Summary
צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.
Abstract
שילוב של שלפוחית סינפטית עם קרום הפלזמה (exocytosis) היא צעד נדרש שחרור הנוירוטרנסמיטר ותקשורת עצבית. שלפוחית מאוחזרות אז מן הקרום פלזמה (אנדוציטוזה) ו מקובצים יחד עם בריכה הכללית של שלפוחית בתוך הטרמינל העצב, עד שהם עוברים exo-וחדשים מחזור אנדוציטוזה (מיחזור שלפוחית). תהליכים אלה נחקרו תוך שימוש במגוון טכניקות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, הקלטות electrophysiology, amperometry ומדידות קיבול. חשוב לציין, במהלך שני העשורים האחרונים מספר סמנים שכותרתו fluorescently יצא, המאפשר לעקוב אחר שיטות אופטיות שלפוחית בדינמיקה מיחזור שלהם. אחד הסמנים הנפוץ ביותר הוא styryl FM או צבע 1; מבנית, כל צבעי FM מכילים ראש הידרופילי וזנב lipophilic מחובר דרך טבעת ארומטיים אחד או יותר קשרים כפולים (איור 1B). הניסוי הקלאסי לצבוע FM לתייג מאגר של שלפוחית מורכב רחצה והכנת (איור 1Ai) עם צבע במהלך גירוי של העצב (חשמלית או עם K גבוה +). זה גורם מיחזור שלפוחית והעמסת הבאות של צבע לתוך שלפוחית endocytosed לאחרונה (איור 1A I-III). לאחר טעינת שלפוחית עם צבע, סיבוב שני של גירוי באמבטיה לצבוע חופשי היה לעורר את שחרורו FM דרך exocytosis (איור 1A IV-V), תהליך שיכול להיות מלווה ניטור הירידה בעוצמת הקרינה (destaining).
למרות צבעים FM תרמו רבות בתחום מיחזור שלפוחית, לא ניתן לקבוע את לוקליזציה מורפולוגיה המדויק או של שלפוחית הפרט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. מסיבה זו, נסביר כאן כיצד צבעים FM יכול לשמש גם כסמנים endocytic באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, דרך photoconversion. הטכניקה photoconversion מנצל את המאפיין של צבעי ניאון כדי ליצור מינים חמצן תגובתי תחת תאורה חזקה. ההכנות שכותרתו fluorescently שקועות פתרון המכיל diaminobenzidine (DAB) ו מואר. מינים הריאקטיבי שנוצר על ידי מולקולות צבען לחמצן DAB, המהווה לזרז יציבה, מסיס בעל מראה כהה ניתן להבחין בקלות במיקרוסקופ אלקטרונים 2,3. כפי DAB הוא מתחמצן רק בסביבה הקרובה של מולקולות ניאון (כמו מינים החמצן מגיב הם קצרי חיים), הטכניקה מבטיח כי מבנים שכותרתו fluorescently רק הולך להכיל את המשקע אלקטרונים צפופה. הטכניקה ובכך מאפשר ללמוד את המורפולוגיה של המיקום המדויק של פעיל מיחזור האברונים.
Protocol
1) הכנת צומת melanogaster תסיסנית העצבית שרירית (NMJ)
- הכנת תקן תסיסנית מלוחים (130 mM NaCl, סוכרוז 36 מ"מ, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2, 5 Hepes מ"מ, pH 7.3 4.
- מנתחים את הכנה מלוחים (1.1). הזחלים תסיסנית היא שואפת הגב בצד למעלה בצלחת Sylgard; הצד הגבי מחולק האורך, ואת האיברים הפנימיים יוסרו. הכנה נמתח אז שואפת. שרירי הגחון כמה יכול לשמש אז.
2) גירוי ו מכתים FM
- מומלץ לעשות את כל הפעולות הבאות בתנאי תאורה נמוכים, על מנת להגן על צבעי FM מן הלבנה.
- עבור גירוי כימי של העצבים, חיץ אשלגן גבוהה משמש. הכן תסיסנית מלוחים (ראו 1.1) המכיל 90 מ"מ של KCl ו - 10 מיקרומטר של צבע FM1-43. שמור את פתרון מוגן מפני אור.
- אמבטיה עם הכנה למאגר מוכן בעבר דקה 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף עם תקן תסיסנית מלוחים (1.1) כדי להסיר צבע תאיים FM1-43. המשך במהירות קיבעון.
3) תיקון
- אמבט ההכנה עם glutaraldehyde 2.5% ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. עבור שימור טוב של תכונות מורפולוגיות, glutaraldehyde הוא העדיף paraformaldehyde.
- שטפי פעם עם PBS ולאחר מכן לעזוב את הכנה מתחת למים במשך 15 דקות ב 100 mM של NH 4 Cl. צעד זה נעשה על מנת להרוות את קבוצות אלדהיד ללא מקבע glutaraldehyde הנותרים.
- לשטוף את הפתרון NH 4 Cl עם PBS נורמלי.
4) photoconversion
- דגירה הכנת NMJ במשך 30 דקות על 4 מעלות צלזיוס PBS המכיל 1.5 מ"ג-1 מ"ל של diaminobenzidine (DAB).
- מקם את המדגם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מצא להתמקד האות ניאון באמצעות מים נמוכה יחסית הגדלה טבילה אובייקטיבי (20x 0.5 NA).
- להאיר את המדגם עם עוצמת מנורה מקסימלית עד לצבוע FM הוא מחומצן לחלוטין (תרשים 1C). כדי לשלוט אם photoconversion התרחשה, מומלץ לבדוק את המדגם תחת אור השידור לפני ואחרי שלב לצבוע הלבנת FM. אם photoconversion מתרחש, משקע חום כהה צפוי (תרשים 1C). זמן תאורה משתנה, תלוי בעוצמת התאורה וגם על החדירה DAB לתוך ההכנה. עבור רוב ההכנות, מצאנו פעמים תאורה של ~ 30-45 דקות להיות אופטימלי בעת שימוש המטרה 20x. תקופות קצרות תאורה משמשים מטרות בהגדלה גבוהה יותר (60x).
- עבור תאורה אנו מעדיפים להשתמש מנורת כספית, עם דיור מנורה המכיל במראה האחורית, אשר אוספת את גב מפוזרים קרני האור, ולכן מגביר את עוצמת הכולל.
5) עיבוד המדגם עבור EM
- Osmication
- הכן פתרון עם נפח אחד tetroxide אוסמיום בכמויות עץ של מים (כ 300 μl לדגימה). עבודה באמצעות tetroxide אוסמיום חייב להיעשות מתחת למכסה המנוע, באמצעות כפפות איי ציוד הגנה.
- דגירה הכנת בפתרון אוסמיום tetroxide שעה 1 בטמפרטורת החדר (מתחת למכסה המנוע).
- לשטוף נרחב עם PBS (4-5 פעמים 5 דקות) ולהעביר כל דגימות בקבוק זכוכית נקי.
- התייבשות
- הכינו פתרונות נפרד המכיל 30, 50, 70 90, 95 ו - 100% אתנול.
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 30% מדגם זה במשך 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 50% מדגם זה במשך 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 70% לטעום כל 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 90% לטעום כל 5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 95% לטעום כל 5 דקות (לחזור 3x).
- הוסף 1 מ"ל של אתנול 100% לטעום כל 5 דקות (לחזור 3x).
- הטבעת ועיבוד נוסף
- מערבבים 1 נפח של EPON שרף עם נפח אחד של אתנול. הוסף אותו בהכנת תחת סיבוב רציפה (2-4 שעות).
- מניחים את הכנה 100% EPON ב צלוחיות פתוח, לאפשר אתנול הנותרים להתאדות (4-6 שעות).
- מניחים את הכנה תבניות ב 60 ° C במשך 36 שעות.
- במיקרוסקופ אלקטרונים עיבוד. תהליך הכנה סעיפים 50-80 ננומטר דק, באמצעות נהלים ultramicrotomy סטנדרטי.
- במיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה
- ההכנה היא הדמיה באמצעות קונבנציונאלי נהלים EM.
6) נציג תוצאות
התוצאות צפויות המפורטות דמויות 1C ו 2. ההליך תאורה תוצאות היווצרות של אחיDAB לזרז wn, אשר יהיה גלוי הקרינה והן הדמיה השידור. המופע הראשון במהלך הארה היא היעלמותו של הקרינה הקשורים מכתים את צבע FM. הקרינה רקע המושרה על ידי מקבע אלדהיד, לעומת זאת, יהיו גלויים במשך הניסוי. הלבנה מתרחש בדרך כלל ~ 10-20 דקות לאחר תחילת ההארה. בדרך כלל המוצר לא photoconversion ניתן להבחין בנקודה זו בזמן.
תאורה יש להמשיך, ואחרי ~ 10 דקות ההכנות יפנה בגוון חום עקב הצטברות DAB (איור 1C iv) לא ברור מדוע DAB המשקעים FM צבע הלבנה אינם מתרחשים בו זמנית, זה אפשרי כי גדול יחסית כמות DAB חמצון צריך לצבור לפני צבירה משקעים, ולכן התגובה הזו היא איטית יותר מאשר תהליך הלבנה. בשלב זה, עם זאת, הכנת אינו מוכן לעיבוד במיקרוסקופ אלקטרונים, כמו משקעים DAB אינו שלם סביר. אנחנו מעדיפים לחכות עוד 5-10 דקות, במהלכו הכנה (מסוף עצב presynaptic) מניחה חום כהה (או שחור) צבע, מעיד על גיור מלא. המרה קלה של פני השטח הכללי של הכנה (למשל, של סיבי שריר צומת neuromuscular) ניתן לצפות בשלב זה. זה קשור כנראה המרה של DAB המושרה על ידי autofluorescence (ו / או פלואורסצנטי מיצב), וזה לא מזיק ההליך.
הכנה מעובד מכן עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, וצריך לבדוק נוכחות של אפל (מסומן) שלפוחיות. כפי שהראנו לפני 5,6, שלפוחית אלה צפופה הרבה יותר מאשר אי שכותרתו אלה, ולכן הם להבחין בקלות (תרשים 2B). כדי להגדיל את הסיכוי להבחין היטב את הסוגים השונים של שלפוחית, בניגוד לשיפור לא מכתים הודעה הסעיפים יש לבצע (לא אצטט uranyl או ציטרט מכתים להוביל); מכתים אוסמיום מספיק להתבונן אלמנטים הסלולר ביותר, הוא לא כמו חשוך כמו לזרז DAB.
איור 1: צבעים FM והוא לשימוש photoconversion. (א) לייצג את שלבי הניסוי הקלאסי עבור טעינה distaining שלפוחית באמצעות צבע FM תחת גירוי. (I) דגירה המדגם ב FM צבע המכיל חיץ. (Ii) לעידוד (חשמלית או כימית) כדי לגרום איחוי שלפוחית בנוכחות של FM לצבוע. (Iii) אנדוציטוזה subsequence לאחר גירוי יהיה לטעון כמה שלפוחיות עם צבע FM הנוכחי עדיין למאגר תאיים. (Iv) החלף את צבע FM תאיים על ידי שטיפה עם חיץ. (V) גירוי חדש יניעו שלפוחית טעון לשחרר לצבוע FM שלהם על exocytosis. (ב) סכמטי המציג את ראש הגשר ואת הזנב של צבע FM1-43. (ג) דוגמה של ניסוי photoconversion ב תסיסנית NMJ. (I) לאחר טעינת NMJ עם FM1-43, כביסה מולקולות צבע חיצוני ותיקון, הקרינה של מסוף עצב ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונאלי (63x). (Ii-iii) תחת תאורה רציפה לצבוע הוא מחומצן לחלוטין. (ד) כאשר התאורה ממשיכה, צבע שחור מופיע בשל משקעים diaminobenzidine. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר.
איור 2: EM דוגמאות של דגימות photoconverted (א) התמונה מראה מסוף עצב המכיל שלפוחית סינפטית, אבל לא מהם photoconverted, זה יכול להיגרם על ידי כך שלא מספיק תאורה או חדירה diaminobenzidine עניים הרקמה.. (ב) באוטון Synaptic עם כמה (מלא) שלפוחית כהה שעבר photoconversion FM. (ג) עודף תוצאות תאורה בטרמינל כהה הכולל שבו אין שלפוחיות או אברונים וניתן להבחין בהם. ברים סולם מייצגים 200 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים כמה צריכה להילקח בחשבון:
- הדגירה DAB צריכה להתבצע רק לאחר שטיפה יסודית של מרווה ההכנות. אחרת glutaraldehyde לא הגיבו יהיה אינטראקציה עם DAB ולגרום המשקעים שלה (בדרך כלל בצורה של גבישים שטוחים, שאינם אלקטרונים צפוף). הכנות שבה משקעים זה מתרחש לעתים נדירות בשפע שמישים עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.
- פעמים תאורה צריך להיות מותאם, על ידי בדיקת תכשירים זהים מספר פעמים עם תאורה שונה. מניסיוננו, המרה אופטימלית (תרשים 2B) מושגת בתוך חלון זמן של כ - 5 דקות (למשל, בין 35 ו - 40 דקות לאחר תחילת ההארה). תאורה לא מספקת (איור 2 א) מתאפיינת בחוסר האברונים שכותרתו, ו / או אברונים שכותרתו חלקית (כגון שלפוחית המופיעים להכיל DAB במחצית רק נפח שלהם). תאורה ארוך, לעומת זאת, תוצאות ההמרה מעל המוצר המרה DAB מצטבר, מעוות את האברונים ובורח לתוך cytosol (איור 2C). ההכנות להופיע מבנים שחור במיקרוסקופ אלקטרונים, עם מורפולוגיה הנצפה קטן.
השתמשנו בטכניקה בהכנות, ובהם צמתים neuromuscular מ Caenorhabditis elegans, תסיסנית melanogaster, דג הזברה (Danio rerio) ו צפרדע (Rana pipiens ו אסכאלאנטה רנא). יש לנו גם השתמשו בטכניקה בתאים בתרבית, כולל נוירונים בתרבית תאים נוירואנדוקריניים. זה גם יכול לשמש בהצלחה מטוהרים סינפסות מהמוח חולדה (synaptosomes). לכן, אנו מצפים הטכניקה להיות שמיש ברוב ההכנות אשר השימוש ספיגת הקרום שלפוחי.
הטכניקה היא טכניקה רגישה ביותר עד כה בקביעת מיקום ומורפולוגיה של אברונים endocytosed. זה היה בשימוש כדי לקבוע את המיקום המדויק של האברונים endocytosed לאחרונה, כולל בריכות פיזיולוגי מסוים של שלפוחית 5,6,7,8. הוא שימש גם בקביעת מספר ומורפולוגיה של אברונים במסלול מיחזור ראה למשל 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
