Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

doi: 10.3791/1789 Published: March 26, 2010

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het kweken van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen van explantaten van menselijke bronchiale luchtwegen weefsel inclusief gedifferentieerde groei van een lucht-water grensvlak. Deze methode biedt een overvloedige bron van primaire cellen voor onderzoek naar de rol van de luchtweg epitheel in de menselijke longen gezondheid en ziekte.

Abstract

Menselijke bronchiale epitheelcellen nodig zijn voor cel-modellen van de ziekte en het effect van hulpstoffen en farmacologische agenten op de functie en structuur van de menselijke epitheelcellen te onderzoeken. Hier beschrijven we in detail de kweekmethode bronchiale epitheelcellen van de luchtwegen luchtwegen weefsel dat wordt door de chirurg geoogst op de tijden van de longchirurgie (bv. longkanker of long volume reductie chirurgie). Met ethiek goedkeuring en informed consent, de chirurg neemt wat nodig is voor de pathologie en voorziet ons van een bronchiale gedeelte dat is ver van de zieke gebieden. Het weefsel wordt vervolgens gebruikt als een bron van explanten die kan worden gebruikt voor het kweken van primaire bronchiale epitheelcellen in de cultuur. Bronchiale segmenten ongeveer 0,5-1cm lang en 1 cm in diameter ≤ worden gespoeld met koud EBSS en overtollige parenchymweefsel wordt verwijderd. Segmenten zijn opengesneden en gehakt in de 2-3mm

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Menselijke bronchiale segmenten zorgen voor een overvloedige bron van primaire bronchiale epitheelcellen. In dit artikel beschrijven we een protocol voor groei en uitbreiding van de Mens bronchiale epitheel (HBE) cellen van vers geïsoleerde menselijke bronchiale segmenten. Dit protocol bestaat uit vijf onderdelen:

  1. Coating en krassen 100mm kweekplaten
  2. Voorbereiden Bronchiale Tissue Explantaten
  3. Bronchiale Tissue Transplantatie
  4. Passage van HBE cellen
  5. Groeiende trilharen HBE op Celeigenschappen Transwells

Voordat u begint Merk op dat alle stappen worden gedaan in de biologische veiligheid KAST (BSC) tenzij anders vermeld. Zorg ervoor dat u alle materialen die nodig zijn voor deze procedure. Lees de materialen, reagentia en voorbereiding sectie en zorg ervoor dat u aseptisch (dat wil zeggen in een biologische Safety Cabinet of BSC) de volgende bereid te maken:
Coating-stamoplossing: fibronectine (10 ug / ml), BSA (10 ug / ml) en collageen (30 ug / ml) in Balanced Salt Solution Earle s (EBSS, steriel).
Cultuur Medium: DMEM / Ham F-12 met additieven, antibiotica-antimycotische (1%) en FBS (1%)
Dissociatie oplossingen: trypsine / EDTA stockoplossing aanwezig zijn en DMEM/F-12 met FBS (10%)

1. Coating en krassen 100mm Cultuur Platen: Explantaten zal worden uitgeplaat in 100mm cultuur platen. Begin met het coaten 100mm kweekplaten met coating oplossing. Dit moet worden gedaan in de BSC, houd alles steriel.

  1. Plaats steriele 100mm kweekplaten en coating-oplossing (collageen / fibronectine / BSA) in de BSC.
  2. Pipetteer 2,0 ml van de coating oplossing in een 100 mm plaat.
  3. Swirl rond het bekleden van de onderkant van de plaat. Zorg ervoor dat de coating oplossing omvat gelijkmatig de onderkant van de plaat.
  4. Pipetteer de overgebleven oplossing uit en gebruik die om vacht van een tweede 100mm plaat. Herhaal dit voor zoveel platen als nodig is. Het aantal benodigde platen varieert met het aantal van weefsel explantaten.
  5. Zorg ervoor dat de coating oplossing omvat de basis van de platen gelijkmatig aangetoond.
  6. Bedek de borden met hun covers. Laat de platen in de incubator droge 1-2 uur en de overtollige oplossing aspireer voor het gebruik voor het bronchiale weefsel explantaten. Ongebruikte gecoate kweekplaten kan worden geplaatst in een steriele zak, verzegeld en opgeslagen bij 4 ° C voor later gebruik (kunnen worden opgeslagen tot een maand in de koelkast). Breng op kamertemperatuur voor gebruik.
  7. Spray Clean kleine scherpe schaar, scalpel en pincet met 70% ethanol en brengen BSC. Scratch gecoate platen door stevig met een scalpel tot diep kleine X s (minstens 4) te vormen. Als de kras is niet diep genoeg is, zullen weefsel stukken geen genoegen in de richels en zal drijven.

2. Voorbereiden Bronchiale Tissue Explantaten

Gebruik bronchiale weefsel verkregen binnen 24-36 uur na de operatie. Houden weefsel op ijs in EBSS totdat klaar voor gebruik.

  1. Buiten de BSC: Plaats weefsel in een petrischaal. Spoel de geïsoleerde menselijke bronchiale weefselmonsters in EBSS.
  2. Ontleden het overtollige omringende weefsel.
  3. Opengesneden het bronchiale stukken.
  4. Breng weefsel in de BSC en brengen in een steriele 100mm weefselkweek bord met koude DMEM/HamF12 + 1% antibiotica / antimycotica.
  5. Gebruik de scherpe kleine schaar om het weefsel gesneden 2-3 mm 3 stuks.
  6. Leg een stukje weefsel van de snede in het midden van elke X met een pincet en druk zachtjes.
  7. Laat het weefsel stukken (explantaten) zich aan de plaat voor een paar seconden, en dan zachtjes toe te voegen 10 ml van complete media (DMEM/HamF12 + additieven +1% antibiotische / antimycotische + 1% FBS). Als het weefsel drijven na het toevoegen van media, een tang om het weefsel te duwen in de bergkammen van de X-of een nieuwe te maken X. Het kan nodig zijn om nieuwe X s te maken als de randen zijn niet diep genoeg.
  8. Plaats platen in de broedstoof en veranderen media elke 3-4 dagen.
  9. Weefsels zijn klaar om te transplantatie wanneer er voldoende epitheliale cellen zijn gegroeid rond weefselexplantaten naar 1-2cm gebieden. Dit duurt ongeveer 4 weken.

3. Bronchiale Tissue Transplantatie

  1. Gebruik 100mm gecoate en krassen platen. Aangezien sommige weefselexplantaten misschien niet succesvol zijn, het aantal platen is afhankelijk van hoeveel stukjes weefsel die u verplanten. Als u gebruik maakt van plaatjes die eerder zijn bekleed en opgeslagen bij 4 ° C, op kamertemperatuur worden gebracht vóór gebruik.
  2. Met behulp van een tang voorzichtig pick-up weefsel van de oorspronkelijke plaat en plaats in het centrum van X s in de nieuwe plaat, en druk zachtjes. Weefsels zonder uitgroei moet worden weggegooid.
  3. Laat weefsel plaat houden voor een paar seconden, voeg media en incubeer zoals beschreven oorLier voor explantaten (2.7-2.9).

4. Passage van de menselijke bronchiale epitheel (HBE) cellen

  1. Dooi 2 ml trypsine / EDTA voorraad oplossing voor elke 100mm weefselkweek plaat. Verdunnen voorraad met 6 ml van een steriele 0,01 M PBS (dwz 2 ml stockoplossing toe te voegen aan 6 ml PBS (uiteindelijke concentratie van trypsine is 250 ug / ml en voor EDTA is 100 ug / ml).
  2. Na de verhuizing explantaten om een ​​nieuwe plaat, aspireer media uit platen met 1-2cm ringen van cellen.
  3. Voeg 8 ml warm verdund trypsine / EDTA-oplossing voor elke 100 mm plaat en plaats in de incubator (37 ° C) voor 3-15 minuten. Controleer regelmatig, waardoor trypsine te lang beschadigen de cellen.
  4. Controleer platen onder een microscoop om zeker te zijn de meeste van de cellen zijn opgeheven. Cellen zullen ronden en los te maken, zoals afgebeeld.
  5. Voeg 8 ml van de verwarmde 10% FBS in de media per plaat aan de trypsine / EDTA-oplossing te inactiveren.
  6. Combineer volumes van alle platen in een buis (of afzonderlijke buizen indien verschillende weefsels). Tellen cellen met behulp van een hemacytometer.
  7. Centrifugeer bij 100 g gedurende 5 minuten. Een cel pellet vormen aan de voet van de buis.
  8. Re-schorten celpellet in complete media (DMEM / Ham F12 + alle additieven + 1% antibiotica-antimycotische + 1% FBS) om de gewenste cel concentratie.
  9. Plaats elke twee tot drie miljoen cellen per T75 fles en voeg compleet media als nodig is. Incubeer en verandering media elke 3-4 weken. Cellen groeien tot sub-samenvloeiing (80-90%) in T75 flessen in ongeveer 4 weken. De cellen moeten worden opgeheven en uitgebreid of gebruikt op sub-samenvloeiing tot veroudering te voorkomen.

5. Groeiende trilharen menselijke bronchiale Epitheliale (HBE) cellen op Transwells.

Primaire epitheliale cellen gekweekt uit weefsel explantaten / transplantaties, kan worden uitgebreid tot drie keer, en vervolgens gebruikt. Een zaaien dichtheid van 50.000 tot 100.000 cellen per cm 2 wordt aanbevolen 1,2. Hogere dichtheid bevordert een snellere differentiatie.
Let op: Maak een suspensie van cellen en meten hun nummers. Re-schorten in kweekmedium op 1 miljoen cellen per 2ml.

  1. Begin met de voorbereiding van de doorlaatbare membranen van de transwells door vooraf het incuberen van de celkweek wisselplaten met medium (DMEM / Ham F12) voorafgaand aan het gebruik. Deze stap is nodig met deze gevoelige cellen en zal helpen celhechting.
    1. Gebruik maken van de 6,5 mm inserts die passen in de 24 goed meerdere well platen.
    2. Voeg medium aan beide zijden van het membraan (voor 6,5 mm inserts gebruik 0,6 ml aan de onderkant, 0,1 ml op de top). Incubeer 1 uur in celcultuur incubator.
    3. Verwijder voorzichtig (aspireren) het medium aan beide zijden van het membraan te beginnen met de basale volume eerst.
      Zorgvuldig betekent: het membraan kunnen gemakkelijk worden beschadigd, zodat het medium pipet langs de zijkant van de cultuur invoegen, gebruik van de aanbevolen hoeveelheid. Niet doet, zal resulteren in lekken overname van media naar andere bronnen.
  2. Zaad cellen na pre-incubatie van Permeabele Ondersteuning
    1. Pipet zorgvuldig uw celsuspensie in de apicale kant van het membraan: voor 6.5mm putten 0,1 ml celsuspensie (dat wil zeggen 50.000 cellen) toe te voegen aan de apicale zijde van het membraan.
    2. Pipetteer 0,6 ml medium op de basale kant van het membraan.
  3. Voer de cellen van de apicale en basale zijden voor 10 dagen om een ​​goed gedifferentieerde cultuur vast te stellen: uitwisseling medium twee keer per week met behulp van de aangetoonde methode:
    1. Verwijder eerst basale volume
    2. Vervang de apicale volume (0,1 ml medium)
    3. Voeg 0,6 ml medium om de basale kant van het membraan.

    Deze methode bevordert de cel gehechtheid aan membraan en voorkomt dat cellen die worden blootgesteld aan de lucht voor langere tijd (uitwisseling media snel en terug in de incubator gezet).
  4. Maak een Lucht-water interface (ALI) op dag 10 door het verwijderen van de apicale medium, dan is vervanging van de 0,6 ml medium op de basale kant van het membraan.
  5. Behouden cellen in ALI gedurende 6 weken, te wijzigen media twee keer per week. Trilharen cellen start verschijnen 4 weken na totstandkoming van de ALI. Cellen zullen bereiken uniform differentiatie in trilharen cellen 6 weken na totstandkoming van de ALI.

Materialen Bereiding:

1. Voorbereiding van de Coating Stock Solution (doe dit in het BSC):

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen groeien goed op oppervlakken bedekt met fibronectine / BSA / collageen 3. De coating voorraad-oplossing wordt gebruikt voor de 100 mm weefselkweek platen voor Explantatie en transplantatie culturen zoals hierboven beschreven. Ook de coating oplossing kan worden gebruikt voor het coaten dekglaasjes te versnellen celhechting, kan de dekglaasjes vervolgens worden gebruikt voor immunokleuring experimenten.

  1. Fibronectine (1mg/ml voorraad-oplossing): Gebruik F2006-2mg van Sigma. Los 2 mg in 2mls van de Balanced Salt Solution steriele Earle s (EBSS, Sigma 28.888), filter met 0,2 micrometer spuit filter in de biologische veiligheid kabinet (BSC). Bewaar 1 ml in de -20 ° C vriezer voor later gebruik, en gebruik 1 ml voor het bereiden van een 100 ml van de coating oplossing.
  2. BSA (1mg/ml voorraad-oplossing): Gebruik Sigma A4919-1g. Weeg 20 mg BSA en los op in 20 ml steriel EBSS, filter met 0,2 micrometer spuit filter in de BSC. Aliquot in 1 ml flesjes en op te slaan in de -20 ° C vriezer totdat het nodig is. Gebruik 1 ml bouillon aan 100mls van de coating oplossing te maken.
  3. . Collageen stamoplossing (geleverd als 0,1% of 1mg/ml van Sigma C8919) Let op: alleen geopend in de BSC en zegel strak alvorens terug te keren naar koelkast. Gebruik 3 ml bouillon aan 100 ml van de coating oplossing te maken.
  4. Coating voorraad oplossing: In de BSC: voeg 3mls collageen (1mg/ml) naar 1 ml Fibronectine (1mg/ml) en 1 ml BSA (1mg/ml), plus 95 ml EBSS (steriele). Meng goed en aliquot in 2 ml flesjes en op te slaan in de -20 ° C vriezer totdat het nodig is. Eindconcentraties in coating-stamoplossing: fibronectine (10 ug / ml), BSA (10 ug / ml) en collageen (30 ug / ml) in EBSS.

2. De voorbereiding van Cultuur Medium (te bereiden in de BSC): Medium bestaat uit DMEM / Ham F-12 van Sigma met runderen hypofyse-extract (15 ug / ml) en epidermale groeifactor (10 ng / ml) met andere additieven zoals hieronder aangegeven. Antibiotica / antimycotica (1%) en FBS (1%) worden vers toegevoegd elke keer dat de cultuur medium is veranderd. Dit medium is samengesteld door de herziening van diverse methoden die de luchtweg epitheelcellen celculturen 3-9 beschreven. Ons medium is bedoeld voor een optimale groei van menselijke bronchiale epitheelcellen.

  1. Bovine hypofyse-extract (BPE 1mg/ml voorraad-oplossing): Sigma P1476 (2,5 ml BPE op 14mg/ml steriel en gefilterd oplossing): Verdun 2,5 ml van voorraad (14mg/ml) tot een uiteindelijke concentratie van 1mg/ml. dat wil zeggen voeg 2,5 ml BPE voorraad tot 32,5 ml van de steriele EBSS voor een voorraad van 1mg/ml. Verdeel het deeg in 7,5 ml monsters (4 tubes van 7,5 ml aliquots en een tube van 5 ml aliquot). Na verdunning, op te slaan porties bij -20 ° C totdat het nodig is. Langdurige opslag van gereconstitueerde product en herhaalde bevriezen en ontdooien worden niet aanbevolen.
  2. Epidermale groeifactor (EGF 10 ug / ml stockoplossing): Sigma E9644-0,2 mg. Reconstitueer de inhoud (0,2 mg) in 20 ms van 0,2 mm gefilterd 10 mM azijnzuur met 0,1% BSA (dwz 20 mg BSA oplossen in 20 ml van 10 mM azijnzuur en vervolgens te gebruiken om reconstrueren EFG filter). Aliquot in 0,5 ml porties en bewaar in de -20 vriezer. Gebruik 100μl voor 100 ml media.
  3. Epinefrine (5mg/ml voorraad-oplossing): Sigma E1635. Los 10 mg in 2 ml 1 M gefilterd zoutzuur (HCl), aliquot in 50 ul flesjes en invriezen (-20 ° C).
  4. Insuline (2mg/ml voorraad-oplossing): Sigma I6634 50 mg. Los 50 mg in 25 ml gefilterd (0.2μm filter) verdund HCl (1mm). Aliquot in 1,25 ml flesjes.
  5. Tranferrin Human (50 mg / ml stockoplossing): Sigma T8158 100 mg. Los 100 mg in 2 ml DH20 (gefilterd met een 0,2 um filter). Hoeveelheid aan 100μl elk (in 0,5 ml flesjes).
  6. Triiodo-L-thyronine (1mg/ml voorraad-oplossing): Sigma T6397 100 mg. Los 100 mg in 100 ml 1 M HCl gefilterd. Aliquot in 1 ml porties. Aliquot 0,5 ml in 10μl porties.
  7. Hydorcortisone (5mg/ml voorraadoplossing):. Sigma H0888 Weeg 100 mg en los op in 20 ml gefilterd ethanol voor 5mg/ml voorraad. Hoeveelheid aan 1ml flesjes. Verdeel een 1 ml (5mg/ml) naar 50μl monsters (0,5 ml flesjes).
  8. Retinoïnezuur (1mg/ml voorraad oplossing, verdund tot 0.01mg/ml bij gebruik): Sigma R2625 100 mg). Los 100 mg in 10 ml ethanol. Verdeel tot 1,0 ml aliquots. Divide (1 ml) flacon met 50 tubes van 20μl elk. Invriezen bij -20 ° C. Neem een ​​20μl flacon en vul aan tot 2000μl met media voor een voorraad van 0.01mg/ml wanneer dat nodig is.
  9. Albumine-oplossing van runder serum, steriel gefiltreerd, celkweek getest: Sigma A8412. Bewaar oplossing in de kou (4 ° C) totdat het nodig is. Alleen geopend in het BSC.
  10. Antibiotica-Antimycoticum, Sigma A5955: hoeveelheid aan 1ml volumes en invriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. Gebruik bij 1% uiteindelijke concentratie in medium.
  11. FBS, Sigma F1015: Inactiveer FBS bij 50 ° C gedurende 30 minuten. Laat afkoelen in de BSC. Aliquot in 1 ml en 10 ml steriele flacons. Gebruik bij 1% uiteindelijke concentratie in kweekmedium en bij 10% uiteindelijke concentratie in de media tot trypsine / EDTA-oplossing te neutraliseren.
  12. Constitutie van de cultuur medium:
    Voor500 ml van het medium DMEM/HamF12 te gebruiken:
    • 1 tube van BPE (elk 7.5ml van 1mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 15μg/ml.
    • 1 tube van de EGF (0,5 ml van 10μg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml.
    • 1 tube van epinefrine (50μl van 5mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 0.5μg/ml.
    • 1 injectieflacon van insuline (1,25 ml van 2mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 5μg/ml.
    • 1 injectieflacon van Transferin (100μl van 50mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 10μg/ml.
    • 5 pi van Triiodo-L-thyronine (op 1mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml.
    • 1 injectieflacon van hydrocortison (50μl van 5mg/ml) voor een uiteindelijke concentratie van 0.5μg/ml.
    • 5 pi van retinoïnezuur verdund tot 0.01mg/ml voor een uiteindelijke concentratie van 0.1ng/ml.
    • 10 ui albumine-oplossing van runderen serum voor een uiteindelijke concentratie van 1.5μg/ml
    Plaats 7,5 ml van BPE voorraad oplossing in een 500 ml steriele fles en voeg alle additieven zoals hierboven. Vul aan tot 500 ml met DMEM / Ham F-12. Bewaar goed afgesloten in de koelkast en beschermen tegen licht. Wanneer nodig om medium te vervangen in platen, alleen hoeveelheid het bedrag dat nodig en voeg verse antibiotica-antimycotische (1%) en FBS (1%), opwarmen tot 37 ° C en gebruik.

3. Voorbereiding van de Dissociatie Solutions:

  1. Voorbereiding van trypsine / EDTA-stamoplossing: los 100 mg trypsine (Sigma T9935-100mg) en 40mg EDTA (Sigma E6758) in 500 ml 0,01 M PBS (Sigma E6758). . Aliquot in 2 ml flesjes en op te slaan in de -20 ° C vriezer verdunnen stockoplossing: voeg 2 ml stockoplossing aan 6 ml PBS (uiteindelijke concentratie van trypsine is 250 ug / ml en voor EDTA is 100 ug / ml).
  2. Oplossing voor het stoppen van enzymatische reacties: Bereid verse 10% FBS in de media in de BSC: voeg 1 ml FBS tot 9 ml media (DMEM / Ham F-12). Voor elke 100 mm plaat gebruik 8 ml van de verwarmde 10% FBS tot 8 ml van de dissociatie oplossing te neutraliseren.

4. Speciale vereisten:

  1. Bij het kweken van epitheliale cellen, moet je om alles schoon en gedesinfecteerd. Alle reagentia gebruikt voor celkweek moet steriel zijn of gefilterd met 0.2μm filter. De voorbereiding van de materialen en additieven moet worden gedaan in een biologische Safety Cabinet (BSC). Media toevoegen of veranderen van media moeten worden gedaan in een BSC.
  2. Weg stropdas haar, draag een wegwerp pet, indien beschikbaar, en draag een laboratoriumjas en handschoenen.
  3. Houd alle werkoppervlakken vrij van rommel. Reinig de werkbladen met 70% ethanol tussen operaties en laat een minimum van 15 minuten tussen omgaan met verschillende culturen.
  4. Label alle reagentia en flessen van media, onder meer datum van ontvangst en de datum voorbereid.
  5. Regelmatig te onderzoeken cultuur en media voor het bewijs van de bruto-bacteriële of schimmelinfectie.
  6. Test regelmatig voor mycoplasma (indien nodig)
  7. Warming-up kweekmedium tot 37 ° C voordat u media op de cellen.
  8. Antibiotica / antimycotica en FBS moet vers worden toegevoegd aan medium.
  9. Verandering medium ten minste om de 3-4 dagen. Laat niet de cellen zitten bij kamertemperatuur een lange tijd. Verandering media en onmiddellijk terug te keren naar incubator.

Representatieve resultaten:

Cultuur eigenschappen en morfologie van menselijke bronchiale epitheelcellen

Microscopie van menselijke bronchiale epitheelcellen geborsteld van de bronchiale segmenten die zijn gebruikt voor cultuur, voorafgaand aan het kweken, toonde strips van zowel de trilharen en niet-epitheliale cellen trilharen wat wijst op een normaal epitheel (zie figuur 1, bijlage 1). Immunokleuring van Cytospin bereidingen van de cellen van explantaten en cellen gezaaid op onthulde dekglaasjes dat alle cellen waren positief voor de epitheel-specifieke cytokeratines (figuur 3). Succesvolle culturen uit explantaten van de bronchiale weefsel bij 8 van de 9 weefsels, als een van de explantatie culturen werd besmet. De ringen van epitheliale cellen bereikt, 1-2 cm straal in 3-4 weken (Figuur 2a). Succesvolle explantaten werden opnieuw gekweekt tot 6 keer. In alle succesvolle culturen, was er het bewijs van de cel migratie binnen 48 uur na het starten van de transplantaties (Figuur 2b). Cellen hadden een geplaveide uiterlijk dat is duidelijk voor deze epitheliale cellen zoals getoond in de figuren 2, 4, 5 en 6. Sub-gekweekte bronchiale cellen toonde een uniforme positieve immunokleuring voor cytokeratine en E-cadherine. Immunokleuring met specifieke antilichamen tegen andere soorten cellen zijn geen indicatie van de besmetting van culturen niet zien door de fibroblasten, mesenchymal, of endotheelcellen (α-SMA, vimentine en CD31: PECAM-1 vlekken, respectievelijk) (figuur 5). Cellen gekweekt op doordringbare polyester membranen (transwells) met lucht-water grensvlak gedifferentieerd in trilhaarepitheel zoals aangetoond in Figuur 6. Representatief zijn video-opnamen van de bronchiale epitheelcellen gekweekt op transwells tonen een gedifferentieerd epitheel met kloppend cilia (Supplement 2).

Kenmerken van de menselijke bronchiale epitheelcellen getest celculturen worden weergegeven in Tabel 1. De mediane tijd tot de eerste passage (P1) was 4 weken, en de gemiddelde opbrengst was 15,1 ± 2,75 miljoen cellen (n = 9 weefsels). De levensvatbaarheid van cellen uit explantaten en op P1 werd beoordeeld door trypan blauw uitsluiting, en was constant hoge (99%) in deze bronchiale culturen. Sub-gekweekte cellen van de explantatie culturen van elk weefsel werden samengevoegd na de eerste passage voor later gebruik. Het gemiddelde aantal cellen hersteld van explantaten was significant hoger dan de daaropvolgende Passage cultuur (om de 2 miljoen cellen van P1 P2 opgeleverd: 6.75 ± 2.4 miljoen cellen, n = 5 weefsels). Een P2 cultuur werd verworpen omdat de morfologie was niet typisch voor epitheliale cellen (Figuur 7a). Ook werden twee andere passages (P2 en P3) van verschillende weefsels (figuur 7b) weggegooid.

Figuur 1
Figuur 1 Human bronchiale weefsel segmenten en een vers geïsoleerde epitheliale strook van trilharen en niet-trilharen cellen. (A) Vertegenwoordiger beeld van de menselijke bronchiale weefsel segmenten - ~ 1-2 cm lang en <1 cm diameter worden gebruikt voor primaire culturen van menselijke bronchiale epitheelcellen. (B) Een strook van menselijke bronchiale epitheelcellen geborsteld van de bronchiale segment toont zowel de trilharen en niet-epitheliale cellen trilharen, vergroting 320x. Video van cellen met slaan cilia wordt verstrekt als Supplement 1.

Figuur 2
Figuur 2 menselijke bronchiale epitheel cellen gegroeid van explantaten op 100mm weefselkweek platen. a) de 100mm plaat met 2-3mm3 weefsel. Let op de ring van cellen van ongeveer 1-2cm die zichtbaar met het blote oog na 3-4 weken. b) Afbeelding van rand van Explantatie weefsel en epitheelcellen als ze migreren van de explantatie, bar = 100 urn. Explantaten overgebracht naar een nieuwe plaat te worden transplantaties. Explanten kunnen worden getransplanteerd tot 6 keer.

Figuur 3
Figuur 3 cellen gegroeid van explantaten gekleurd voor epitheel-specifieke cytokeratines. Cytospins van de Cellen van explantaten werden gekleurd voor cytokeratines (groen) met de monoklonale anti-Pan Cytokeratine-FITC (mengsel) die de menselijke cytokeratines 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 en 19 herkent. Kernen werden gekleurd met Hoechst vlek (blauw). De samengevoegde afbeelding laat zien dat bronchiale cellen gegroeid van explantaten waren voornamelijk epitheelcellen, Bar = 20μm.

Figuur 4
Figuur 4 Sub-cultuur van humane bronchiale epitheelcellen. a) Met behulp van trypsine / EDTA, worden de cellen van de explantaten en transplantaties eindigt op de 100mm platen, geteld en gezaaid op 2-3 miljoen cellen per T75 fles. Cellen groeien tot sub-samenvloeiing (80-90%) in T75 kolven in 28-30 dagen (b, c). Let op de typische kasseien morfologie van epitheliale cellen, Bar = 100 urn.

Figuur 5
Figuur 5 Sub-Gekweekte bronchiale cellen werden gecontroleerd met behulp van epitheliale immunokleuring. Deze cellen gekleurd positief (groen) voor Cytokeratine-FITC (a, b), een positieve controle voor cytokeratine-FITC is te zien in A549 epitheelcellen (c) en een negatieve controle is aangetoond in fibroblasten (d). Gekweekte bronchiale cellen gekleurd positief (donker rood) voor E-Cadherin/Alexa Fluor 594 (i, j), en niet vlek voor α-SMA-Cy3 (e, f), Vimentin / TRITC (m), noch CD31 (PECAM -1/FITC) (o) aangeeft dat er geen besmetting van de primaire gekweekte bronchiale epitheelcellen met gladde spieren, mesenchymale of endotheelcellen respectievelijk. Positief (donker rood) controle voor E-Cadherin/Alexa Fluor 594 is gedemonstreerd op A549 epitheelcellen (k). Positieve controle voor α-SMA-Cy3 (rood) is aangetoond in fibroblasten (g, h). Secundair antilichaam controles zijn weergegeven in bronchiale epitheelcellen voor Alexa Fluor 594 (l), konijn anti-muis TRITC (n) en Donkey anti-geit FITC (p). Bar = 20μm.

Figuur 6
Figuur 6 Menselijke bronchiale epitheelcellen gekweekt op transwells. Trilharen cellen worden gekweekt op doorlatend polyester membranen (6,5 mm diameter) met een seeding dichtheid van 50.000 cells per putje (een) Bar = 100 urn. Immunokleuring van de cellen gekweekt op transwells met cytokeratine-FITC (groen) en DAPI (blauw) toont aan dat deze cellen zijn voornamelijk epitheelcellen, Bar = 20μm. Cellen worden gekweekt ondergedompeld in de media voor 10 dagen, vervolgens gevoed media uit de bodem alleen nog een 4-6 weken aan een ALI maken totdat cilia worden geteeld, zoals aangegeven in (b), vergroting 160x. Zie bijlage 2 voor de video's te verslaan cilia. (C) TEM beelden te tonen cilia groei van Ali culturen op 6 weken, vergroting = 150000x.

Figuur 7
Figuur 7 Voorbeeld van cellen die moeten worden weggegooid op basis van morfologie. Deze cellen verschijnen meestal wanneer het weefsel is getransplanteerd vele malen. Merk op dat beide cellen en transplantatie moet worden weggegooid. a) De cellen werden verzameld uit een bord met transplantaties die werden gekweekt 6 keer en uitgeplaat in een T75 fles. Binnen 1 week de cellen toonde een duidelijke morfologie die niet vertegenwoordigen de geplaveide verschijning van epitheliale cellen. In plaats daarvan werden dunne langgerekte cellen groeien dicht. b) Meer voorbeelden van cellen die niet moet worden samengevoegd met de typische epitheliale cellen, maar moeten worden weggegooid. Bar = 100 urn.

Tabel 1: Kenmerken van de menselijke bronchiale epitheelcellen culturen

Slagingspercentage (# van de weefsels) 8 / 9 (88,8%)
Mediane tijd (bereik) naar P1 (week) 4 (3-5)
De gemiddelde (SEM) cel niet. bij P1 15,1 (2,75) x 10 6
Gemiddelde (SEM) levensvatbaarheid op P1 99% (2%)
(P1 = eerste passage)

Supplement 1 toont een strook van trilharen en niet-trilharen bronchiale epitheelcellen geborsteld vanuit een menselijke bronchiale segment gebruikt worden voor transplantatie, vergroting 320x. Klik hier voor het Supplement een Video.

Supplement 2 Gedifferentieerde bronchiale epitheelcellen gekweekt op een lucht-water grensvlak. Video's (2a en 2b) laten zien slaan trilharen, vergroting 160X en 320x respectievelijk. Klik hier voor het Supplement 2A Video. Klik hier voor het Supplement 2B Video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In deze studie hebben we gepresenteerd gedetailleerde methoden voor cultuur en uitbreiding van de primaire menselijke bronchiale epitheelcellen. We laten zien hoe explantaten en transplantaties van bronchiale weefsel, gekweekt in media die epitheliale celgroei te bevorderen, kan een continue bron van menselijke epitheelcellen voor studies van de niet-gesplitste (onder water) en gedifferentieerde (gekweekt op lucht-water grensvlak) cel-modellen bieden . Deze cellen kunnen worden gebruikt in drug het testen van systemen die meer lijken op de cellen in hun echte fysiologische omgeving. Het is erg belangrijk dat je de cellen die groeien uit de explantaten / transplantaties en bevestig de geplaveide morfologie te kijken. Als de cellen vertonen een verschillende morfologie, gooi zowel de cellen en explantaten / transplantatie, en ga door het transplanteren van de succesvolle weefsels alleen. De ALI culturen in onze handen duurde langer vast te stellen dan eerder gerapporteerd 2. Het is mogelijk dat het veranderen van de media om de andere dag op de ALI kunnen bevorderen sneller epitheliale cel differentiatie en de groei van de cilia.

We hopen dat de hier beschreven methoden zal je aanmoedigen om de cultuur menselijke bronchiale epitheelcellen van explantaten en om deze cellen te gebruiken in je studie-systemen. Immers, zijn menselijke cel-gebaseerde studies die nodig zijn voor het bepalen van belangrijke wegen van de menselijke longziekten mechanismen en voor de ontwikkeling van cel-gebaseerde in vitro toxiciteit en werkzaamheid van screening op menselijke cellen leidt tot vroege evaluatie en een betere slagingspercentages van nieuwe medicijnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs zijn zeer dankbaar dat dr. Richard Inculet voor het verstrekken van de bronchiale weefsels. Onderzoek Ethics Board goedkeuringen zijn verkregen van St. Joseph's Gezondheidszorg Hamilton en The University of Western Ontario / Londen Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), weefsel-en Archief Comite, afdeling Pathologie. We danken ook Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) voor het leveren van TEM van onze ALI culturen en Daniela Farkas voor het verstrekken van een deel van de materialen die nodig zijn voor de immunokleuring. Dit werk werd gefinancierd door een Block term subsidie ​​van de Ontario Thoracic Society, dr. Asma Yaghi werd ondersteund door een FSORC beurs, St. Joseph's Healthcare, Hamilton, Ontario, Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from bovine serum, powder Sigma-Aldrich A4919 Use for coating solution
COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered Sigma-Aldrich C8919 Use for coating solution
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Use for coating solution
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) Sigma-Aldrich 28888 Use for rinsing tissue and for coating solution
DMEM/Ham F-12 Sigma-Aldrich D8437
FBS Sigma-Aldrich F1015 Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed
Antibiotic-Antimycotic Stabilized Sigma-Aldrich A5955 Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed
Albumin solution from bovine serum Sigma-Aldrich A8412 BSA
Pituitary Extract Bovine Sigma-Aldrich P1476 BPE
Epidermal growth factor Sigma-Aldrich E9644 EGF
(±)-Epinephrine Sigma-Aldrich E1635
Insulin Sigma-Aldrich I6634
Tranferrin Human Sigma-Aldrich T8158
Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich T6397
Hydorcortisone Sigma-Aldrich H0888
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625
Trypsin Sigma-Aldrich T9935
EDTA Sigma-Aldrich E6758 EDTA
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368 PBS
70% ethanol Use for disinfecting and cleaning
24 well Transwells Corning 3470
Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning Fisher Scientific 05-539-104 These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth
Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody Sigma-Aldrich F3418 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution
Antibody: E-Cadherin (H108) Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-7870 Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A21207 Use 1:400 dilution
Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution
Antibody: Vimentin (RV202) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-32322 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody
Rabbit anti-mouse TRITC Sigma-Aldrich T2402 Use 1:400 dilution
Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-1506 Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody
Donkey anti-goat IgG-FITC Santa Cruz Biotechnology, Inc. Use 1:100 dilution
Vectashield Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage
Vectashield Mounting medium Vector Laboratories H-1000 Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage
H–chst Stain solution Sigma-Aldrich H6024 Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000

Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. (2008).
  2. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
  3. Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
  4. Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
  5. Wetering, S. van Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
  6. Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
  7. Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
  8. Freshney, R. I. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).
  9. Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. Freshney, R. I. Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).
Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yaghi, A., Zaman, A., Dolovich, M. Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants. J. Vis. Exp. (37), e1789, doi:10.3791/1789 (2010).More

Yaghi, A., Zaman, A., Dolovich, M. Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants. J. Vis. Exp. (37), e1789, doi:10.3791/1789 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter