Summary
Här beskriver vi en detaljerad metod för att odla primärt mänskligt bronkial epitelceller från explants mänskliga bronkiell luftvägar vävnad inklusive differentierad tillväxt på en luft-vätska gränssnitt. Denna metod ger en rik källa av galvaniska element för att undersöka den roll som slemhinnan i människans lunga hälsa och sjukdom.
Abstract
Mänskliga bronkial epitelceller behövs för cell modeller av sjukdom och att undersöka effekten av hjälpämnen och farmakologiska agenter på funktion och struktur av mänskliga epitelceller. Här beskriver vi i detalj den metod för växande bronkiell epitelceller från luftrören luftvägarna vävnad som skördas av kirurgen vid tiden för lungkirurgi (t.ex. lungcancer eller lungvolym minskning kirurgi). Med etik godkännande och informerat samtycke, tar kirurgen vad som behövs för patologi och ger oss en bronkial del som är långt från den sjuka områden. Vävnaden används sedan som en källa till explants som kan användas för odling av primära bronkerna epitelceller i kulturen. Bronkial segmenten ca 0,5-1cm lång och ≤ 1 cm i diameter sköljas med kallt EBSS och överflödigt parenkymvävnaden tas bort. Segment skärs öppna och finfördelats 2-3mm
Protocol
Mänskliga Bronkial segment ger en rik källa till primära bronkerna epitelceller. I denna artikel beskriver vi ett protokoll för tillväxt och expansion av mänskliga bronkiell epitelceller (HBE) celler från nyligen isolerade humana bronkerna segment. Detta protokoll består av fem delar:
- Beläggning och sprätta 100mm odlingsplattor
- Förbereda Bronkial Tissue explants
- Bronkiell vävnad Transplantation
- Passage av HBE celler
- Växande cilier HBE Celler på Transwells
Innan du börjar Observera att alla steg sker i den biologiska säkerhetsbänk (BSC) inget annat anges. Se till att du har allt material som behövs för detta förfarande. Läs gärna Material, reagenser och Förberedelser och se till att du har aseptiskt (dvs. i en biologisk säkerhetsbänk eller BSC) beredd på följande:
Beläggning stamlösning: fibronektin (10 mikrogram / ml), BSA (10 mikrogram / ml) och kollagen (30 mikrogram / ml) i Earle s Balanced Salt Solution (EBSS, sterila).
Odlingsmedium: DMEM / Ham F-12 med tillsatser, antibiotika-antimykotika (1%) och FBS (1%)
Dissociation lösningar: Trypsin / EDTA stamlösning och DMEM/F-12 med FBS (10%)
1. Beläggning och sprätta 100mm odlingsplattor: explants kommer att vara klädd i 100mm odlingsplattor. Börja med beläggning 100mm odlingsplattor med beläggning lösning. Detta bör göras i BSC, hålla allt sterilt.
- Placera steril 100mm odlingsplattor och TÄCKLÖSNING (kollagen / fibronektin / BSA) i BSC.
- Pipettera 2,0 ml av beläggning lösning i en 100 mm platta.
- Snurra runt för att bestryka botten av plattan. Se till att beläggningen lösning täcker botten av plattan jämnt.
- Pipettera överblivna lösningen ut och använda den för att belägga en andra 100 mm plåt. Upprepa för så många plattor som behövs. Antalet behövs plattor varierar med antalet av vävnad explants.
- Se till att beläggningen lösning täcker grunderna av plattorna jämnt som demonstreras.
- Täck plattorna med sina omslag. Låt plattorna torka i inkubatorn i 1-2 timmar och aspirera överflödig lösning före användning för bronkiell vävnad explants. Oanvända belagda odlingsplattor kan placeras i en steril påse, förseglat och förvaras vid 4 ° C för senare användning (kan lagras upp till en månad i kylen). Ta till rumstemperatur före användning.
- Spray ren liten vass sax, skalpell och pincett med 70% etanol och sätta i BSC. Scratch plåt genom att trycka hårt med skalpell och bildar djupa små X s (minst 4). Om scratch är inte djupt nog kommer vävnad bitar nöja sig in i åsar och kommer att flyta.
2. Förbereda Bronkial Tissue explants
Använd bronkiell vävnad uppnås inom 24-36 timmar efter operationen. Håll vävnad på is i EBSS tills produkten ska användas.
- Utanför BSC: Placera vävnad i en petriskål. Skölj isolerade mänskliga bronkial vävnadsprover grundligt i EBSS.
- Dissekera ut överflödigt omgivande vävnad.
- Skär öppnar bronkerna bitar.
- Ta vävnad i BSC och överför till en steril 100mm vävnadsodling tallrik med kallt DMEM/HamF12 + 1% antibiotika / antimykotika.
- Använd vassa liten sax att klippa vävnaden i 2-3 mm 3 st.
- Placera en bit skära vävnad i mitten av varje X med pincett och tryck försiktigt.
- Låt vävnaden stycken (explants) följer plåten i några sekunder, och sedan försiktigt lägga 10ml av kompletta medier (DMEM/HamF12 + tillsatser +1% antibiotika / antimykotika + 1% FBS). Om vävnaden flyter efter lägga till media, använda pincett för att trycka på vävnaden i åsarna i X eller göra en ny X. Det kan bli nödvändigt att göra nya X s om åsar är inte djupt nog.
- Placera plattorna i kuvös och förändring media varje 3-4 dagar.
- Vävnader är redo att transplantera när tillräckligt epitelceller har vuxit runt vävnad explants att täcka 1-2cm områden. Det tar ca 4 veckor.
3. Bronkiell vävnad Transplantation
- Använd 100mm belagda och skrapat tallrikar. Eftersom vissa vävnader explants kanske inte lyckas, beror antalet plattor på hur många bitar av vävnad du är transplantation. Om du använder plattor som tidigare varit belagda och förvaras vid 4 ° C, sätta till rumstemperatur före användning.
- Använd pincett försiktigt plocka upp vävnad från den ursprungliga plattan och lägg i mitten av X-S i den nya plattan, och tryck försiktigt. Vävnader utan utväxt ska kasseras.
- Låt vävnad följa plattan i några sekunder, lägg till media och inkubera enligt öragare för explants (2,7-2,9).
4. Passage av mänskliga bronkiell epitelceller (HBE) celler
- Tina 2 ml Trypsin / EDTA stamlösning för varje 100mm vävnadsodling plattan. Späd lager med 6 ml sterilt 0.01M PBS (dvs tillsätt 2 ml lager till 6 ml PBS (slutlig koncentration av trypsin är 250 mikrogram / ml och för EDTA är 100 mikrogram / ml).
- Efter att ha flyttat explants till en ny platta, aspirera media från tallrikar med 1-2cm ringar av celler.
- Lägg 8ml av varm utspädd Trypsin / EDTA-lösning till varje 100mm platta och plats i inkubatorn (37 ° C) i 3-15 minuter. Kontrollera regelbundet och lämnar trypsin på för länge kan skada cellerna.
- Kontrollera plattor under mikroskop för att vara säker på de flesta celler har hävts. Celler kommer runda upp och lossa som visas.
- Lägg 8ml av uppvärmd 10% FBS i media per platta att inaktivera trypsin / EDTA-lösning.
- Kombinera volymer av alla plattor i en tub (eller separata rör vid olika vävnader). Räkna celler med en hemacytometer.
- Centrifugera vid 100 g i 5 minuter. En cellpelleten bildas vid basen av röret.
- Återsuspendera cellpelleten i hela media (DMEM / Ham F12 + alla tillsatser + 1% antibiotika-antimykotika + 1% FBS) till önskad cellkoncentrationen.
- Placera varje 2 till 3.000.000 celler per T75 och tillsätt kompletta medier som krävs. Inkubera och förändring media varje 3-4 veckor. Celler växer till underleverantörer sammanflödet (80-90%) i T75 kolvarna i ca 4 veckor. Cellerna bör lyftas och utvidgas eller användas på sub-sammanflödet att förhindra åldrande.
5. Växande cilier Human Bronkial Epithelial (HBE) celler på Transwells.
Primär epitelceller vuxit från vävnad explants / transplantationer, kan utökas upp till tre gånger, och sedan används. En sådd densitet på 50.000 till 100.000 celler per cm 2 rekommenderas 1,2. Högre densitet främjar snabbare differentiering.
Obs: Bered en suspension av celler och mäta deras antal. Återsuspendera i odlingsmedium vid 1 miljon celler per 2 ml.
- Börja med att förbereda genomsläppliga membran av transwells av pre-inkubera skären cellkultur med medium (DMEM / Ham F12) före användning. Detta steg är nödvändigt med dessa känsliga celler och hjälper cellbindning.
- Använd 6,5 mm skär som passar in i 24 och flera bra plattor.
- Lägg medelhög till båda sidor av membranet (för 6,5 mm skär använd 0,6 ml på botten, 0,1 ml upptill). Inkubera 1 timme i cellkultur kuvös.
- Ta försiktigt bort (aspirera) på medellång från båda sidor av membranet börjar med den basala volymen först.
Försiktigt: den membranet kan lätt skadas, så pipett mediet längs sidan av kulturen in, använd volym rekommenderas. Du inte gör det kommer att resultera i läckande över av media till andra brunnar.
- Seed celler efter före inkubation av genomträngliga Support
- Pipettera försiktigt din cell suspensionen i apikala sidan av membranet: för 6.5mm brunnar lägga 0,1 ml cellsuspension (dvs 50 tusen celler) till den apikala sidan av membranet.
- Pipettera 0,6 ml medium på de basala sidan av membranet.
- Mata celler från apikala och basala sidor för 10 dagar att etablera en väl differentierad kultur: utbyte medelstora två gånger i veckan med den demonstrerade metoden:
- Ta bort basala ljud först
- Byt apikala volym (0,1 ml medium)
- Tillsätt 0,6 ml medium till de basala sidan av membranet.
Metoden främjar cellbindning till membran och hindrar cellerna från att utsättas för luft under långa perioder (utbyte media snabbt och sätta tillbaka i kuvös). - Skapa en Air-flytande gränssnitt (ALI) på dag 10 genom att ta bort apikala medium, sedan ersätta 0,6 ml medium på de basala sidan av membranet.
- Behåll celler i ALI under 6 veckor, byta media två gånger i veckan. Cilierade celler kommer att börja visas fyra veckor efter skapandet av ALI. Cellerna kommer att uppnå en enhetlig differentiering till cilierade celler 6 veckor efter skapandet av ALI.
Material Förberedelser:
1. Beredning av Coating stamlösning (göra detta i BSC):
Primär Mänskliga bronkial epitelceller växer bra på ytor belagda med fibronektin / BSA / kollagen 3. Beläggningen stamlösning används för 100 kultur mm vävnad plattor för Explantation och kulturer transplantation som beskrivits ovan. Även beläggningen lösningen kan användas för att belägga täckglas för att påskynda cellbindning kan täckglasen sedan utnyttjas för immunfärgning experiment.
- Fibronektin (1mg/ml stamlösning): Använd F2006-2mg från Sigma. Lös upp 2 mg i 2mls sterilt Earle s Balanced Salt Solution (EBSS, Sigma 28.888), filter med 0,2 ìm sprutfilter i den biologiska säkerhetsbänk (BSC). Förvara 1ml i -20 ° C frys för senare användning, och använda 1 ml för att förbereda en 100 ml av beläggning lösning.
- BSA (1mg/ml stamlösning): Använd Sigma A4919-1g. Väg 20 mg BSA och lös i 20 MLS sterila EBSS, filter med 0,2 ìm spruta filter i BSC. Fördela i 1ml flaskor och förvara i -20 ° C frys tills det behövs. Använd 1 ml i lager för att göra 100 ml av beläggning lösning.
- . Kollagen stamlösning (tillhandahålls som 0,1% eller 1mg/ml från Sigma C8919) OBS: öppen endast i BSC och täta tight innan han återvände till kylskåp. Använd 3 ml i lager för att göra 100 ml beläggning lösning.
- Beläggning stamlösning: I BSC: Lägg 3mls kollagen (1mg/ml) till 1 ml Fibronectin (1mg/ml) och 1 ml BSA (1mg/ml), plus 95 MLS EBSS (steril). Blanda väl och delprov i 2 ml flaskor och förvara i -20 ° C frys tills det behövs. Final koncentrationer i beläggning stamlösning: fibronektin (10 mikrogram / ml), BSA (10 mikrogram / ml) och kollagen (30 mikrogram / ml) i EBSS.
2. Beredning av odlingssubstrat (förbereda i BSC): Medium består av DMEM / Ham F-12 från Sigma med nötkreatur hypofysen extrakt (15 mikrogram / ml) och epidermal tillväxtfaktor (10 ng / ml) med andra tillsatser som anges nedan. Antibiotika / antimykotika (1%) och FBS (1%) läggs till färska varje gång odlingsmedium ändras. Detta medium har sammanställts genom att granska olika metoder som beskrivs i luftvägarna epitelceller kulturer 3-9. Vår mediet är avsett för optimal tillväxt av mänskliga bronkial epitelceller.
- Bovin hypofysen extrakt (BPE 1mg/ml stamlösning): Sigma P1476 (2,5 ml BPE på 14mg/ml steril och filtrerad lösning): Späd 2,5 ml av lager (14mg/ml) till en slutlig koncentration av 1mg/ml. dvs lägga till 2,5 lager ml BPE till 32,5 ml sterilt EBSS för ett bestånd av 1mg/ml. Dela i 7,5 ml alikvoter (4 rör med 7,5 ml alikvoter och en tub 5 ml alikvot). Efter utspädning, tills butiken alikvoter vid -20 ° C behövs. Långvarig lagring av rekonstituerad produkt och upprepad frysning och upptining rekommenderas inte.
- Epidermal tillväxtfaktor (EGF 10 mikrogram / ml stamlösning): Sigma E9644-0,2 mg. Lös upp innehållet (0,2 mg) i 20 filtreras ms för 0,2 mm 10 mm ättiksyra som innehåller 0,1% BSA (dvs lösa upp 20 mg BSA i 20 ml 10 mM ättiksyra och filtrera sedan använda för att återskapa EGF). Fördela i 0,5 ml alikvoter och förvara i -20 frys. Använd 100μl för 100 ml medier.
- Epinefrin (5mg/ml stamlösning): Sigma E1635. Lös upp 10 mg i 2 ml 1M filtreras saltsyra (HCl), uppmätt till 50 l flaskor och frys (-20 ° C).
- Insulin (2mg/ml stamlösning): Sigma I6634 50 mg. Lös upp 50 mg i 25ml filtrerade (0.2μm filter) utspädd HCl (1 mm). Alikvotera till 1,25 ml injektionsflaskor.
- Tranferrin Människa (50 mg / ml stamlösning): Sigma T8158 100mg. Lös upp 100 mg i 2 ml DH20 (filtrerad med 0,2 ìm filter). Alikvot till 100μl varje (i 0,5 ml flaskor).
- Triiodo-L-thyronine (1mg/ml stamlösning): Sigma T6397 100mg. Lös upp 100 mg i 100 ml 1M filtreras HCl. Fördela i 1 ml alikvoter. Alikvotera 0.5ml i 10μl alikvoter.
- Hydorcortisone (5mg/ml stamlösning):. Sigma H0888 Väg upp 100 mg och lös i 20 ml filtrerat etanol för 5mg/ml lager. Alikvot till 1 ml injektionsflaskor. Dela upp en 1 ml (5mg/ml) till 50μl alikvoter (0,5 ml flaskor).
- Retinoinsyra (1mg/ml stamlösning, spädd till 0.01mg/ml när det används): Sigma R2625 100mg). Lös upp 100 mg i 10 ml etanol. Dela upp till 1,0 ml alikvoter. Dela (1 ml) injektionsflaska med 50 tuber 20μl vardera. Frys vid -20 ° C. Ta en 20μl flaska och späd till 2000μl med media för ett lager 0.01mg/ml när det behövs.
- Albumin lösning från bovint serum, steril-filtrerad, cellodling testade: Sigma A8412. Förvara lösningen i kyla (4 ° C) tills det behövs. Öppet endast i BSC.
- Antibiotika-Antimykotika, Sigma A5955: alikvot till 1ml volymer och frysa vid -20 ° C behövs tills. Använd på 1% slutlig koncentration i medium.
- FBS, Sigma F1015: Inaktivera FBS vid 50 ° C i 30 minuter. Låt svalna i BSC. Fördela i 1ml och 10 ml sterila injektionsflaskor. Använd på 1% slutlig koncentration i odlingsmedium och vid 10% slutlig koncentration i media att neutralisera Trypsin / EDTA-lösning.
- Konstitution av odlingsmedium:
För500 ml medium DMEM/HamF12 användning:- 1 tub BPE (varje 7.5ml av 1mg/ml) för en slutlig koncentration av 15μg/ml.
- 1 tub fonden (0,5 ml 10μg/ml) för en slutlig koncentration av 10ng/ml.
- 1 tub av adrenalin (50μl av 5mg/ml) för en slutlig koncentration av 0.5μg/ml.
- 1 injektionsflaska med insulin (1,25 ml av 2mg/ml) för en slutlig koncentration av 5μg/ml.
- 1 injektionsflaska med Transferin (100μl av 50mg/ml) för en slutlig koncentration av 10μg/ml.
- 5 ìl Triiodo-L-thyronine (vid 1mg/ml) för en slutlig koncentration av 10ng/ml.
- 1 injektionsflaska med hydrokortison (50μl av 5mg/ml) för en slutlig koncentration av 0.5μg/ml.
- 5 ìl av retinoinsyra utspädd till 0.01mg/ml för en slutlig koncentration av 0.1ng/ml.
- 10 l albuminlösning från nötkreatur serum för en slutlig koncentration av 1.5μg/ml
3. Beredning av Dissociation Solutions:
- Förberedelse av Trypsin / EDTA stamlösning: Lös upp 100 mg trypsin (Sigma T9935-100mg) och 40 mg EDTA (Sigma E6758) i 500 ml 0.01M PBS (Sigma E6758). . Alikvotera i 2ml flaskor och förvara i -20 ° C frys Späd lager: tillsätt 2 ml lager till 6 ml PBS (slutlig koncentration av trypsin är 250 mikrogram / ml och för EDTA är 100 mikrogram / ml).
- Lösning för att stoppa enzymatiska reaktioner: Bered en färsk 10% FBS i media i BSC: Tillsätt 1 ml FBS till 9 ml media (DMEM / Ham F-12). För varje 100 mm platta använda 8 ml uppvärmd 10% FBS att neutralisera 8 ml av dissociation lösningen.
4. Speciella krav:
- När odling epitelceller, måste du hålla allt rent och desinficeras. Alla reagenser som används för cellodling skall vara steril eller filtreras med 0.2μm filter. Beredning av material och tillsatser bör göras i en biologisk säkerhetsbänk (BSC). Media tillägg eller byte av media bör ske i ett BSC.
- Tie håret bort, bära en disponibel mössa om det finns tillgängligt, och bära en laboratorierock och handskar.
- Håll alla arbetsytor fria från skräp. Rengör arbetsytor med 70% etanol mellan verksamheten och möjliggöra en minst 15 minuter mellan att hantera olika kulturer.
- Etikett alla reagenser och flaskor av media, bland annat uppgifter som tas emot och datum förberedd.
- Undersök kulturer och medier regelbundet för tecken på grov bakterie-eller svampinfektioner kontamination.
- Testa regelbundet för mykoplasma (vid behov)
- Värm upp odlingsmedium till 37 ° C innan du ändrar media på cellerna.
- Antibiotika / antimykotika och FBS bör färsk tillsättas medium.
- Ändra medelstora minst var 3-4 dagar. Låt inte cellerna i rumstemperatur under en längre tid. Ändra media och snabbt återgå till inkubatorn.
Representativa resultat:
Kultur egenskaper och morfologi av mänskliga bronkiell epitelceller
Mikroskopi av mänskliga bronkiell epitelceller borstade från bronkial segment, som används för kultur, före odling, visade remsor av både cilierade och icke-cilierade epitelceller tyder på en normal epitel (figur 1, tillägg 1). Immunfärgning av cytospin beredningar av celler från explants och celler seedade den visade täckglas att alla celler var positiv för epitel-specifika cytokeratins (Figur 3). Framgångsrika kulturer från explants av bronkial vävnaden hos 8 av 9 vävnader, som en av de Explantation kulturer blev smittade. Ringarna av epitelceller nått 1-2 cm radie på 3-4 veckor (Figur 2a). Framgångsrika explants odlades återigen upp till 6 gånger. I alla framgångsrika kulturer, det fanns bevis för cell migration inom 48 timmar efter start av transplantationer (Figur 2b). Celler hade en kullersten utseende som skiljer dessa epitelceller som visas i figur 2, 4, 5 och 6. Sub-odlade bronkial celler visade enhetlig positiv immunfärgning för Cytokeratin och E-cadherin. Immunfärgning med specifika antikroppar mot andra celltyper visade ingen indikation på förorening av kulturer med fibroblaster, mesenchymal, eller endotelceller (α-SMA vimentin och CD31: PECAM-1 fläckar respektive) (Figur 5). Celler odlade på genomsläppliga polyester membran (transwells) med Air-Liquid Interface differentieras till cilierade epitel som visas i Figur 6. Representant videoinspelningar av bronkial epitelceller odlas på transwells visa en differentierad epitel med att slå flimmerhår (tillägg 2).
Egenskaper hos det mänskliga bronkial epitelceller testade cellkulturer visas i tabell 1. Mediantiden till första passagen (P1) var 4 veckor, och den genomsnittliga avkastningen var 15,1 ± 2750 tusen celler (n = 9 vävnader). Genomförbarheten av celler från explants och på P1 bedömdes med trypan blå utslagning, och var genomgående hög (99%) i dessa bronkerna kulturer. Sub-odlade celler från Explantation kulturer från varje vävnad poolades efter första passagen för senare användning. Medelvärdet mobilnummer återhämtat sig från explants var betydligt högre än de efterföljande Passage kultur (var 2 miljoner celler från P1 gav P2: 6,75 ± 2,4 miljoner celler, n = 5 vävnader). En P2 kulturen förkastades eftersom morfologi är inte typiskt för epitelceller (Figur 7a). Likaså var två andra passager (P2 och P3) i olika vävnader (figur 7b) kasseras.
Figur 1 Human bronkiell vävnad segment och en nyligen isolerade epiteliala remsa av cilierade och icke cilierade celler. (A) representativ bild av mänsklig bronkiell vävnad segment - ~ 1-2cm långt och <1 cm diameter, som används för primär kulturer av mänskliga bronkial epitelceller. (B) En remsa av mänskliga bronkiell epitelceller borstade från bronkial segmentet visar både cilierade och icke cilierade epitelceller, förstoring 320X. Video av celler med att slå flimmerhår finns som Bilaga 1.
Figur 2 Mänskliga bronkial epitelceller vuxit från explants på 100mm plattor vävnadsodling. a) 100mm platta med 2-3mm3 vävnad. Notera ringen av celler på ca 1-2cm som blir synligt för blotta ögat efter 3-4 veckor. b) Bild på kanten av Explantation vävnad och epitelceller när de flyttar från Explantation, bar = 100μm. Explants överföras till en ny tallrik blir transplantationer. Explants kan transplanteras upp till 6 gånger.
Figur 3 celler som odlas från explants färgas för epitel-specifika cytokeratins. Cytospins av celler från explants färgades för cytokeratins (grön) med monoklonala anti-Pan Cytokeratin-FITC (blandning) som erkänner människans cytokeratins 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 och 19. Kärnor färgades med Hoechst bets (blå). Det sammanslagna bilden visar att bronkial celler som odlas från explants var främst epitelceller, Bar = 20 mikroM.
Figur 4 subkultur av mänskliga bronkial epitelceller. a) Använda trypsin / EDTA, är celler från explants och transplantationer lyfts från 100mm plattor, räknas och seedad med 2-3 miljoner celler per T75 kolven. Celler växer till underleverantörer sammanflödet (80-90%) i T75 kolvarna i 28-30 dagar (b, c). Notera den typiska kullersten morfologi av epitelceller, Bar = 100μm.
Figur 5 Sub-Odlade bronkial celler verifieras som epiteliala med immunfärgning. Dessa celler färgade positiva (grön) för Cytokeratin-FITC (a, b) en positiv kontroll för Cytokeratin-FITC visas i A549 epitelceller (c) och en negativ kontroll visats i fibroblaster (d). Odlade Bronkial cellerna färgas positivt (mörk röd) för E-Cadherin/Alexa Fluor 594 (i, j), och inte fläcken för α-SMA-cy3 (e, f), vimentin / TRITC (m) eller CD31 (PECAM -1/FITC) (o) tyder på att ingen kontaminering av den primära odlade bronkial epitelceller med glatt muskulatur, mesenkymal eller endotelceller respektive. Positiva (mörk röd) kontroll för E-Cadherin/Alexa Fluor 594 visas på A549 epitelceller (k). Positiv kontroll för α-SMA-cy3 (röd) visas i fibroblaster (g, h). Sekundär antikropp kontroller visas i bronkerna epitelceller för Alexa Fluor 594 (l), kanin anti-mus TRITC (n) och Donkey anti-get FITC (p). Bar = 20 mikroM.
Figur 6 Mänskliga bronkial epitelceller odlade på transwells. Cilierade celler odlas på genomsläppliga polyester membran (6,5 mm diameter) på en seedning täthet av 50.000 CELls per brunn (en) Bar = 100μm. Immunfärgning av celler odlade på transwells med Cytokeratin-FITC (grön) och DAPI (blå) visar att dessa celler är i huvudsak epitelceller, Bar = 20 mikroM. Cellerna odlas nedsänkt i media för 10 dagar, sedan matas media från botten endast för ytterligare 4-6 veckor för att skapa en ALI tills flimmerhår odlas som visas i (b), förstoring 160x. Se Tillägg 2 för videor slå flimmerhår. (C) TEM bilder visar cilier tillväxt av ALI kulturer på 6 veckor, förstoringen = 150000x.
Figur 7 Exempel på celler som skall kasseras baserad på morfologi. Dessa celler visas vanligtvis när vävnad har transplanterats många gånger. Observera att både celler och transplantation bör kasseras. a) Celler togs från en tallrik med transplantationer som odlades 6 gånger och klädd i en T75 kolv. Inom 1 vecka cellerna visade en distinkt morfologi som inte representerar kullersten utseende epitelceller. Istället var tunna avlånga celler växer tätt. b) Fler exempel på celler som inte bör slås samman med den typiska epitelceller, men bör kasseras. Bar = 100μm.
Tabell 1: Kännetecken för mänskliga bronkiell epitelceller kulturer
| Framgång (# av vävnader) | 8 / 9 (88,8%) |
| Mediantiden (intervall) till P1 (veckor) | 4 (3-5) |
| Medelvärde (SEM) cell nr. i P1 | 15,1 (2,75) x 10 6 |
| Medelvärde (SEM) lönsamheten på P1 | 99% (2%) |
| (P1 = första passage) | |
Bilaga 1 visar en remsa av cilierade och icke-cilierade bronkiell epitelceller borstat ur ett mänskligt bronkial segment används för transplantationer, förstoring 320X. Klicka här för tillägg 1 Video.
Tillägg 2 Differentierade bronkial epitelceller som odlas på en luft-vätska gränssnitt. Videor (2a och 2b) visar att slå flimmerhår, förstoringen 160x och 320X respektive. Klicka här för tillägg 2A Video. Klicka här för Supplement 2B video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi lagt fram detaljerade metoder för kultur och utbyggnad av primära mänskliga bronkial epitelceller. Vi visade hur explants och transplantationer av bronkiell vävnad, odlade i media som främjar epitelceller tillväxt, kan ge en ständig källa till människans luftvägar epitelceller för studier av icke-differentierade (nedsänkt) och differentierad (som växer på luft-vätske-gränssnitt) cellmodeller . Dessa celler kan användas i system drogtester som mer liknar de celler i deras verkliga fysiologiska miljöer. Det är mycket viktigt att du tittar på de celler som växer från explants / transplantationer och bekräfta kullersten morfologi. Om cellerna visa en annan morfologi, kasta både cellerna och explants / transplantationer, och fortsätta transplantera den framgångsrika vävnader bara. ALI kulturer i våra händer tog längre tid att bli etablerad än vad som rapporterats tidigare 2. Det är möjligt att förändra media varannan dag på ALI kan främja snabbare epitelceller differentiering och tillväxt av cilier.
Vi hoppas att de metoder som beskrivs här kommer att uppmuntra dig till kultur mänskliga bronkial epitelceller från explants och att använda dessa celler i din studie-system. När allt är mänsklig cell-baserade studier behövs för att fastställa viktiga vägar av mänskliga mekanismer lungsjukdom och för utveckling av cellbaserade in vitro-toxicitet och effekt screening för mänskliga celler som leder till tidig utvärdering och bättre priser framgång av nya läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna är mycket tacksamma till Dr Richard Inculet för att tillhandahålla bronkial vävnader. Forskningsetisk nämnd godkännanden har erhållits från St Josephs Healthcare Hamilton och The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr David McCormack), vävnader och arkiv kommittén, avdelningen för patologi. Vi tackar också Ernie Spitzer (elektronmikroskopi, McMaster University) att ställa TEM av våra ALI kulturer och Daniela Farkas för att ge några av de material som behövs för immunfärgning. Detta arbete har finansierats av ett block term bidrag från Ontario Thoracic Society, Dr Asma Yaghi stöddes av en FSORC stipendium, St Josephs Healthcare, Hamilton, Ontario, Kanada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma-Aldrich | A4919 | Use for coating solution |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C8919 | Use for coating solution |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Use for coating solution |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma-Aldrich | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma-Aldrich | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8412 | BSA |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma-Aldrich | P1476 | BPE |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | EGF |
| (±)-Epinephrine | Sigma-Aldrich | E1635 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Tranferrin Human | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368 | PBS |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | ||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | |
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma-Aldrich | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma-Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Use 1:100 dilution | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage |
| H–chst Stain solution | Sigma-Aldrich | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers. |
|||
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
- Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
