ML 미디어 (DMEM / 햄 F - 12) 1 ML FBS를 추가합니다. 각 100mm 접시 분리 솔루션 8 ML를 무력화하기 위해 따뜻하게 10% FBS 8 ML을 사용합니다.
4. 특별 요구 사항 :
- 언제 culturing 상피 세포, 당신은 모든 깨끗하고 소독 보관해야합니다. 세포 배양에 사용되는 모든 시약은 멸균 또는 0.2μm 필터를 필터링해야합니다. 재료와 첨가제의 준비는 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행되어야합니다. 미디어의 미디어뿐만 아니라 또는 변화는 BSC에서 수행되어야합니다.
- 멀리 머리를 묶어, 일회용 모자 가능한 경우를 착용하고, 실험실 외투와 장갑을 착용하십시오.
- 혼란에서 무료 모든 작업 표면을 유지. 작업 사이에 70 % 에탄올로 작업 표면을 청소하고 다른 문화를 처리하는 사이에 15 분 최소 수 있습니다.
- 날짜 접수 및 날짜 준비를 포함, 미디어의 모든 시약과 병을 라벨.
- 총 박테리아 또는 곰팡이 오염의 증거에 대해 정기적으로 문화와 미디어를 검사합니다.
- (필요한 경우) mycoplasma에 대해 정기적으로 테스트
- ° C 세포에서 미디어를 변경하기 전에 37 문화 매체를 따뜻하게.
- 항생제 / antimycotics와 FBS는 신선한 매체에 추가되어야합니다.
- 중간 적어도 3-4일를 변경합니다. 세포가 오랜 시간 동안 실온에서 앉히지 마십시오. 미디어를 변경하고 신속히 인큐베이터로 돌아갑니다.
대표 결과 :
문화의 특징과 인간 기관지 상피 세포의 형태
이전 culturing하는 문화에 사용되는 기관지 세그먼트에서 브러쉬 인간 기관지 상피 세포의 현미경은 정상 상피 (그림 1, 보충 1) 표시 솜털이있는가 아닌 솜털이있는 모두 상피 세포의 스트립을 보여주었다. 모든 세포가 상피 특정 cytokeratins (그림 3)에 대한 긍정적인 것을 밝혀 coverslips에 씨앗 explants과 세포에서 세포의 cytospin 준비의 Immunostaining. explant 문화 중 하나가 감염으로 기관지 조직의 explants에서 성공적인 문화는 9 티슈 8 밖에서 발생했습니다. 상피 세포의 반지 3-4 주 내에 1~2센티미터 반경 (그림 2A)에 도달했습니다. 성공 explants은 6 회까지 다시 교양했다. 모든 성공적인 문화에서 이식 (그림 2B)를 시작하는 48 시간 이내에 세포 이동의 증거가되었다. 세포는 그림 2, 4, 5와 6에 나타난 이러한 상피 세포에 대한 구분됩니다 조약돌 모양을했다. 서브 교양 기관지 세포 cytokeratin과 E - cadherin에 대한 균일한 긍정적인 immunostaining을 보여주었다. 다른 세포 유형에 대한 특정 항체와 Immunostaining 것은 mesenc, 섬유아 세포에 의해 문화의 오염의 표시를 표시하지 않았hymal 또는 내피 세포 (α - SMA, vimentin과 CD31 : PECAM - 1 얼룩 각각) (그림 5). 세포는 그림 6에서 보여주 같은 솜털이있는 상피로 차별화된 공기 - 액체 인터페이스 투과 폴리에스터 점막 (transwells)에 교양. transwells에서 자란 기관지 상피 세포의 대표 비디오 레코딩은 속눈썹 (보충 2) 박동과 차별화된 상피를 보여줍니다.
테스트 인간 기관지 상피 세포 문화의 특징은 표 1에 표시됩니다. 첫번째 통로 (P1)에 평균 시간이 사주었고, 평균 생산량은 15.1되었습니다 ± 2750000 세포 (n은 = 9 티슈). explants로부터 P1에서 세포의 생존은 trypan 파랑 제외에 의해 평가하고, 이러한 기관지 문화에 (99 %) 지속적으로 높은였습니다. 각 조직에서 explant 문화의 하위 교양 전지는 이후 사용을 위해 첫번째 통과 후 풀링했다. explants에서 발견한 의미 휴대폰 번호는 (6.75 ± 2400000 세포를, N = 5 조직 P1에서 모든 2,000,000 세포가 P2를 굴복) 이후 패시지 문화보다 훨씬 높은되었습니다. 형태는 상피 세포 (그림 7A)의 전형이되어 있지 않아 한 P2 문화가 삭제되었습니다. 마찬가지로, 다른 조직 (그림 7B)의 두 개의 다른 구절 (P2와 P3)가 삭제되었습니다.
한 인간 기관지 조직 세그먼트와 솜털이있는가 아닌 솜털이있는 세포의 신선한 절연 상피 스트립 그림. 인간 기관지 조직 세그먼트 (A) 대표 사진 - ~ 1-2센티미터 길이 <1cm 인간 기관지 상피 세포의 주요 문화 직경 - 사용됩니다. (B) 기관지 세그먼트에서 닦았 인간 기관지 상피 세포의 스트립은 솜털이있는 비 - 솜털이있는 상피 세포 모두, 배율 320X를 보여줍니다. 속눈썹을 쳤습과 함께 세포의 비디오는 보충 1로 제공됩니다.
100mm 조직 배양 플레이트에 explants에서 성장이 인간 기관지 상피 세포를 그림. 2 3mm3 휴지로) 100mm 접시. 3-4주 후 육안으로 볼 수집니다 대한 1-2센티미터의 세포 반지를합니다. B) 그들은 explant, 바 = 100μm에서 마이 그 레이션과 같은 explant 조직과 상피 세포의 가장자리에 이미지. Explants는 새 접시가 될 이식으로 전송. Explants는 6 회까지 이식 수 있습니다.
상피 특정 cytokeratins에 대한 스테인드 explants에서 성장 그림 3 셀. explants 세포 Cytospins 인간 cytokeratins 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, 19을 인식 단클론 안티 팬 Cytokeratin - FITC (혼합)로 cytokeratins (녹색)에 물들어 있었다. 핵은 (파란색) 얼룩 Hoechst 물들일되었습니다. 병합된 이미지 explants에서 성장 기관지 세포가 주로 상피 세포, 바 = 20μm 것을 보여줍니다.
그림 4 인간 기관지 상피 세포의 하위 문화. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여)는 explants 및 이식에서 세포는, 100mm 접시에서 채취한 계산 및 T75 플라스크 당 2-3000000 세포에 씨앗을 품고있다. 세포는 28-30 일 이내에 T75 flasks의 하위 합류 (80-90%) (B, C)으로 성장. 상피 세포의 전형적인 조약돌 형태, 바 = 100μm를 적어 둡니다.
그림 5 서브 교양 기관지 상피 세포가 사용하는 immunostaining으로 확인되었습니다. 이러한 세포가 Cytokeratin - FITC (A, B), A549 상피 세포 (C)과 대조군이 섬유아 세포 (D)에서 증명에 표시됩니다 cytokeratin - FITC에 대한 긍정적인 제어를위한 (녹색) 긍정적인 얼룩. 교양 기관지 세포가 E-Cadherin/Alexa 플루어 594 (I, J)를 (어두운 빨강) 긍정적인 스테인드하고, α - SMA - cy3 (E, F), Vimentin / TRITC (M)하거나 CD31 (를 PECAM에 대한 얼룩 않았 -1/FITC)는 (O) 평활근, mesenchymal 또는 내피 세포와 각각의 기본 교양 기관지 상피 세포의 오염을 나타내는 없습니다. E-Cadherin/Alexa 플루어 594에 양성 (진한 빨강) 제어 A549 상피 세포 (K)에 증명됩니다. α - SMA - cy3 (적색)에 대한 긍정적인 제어 (G, H) 섬유아 세포에서 증명됩니다. 토끼 방지 마우스 TRITC (N)과 동키의 안티 - 염소 FITC (P), 차 항체 컨트롤 알렉사 플루어 594 (L)의 기관지 상피 세포에 표시됩니다. 바 = 20μm.
transwells에서 교양 6 인간 기관지 상피 세포를 그림. 속눈썹이있는 세포가 50,000 셀의 시딩 밀도에 투과 폴리에스터 점막 (6.5mm 지름)에 양식 아르잘마다 이거 (A) 바 = 100μm. cytokeratin - FITC (녹색)와 DAPI와 transwells에서 교양 세포의 Immunostaining 것은 (파란색)이 세포가 주로 상피 세포, 바 = 20μm는 것을 보여줍니다. 전지는 솜털이 (B), 배율 160x에서와 같이 표시 재배되기 전까지는 ALI를 만드는 유일한 다른 4~6주 위해 바닥에서 다음 방송 미디어, 10 일 동안 미디어에 빠져들 양식입니다. 속눈썹을 치고 동영상 2을 보완 참조하십시오. (C) TEM 이미지, 배율은 = 150000x 6 주가 알리 문화의 속눈썹 성장을 보여줍니다.
형태에 따라 폐기되어야 세포 중 7 예 그림. 조직이 여러 번 이식되었을 때 이러한 세포는 일반적으로 나타납니다. 모두 세포 이식은 폐기되어야합니다. A) 세포는 6 시간을 교양하고 T75 플라스크에 도금되었다 이식 한 접시에서 수집되었다. 일주 내에서 세포가 상피 세포의 조약돌 모양을 나타내는 않은 독특한 형태를 보여주었다. 대신 얇은 길쭉한 세포 밀도가 증가했다. B) 더 많은 전형적인 상피 세포와 풀링하지 않아야 세포의 사례지만,이 폐기되어야합니다. 바 = 100μm.
표 1 : 인간 기관지 상피 세포 문화의 특징
| (# 조직의) 성공률 | 9분의 8 (88.8 %) |
| P1에 미디언 시간 (범위) (주) | 4 (3-5) |
| (SEM) 세포 없음을 뜻합니다. P1에서 | 15.1 (2.75) × 10 6 |
| P1에서 (SEM) 생존을 의미 | 99% (2 %) |
| (P1 = 첫번째 통로) | |
보충 1 이식에 사용 인간 기관지 세그먼트에서 브러쉬 속눈썹이있는가 아닌 솜털이있는 기관지 상피 세포의 스트립을 보여줍니다, 배율 320X가. 여기를 클릭하십시오 보충 1 비디오하십시오.
공기 - 액체 인터페이스에서 성장이 차별 기관지 상피 세포를 보충. 비디오 (2A와 2B)은 각각 속눈썹, 배율 160X와 320X를 치고 표시합니다. 여기를 클릭하세요 보충의 2A 비디오하십시오. 여기를 클릭 보조 2B 비디오하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 우리는 문화와 기본 인간 기관지 상피 세포의 확장에 대한 자세한 방법을 제시. 우리는 explants과 상피 세포의 성장을 촉진 미디어 교양 기관지 조직,의 이식이 아닌 차별 (잠수)과 차별 (공기 - 액체 인터페이스에서 성장) 세포 모델 연구를위한 인간기도 상피 세포의 지속적인 소스를 제공하는 방법을 시연 . 이러한 전지는보다 밀접하게 그들의 진짜 physiologic 환경에서 세포 유사한되는 약물 테스트 시스템에서 이용하실 수 있습니다. 그것은 당신이 explants / 이식에서 성장과 조약돌 형태를 확인 세포를 감시하는 것이 매우 중요합니다. 세포가 다른 형태를 보여주면, 세포 explants / 이식을 모두 폐기하고, 오직 성공적인 조직을 이식 계속합니다. 우리 손에 알리 문화는 이전에 보고된 것보다이 설립 더 걸렸습니다. ALI에서 매일 미디어를 변경하면 빠른 상피 세포의 분화와 속눈썹의 성장을 촉진 수도 수도 있습니다.
우리는 여기서 설명한 방법은 explants에서 인간 기관지 상피 세포를 문화를 장려하고 학업 시스템에서 이러한 세포를 사용하기 바랍니다. 결국, 인간의 세포 기반 연구는 인간의 폐 질환 메커니즘의 중요한 경로를 결정하고 개발에 필요한 셀 기반의 초기 평가 및 새로운 약물의 더 나은 성공을 속도로 이어지는 인간의 세포에 대한 체외의 독성 및 효능 검사 인치
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Acknowledgments
저자는 기관지 조직을 제공하는 박사 리차드 Inculet 매우 감사하고 있습니다. 연구 윤리위원회 승인은 성 요셉의 건강 해밀턴 및 웨스턴 온타리오 / 런던 건강 과학 센터 (박사 데이비드 매코맥), 조직 및 아카이브위원회, 병리의학과의 대학에서 얻은했다. 또한 immunostaining에 필요한 자료의 일부를 제공하는 우리의 알리 문화의 템즈와 다니엘라의 Farkas를 제공 어니 스핏쳐를 (전자 현미경, 맥매스터 대학교) 감사합니다. 이 작품은 온타리오 흉부 학회에서 차단 기간 부여에 의해 투자되었다; 박사 Asma Yaghi는 FSORC 장학금, 성 요셉의 건강, 해밀턴, 온타리오, 캐나다에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
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References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
