Summary
FM kleurstoffen zijn van onschatbare hulp bij het begrijpen van synaptische dynamiek. FMS worden normaal gevolgd onder de fluorescentie microscoop tijdens de verschillende stimulatie omstandigheden. Echter, photoconversion van de FM-kleurstoffen in combinatie met elektronenmicroscopie kan de visualisatie van verschillende synaptische vesicles zwembaden, onder andere ultrastructuur componenten, in de synaptische boutons.
Abstract
De fusie van synaptische blaasjes met de plasmamembraan (exocytose) is een vereiste stap in de neurotransmitters en neuronale communicatie. De blaasjes worden vervolgens opgehaald uit de plasmamembraan (endocytose) en samengevoegd met de algemene pool van blaasjes in het zenuwuiteinde, totdat ze ondergaan een nieuwe exo-en endocytose cyclus (blaasjes recycling). Deze processen zijn bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan technieken zoals elektronen microscopie, elektrofysiologie opnames, amperometrie en capaciteit metingen. Belangrijk is dat gedurende de laatste twee decennia een aantal van de fluorescent gelabelde markers ontstaan, waardoor optische technieken om blaasjes track in hun recycling dynamiek. Een van de meest gebruikte markers is de styrylkleurstoffen of de FM-kleurstof 1, structureel, alle FM-kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een staart van lipofiele aangesloten via een aromatische ring en een of meer dubbele bindingen (Fig. 1B). Een klassieke FM kleurstof experiment om een pool van blaasjes label bestaat uit het wassen van de voorbereiding (Fig. 1Ai) met de kleurstof tijdens de stimulatie van de zenuw (elektrisch of met een hoge K +). Dit leidt tot blaasje recycling en de daaropvolgende laden van de kleurstof in recent endocytosed blaasjes (afb. 1A i-iii). Na het laden van de blaasjes met kleurstof, een tweede ronde van de stimulatie in een dye-vrij bad zou leiden tot de FM-versie door middel van exocytose (afb. 1A IV-V), proces dat kan worden gevolgd door het toezicht op de fluorescentie-intensiteit afnemen (ontkleuren).
Hoewel de FM kleurstoffen hebben sterk bijgedragen aan het gebied van recycling blaasje, is het niet mogelijk om de exacte lokalisatie of de morfologie van de individuele blaasjes te bepalen door gebruik te maken van conventionele fluorescentie microscopie. Om die reden leggen we uit hier hoe FM kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt als endocytische markers met behulp van elektronenmicroscopie, door middel van photoconversion. De photoconversion techniek maakt gebruik van het eigendom van fluorescente kleurstoffen aan reactive oxygen species te genereren onder intense verlichting. Fluorescent gelabelde bereidingen worden ondergedompeld in een oplossing die diaminobenzidine (DAB) en verlicht. Reactieve stoffen die door de kleurstof moleculen oxideren van de DAB, die een stabiele, onoplosbaar precipitaat dat een donkere verschijning heeft en kan gemakkelijk worden onderscheiden in elektronenmicroscopie 2,3 vormen. Omdat DAB is alleen geoxideerd in de directe omgeving van fluorescerende moleculen (zoals de reactieve zuurstof species zijn van korte duur), de techniek zorgt ervoor dat alleen fluorescent gelabelde structuren gaan de elektron-dense neerslag bevatten. De techniek laat dus de studie van de exacte locatie en de morfologie van actief recycling organellen.
Protocol
1) Bereiding van Drosophila melanogaster neuronale gespierd splitsing (NMJ)
- Bereid standaard Drosophila zoutoplossing (130 mM NaCl, 36 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Ontleden de bereiding in een zoutoplossing (1.1). De Drosophila larven is dorsale zijde-up kwijnde in een Sylgard schotel; de dorsale zijde is ingedeeld lengte, en de inwendige organen worden verwijderd. Het preparaat wordt dan uitgerekt en kwijnde. Meerdere ventrale spieren kan dan worden gebruikt.
2) Stimuleren en FM-vlekken
- Het is raadzaam om de volgende stappen in omstandigheden met weinig licht te doen, om de FM-kleurstoffen te beschermen tegen bleken.
- Voor de chemische stimulatie van de zenuwen, is hoog kalium buffer gebruikt. Bereid Drosophila zoutoplossing (zie 1.1) die 90 mM KCl en 10 uM van FM1-43 dye. Bewaar de oplossing beschermd tegen licht.
- Bad van de voorbereiding met de vooraf bereide buffer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Wassen met standaard Drosophila zoutoplossing (1.1) met de extracellulaire FM1-43 kleurstof te verwijderen. Ga snel naar fixatie.
3) Vaststelling
- Bad van de voorbereiding met 2,5% glutaaraldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Voor een goede conservering van morfologische kenmerken, is glutaraldehyde voorkeur paraformaldehyde.
- Was een keer met PBS en laat de voorbereiding onder water gedurende 15 minuten in 100 mM van NH 4 Cl. Deze stap is gedaan om de vrije aldehyde groepen van de resterende glutaraldehyde fixeermiddel lessen.
- Was de NH 4 Cl-oplossing uit met normale PBS.
4) Photoconversion
- Incubeer de NMJ voorbereiding gedurende 30 minuten bij 4 ° C in PBS met 1,5 mg ml-1 van diaminobenzidine (DAB).
- Plaats het monster onder de fluorescentie microscoop. Zoek en focus van de tl-signaal met behulp van een relatief lage vergroting water immersie objectief (20x 0.5 NA).
- Verlicht het monster met de maximale intensiteit van lamp tot de FM-kleurstof is volledig gebleekt (figuur 1C). Om te controleren of photoconversion heeft plaatsgevonden, is het raadzaam om in de steekproef onder transmissie licht voor en na de FM-kleurstof bleken stap. Als photoconversion plaatsvindt, is een donkerbruin neerslag verwacht (figuur 1C). De verlichting is variabel, afhankelijk van de verlichting sterkte en ook op de DAB-penetratie in de voorbereiding. Voor de meeste voorbereidingen, vonden we verlichting tijden van ~ 30-45 minuten optimaal te zijn bij het gebruik van een 20x doelstelling. Kortere periodes verlichting worden gebruikt voor een hogere vergroting doelstellingen (60x).
- Voor verlichting we de voorkeur aan een kwik lamp te gebruiken, met een lamp behuizing met daarin een back spiegel, waarin de back-verstrooide lichtstralen verzamelt, en daarom verhoogt de totale intensiteit.
5) Het verwerken van de steekproef voor EM
- Osmication
- Bereid een oplossing met een volume van osmium tetroxide in de boom hoeveelheden water (ca. 300 ul per monster). Werken met osmium tetroxide moet worden gedaan onder de motorkap, met behulp van handschoenen en aye beschermingsmiddelen.
- Incubeer de bereiding in de osmium tetroxide oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (Onder de motorkap).
- Was uitgebreid met PBS (4-5 keer 5 minuten) en breng elke monsters naar een schone glazen kolf.
- Uitdroging
- Maak afzonderlijke oplossingen die 30, 50, 70 90, 95 en 100% van ethanol.
- Voeg 1 ml 30% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml 50% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml 70% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml 90% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml 95% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten (herhaal 3x).
- Voeg 1 ml 100% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten (herhaal 3x).
- Inbedding en de verdere verwerking
- Meng 1 deel van EPON hars met een volume van ethanol. Voeg het toe aan de voorbereiding onder continue rotatie (2-4 uur).
- Plaats de bereiding in 100% EPON in open kolven, om de resterende ethanol verdampen (4-6 uur).
- Plaats de bereiding in schimmels bij 60 ° C voor 36 uur.
- Elektronenmicroscopie verwerking. Verwerk de voorbereiding in 50 tot 80 nm dunne secties, met behulp van standaard ultramicrotomy procedures.
- Elektronenmicroscopie beeldvorming
- Het preparaat is beeld gebracht met behulp van conventionele EM procedures.
6) representatieve resultaten
De verwachte resultaten worden beschreven in de figuren 1C en 2. De verlichting procedure resulteert in de vorming van brown DAB neerslag, die zal worden zichtbaar in zowel fluorescentie en transmissie beeldvorming. Het eerste optreden tijdens de belichting is het verdwijnen van de fluorescentie in verband met de FM-kleurstof vlekken. De achtergrond fluorescentie veroorzaakt door de aldehyde fixatief, daarentegen, wordt zichtbaar in het experiment. Het bleken gebeurt meestal in ~ 10-20 minuten na het begin van verlichting. Meestal niet photoconversion product kan worden waargenomen op dit moment punt.
Verlichting moet worden voortgezet, en na ~ 10 minuten de voorbereidingen zal wenden tot een bruine tint als gevolg van DAB-accumulatie (afb. 1C iv) Het is niet duidelijk waarom de DAB-en FM-neerslag kleurstof bleken niet gelijktijdig plaatsvinden, is het mogelijk dat een relatief groot hoeveelheid geoxideerd DAB moet verzamelen voor aggregatie en neerslag, en dat daarom deze reactie is langzamer dan het bleekproces. In dit stadium, maar de voorbereiding is nog niet klaar voor elektronenmicroscopie verwerking, zoals de DAB neerslag is waarschijnlijk onvolledig. Wij geven de voorkeur aan 5-10 minuten langer te wachten, waarin de voorbereiding (presynaptische zenuwuiteinde) een donker-bruin (of zwart) kleur, indicatief voor volledige omzetting op zich neemt. Een lichte verbouwing van de algemene oppervlak van het preparaat (bijvoorbeeld van de spiervezels in een neuromusculaire verbinding) kan worden waargenomen in dit stadium. Het is zeer waarschijnlijk te maken met een conversie van DAB veroorzaakt door autofluorescentie (en / of fixatief fluorescentie), en het is niet schadelijk voor de procedure.
Het preparaat wordt vervolgens verwerkt voor elektronenmicroscopie, en moet worden gecontroleerd op de aanwezigheid van donkere (label) blaasjes. Zoals we hebben aangetoond voordat 5,6, deze blaasjes zijn veel compacter dan niet-gelabeld degenen, en zijn daarom makkelijk te onderscheiden (Figuur 2B). Om de kans te onderscheiden en de verschillende types van blaasjes te verhogen, mag geen contrast-verbeterende na kleuring van de secties worden uitgevoerd (geen uranylacetaat of lood citraat vlekken), de osmium kleuring is voldoende om de meeste cellulaire elementen te observeren, en is niet zo donker als DAB neerslag.
Figuur 1: FM kleurstoffen en te gebruiken voor photoconversion. (A) geeft de stappen van een klassiek experiment voor het laden en distaining blaasjes met behulp van FM-dye onder stimulatie. (I) Incubeer het monster in de FM-dye met buffer. (Ii) stimuleren (elektrisch of chemisch) om blaasjes fusie te induceren in de aanwezigheid van FM-kleurstof. (Iii) De subsequence endocytose na stimulatie laadt een aantal blaasjes met FM kleurstof nog steeds aanwezig in het extracellulaire buffer. (Iv) Vervang de extracellulaire FM kleurstof door te wassen met buffer. (V) Een nieuwe stimulatie zal leiden geladen blaasjes op hun FM-kleurstofvrijmaking op exocytose. (B) Schematische met de kop, brug en staart van de FM1-43 dye. (C) Voorbeeld van een photoconversion experiment in Drosophila NMJ. (I) Na het laden van de NMJ met FM1-43, het wassen van externe kleurstofmoleculen en tot vaststelling, kan de fluorescentie van een zenuw klem worden waargenomen met een conventionele epifluorescentiemicroscoop (63x). (Ii-iii) Onder continue verlichting van de kleurstof is volledig gebleekt. (Iv) Bij de verlichting blijft, een zwarte kleur lijkt te wijten aan diaminobenzidine neerslag. Schaalbalk staat voor 10 micrometer.
Figuur 2: EM voorbeelden van photoconverted monsters (A) De afbeelding toont een zenuwuiteinde met synaptische blaasjes, maar niet van hen zijn photoconverted, dit kan worden veroorzaakt door het niet genoeg verlichting of slechte diaminobenzidine penetratie in het weefsel.. (B) Synaptic bouton met verschillende donkere (gevuld) blaasjes die ging via de FM-photoconversion. (C) overschotten van verlichting resulteert in een totale donker terminal waar geen blaasjes of organellen zijn te onderscheiden. Schaal balken geven 200 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een paar kritische stappen moet rekening worden gehouden met:
- De DAB incubatie mag alleen worden uitgevoerd na een grondig wassen en afschrikken van de voorbereidingen. Anders wordt de niet-gereageerde glutaaraldehyde zal interageren met DAB en de oorzaak zijn neerslag (meestal in de vorm van platte kristallen, die niet elektron dicht). De voorbereidingen waar dit gebeurt neerslag overvloedig zijn zelden bruikbaar zijn voor elektronenmicroscopie.
- Verlichting tijden moet worden geoptimaliseerd, door het testen van meerdere identieke bereidingen met verschillende belichting tijden. In onze ervaring, is een optimale conversie (Figuur 2B) bereikt in een tijdsbestek van ongeveer 5 minuten (bijvoorbeeld tussen 35 en 40 minuten na de start van verlichting). Onvoldoende verlichting (Figuur 2A) wordt gekenmerkt door een gebrek aan gelabeld organellen, en / of gedeeltelijk gelabeld organellen (zoals blaasjes verschijnen op DAB bevatten slechts de helft van hun volume). Lange verlichting, daarentegen, resulteert in een over-conversie van de DAB-conversie product zich ophoopt, vervormt de organellen en ontsnapt in het cytosol (figuur 2C). De voorbereidingen verschijnen als zwarte structuren in elektronenmicroscopie, met weinig waarneembare morfologie.
We hebben de techniek in verschillende preparaten, met inbegrip neuromusculaire verbindingen van Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, zebravis (Danio rerio) en de kikker (Rana pipiens en Rana esculenta). We hebben ook de gebruikte techniek in gekweekte cellen, met inbegrip van gekweekte neuronen en neuro-endocriene cellen. Het kan ook met succes gebruikt worden in gezuiverde synapsen van rattenhersenen (synaptosomes). Daarom verwachten we dat de techniek die gebruikt mag worden in de meeste preparaten die vesiculaire membraan opname te gebruiken.
De techniek is het de meest gevoelige techniek tot nu toe bij het bepalen van de positionering en de morfologie van endocytosed organellen. Het werd gebruikt om de exacte locatie van recent endocytosed organellen, met inbegrip van specifieke fysiologische zwembaden van blaasjes 5,6,7,8 te bepalen. Het is ook gebruikt bij het bepalen van het aantal en de morfologie van de organellen in de recycling pad zie bijvoorbeeld 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
