Summary
FM色素は、シナプスのダイナミクスの理解に非常に貴重な助けとなった。 FMSは、通常、異なる刺激条件の中に蛍光顕微鏡下で続いている。しかし、電子顕微鏡と組み合わせてFM色素の光変換は、シナプスboutonsで、他の超微細構造のコンポーネント間で、明確なシナプス小胞プールの可視化が可能になります。
Abstract
形質膜（エキソサイトーシス）とシナプス小胞の融合は、神経伝達物質の放出と神経細胞のコミュニケーションに必要なステップです。彼らは新しいエキソおよびエンドサイトーシスのサイクル（小胞のリサイクル）を受けるまで、小胞はその後、形質膜（エンドサイトーシス）から取得し、神経終末内の小胞の一般的なプールと一緒にグループ化されます。これらのプロセスは、電子顕微鏡、電気生理学的記録、アンペロメトリーとキャパシタンスの測定など、さまざまな手法を用いて研究されている。重要なのは、最後の二十年の間に蛍光標識したマーカーの数は、光学技術は、そのリサイクルのダイナミクスに小胞を追跡できるように、浮上した。最も一般的に使用されるマーカーの一つは、スチリルまたはFM色素1であり、構造的に、すべてのFM色素は親水性の頭部と芳香環と1つまたは複数の二重結合（図1B）を介して接続親油性尾が含まれています。小胞のプールをラベル付けするために古典的なFM色素の実験は、神経の刺激（電気的または高K +の）中に色素と（図1Ai）準備の入浴で構成されています。これは最近、エンドサイトーシス小胞（図1A I - III）に小胞のリサイクルと染料のその後のロードを誘発する。染料、色素フリーバスの刺激の第二ラウンドで小胞をロードした後にエキソサイトーシスを介してFMのリリース（図1A IV - V）、蛍光強度の減少（脱色）を監視し続けることができますプロセスの引き金となるでしょう。
FM色素が小胞のリサイクルの分野に大きく貢献しているが、それは従来の蛍光顕微鏡を使用して、個々の小胞の正確な局在や形態を決定することはできません。また、光変換を介して、電子顕微鏡を用いてエンドサイトーシスのマーカーとして使用する方法をFM色素そのため、我々はここで説明する。光電変換技術は、強烈な照明下での活性酸素種を生成する蛍光色素のプロパティを利用している。蛍光標識された調製物は、ジアミノベンジジン（DAB）を含む溶液に浸漬し、点灯されています。色素分子によって生成される反応種は暗い外観を持っているし、簡単に電子顕微鏡2,3で区別することができる安定した、不溶性の沈殿物を形成するDABを、酸化する。 DABにのみ蛍光分子（活性酸素種は短命であるため）のすぐ近くに酸化されるように、テクニックだけ蛍光標識構造は電子密度の高い沈殿物を含むとしていることを保証します。テクニックは、このように積極的に細胞内小器官のリサイクルの正確な位置と形態の研究をすることができます。
Protocol
キイロショウジョウバエ神経筋接合部の1）準備（NMJ）
- 標準ショウジョウバエ生理食塩水を（130 mMのNaCl、36 mMスクロース、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、5mMのHepes緩衝液、pH 7.3 4準備。
- 生理食塩水（1.1）の準備を細かく分析。ショウジョウバエの幼虫は、Sylgard皿に背側を上向きにしてpinedされ、背側には長手方向の切片であり、そして内臓は削除されます。準備は、引き伸ばされ、pinedれる。いくつかの腹側の筋肉は、使用することができます。
2）刺激とFM染色
- 漂白からFM染料を保護するために、暗い場所でもすべて、次の手順を実行することをお勧めします。
- 神経の化学的刺激の場合は、高カリウムバッファーが使用されます。塩化カリウムの90 mMのとFM1 - 43色素の10μMを含む（1.1参照）ショウジョウバエ生理食塩水を準備します。光から保護ソリューションをキープ。
- バス、室温で1分間、事前に準備されたバッファと準備。
- 細胞外FM1 - 43色素を除去するために標準のショウジョウバエ生理食塩水（1.1）で洗浄する。固定するために急速に進んでください。
3）固定
- 室温で45分間リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2.5％グルタルアルデヒドを有する製剤バス。形態学的特徴の良い保全のために、グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドが好ましい。
- PBSで1回洗浄し、その後NH 4 Clの100mMのに15分間水没の準備を残す。このステップは、残りのグルタルアルデヒド固定液の遊離アルデヒド基をクエンチするために行われます。
- 通常のPBSでNH 4 Cl溶液を洗い流す。
4）光変換
- 4℃で30分間NMJの準備をインキュベートしますPBSでCは、ジアミノベンジジン（DAB）の1.5mgのML - 1を含む。
- 蛍光顕微鏡下でサンプルを置きます。比較的低倍率の水浸対物レンズ（20倍0.5 NA）を用いて蛍光シグナルを検出し、フォーカス。
- FMの染料は、（図1C）、完全に漂白されるまでの最大ランプ強度とサンプルを照らす。光変換が発生したかどうかを制御するために、FMの染料漂白段階の前後に透過光の下にサンプルで確認することをお勧めします。光変換が行われる場合、暗褐色の沈殿物が（図1C）が期待される。照明時間は、準備にDABの浸透時にも、照明の強さとに応じて、変数です。ほとんどの準備のために、我々は20倍の対物レンズを用いて時〜30〜45分の照射時間が最適であることがわかった。短いイルミネーション期間は、より高い倍率の目標（60倍）に使用されます。
- 照明のために我々は、後方散乱光を収集し、そのため全体の強度を増加させるバックミラーを、含んでいるランプハウジングと、水銀ランプを使用することを好む。
5）EMのサンプルを処理
- Osmication
- 水の木の量のオスミウム四酸化（サンプルあたり約300μL）の一冊で解決策を準備。四酸化オスミウムを使用して作業は手袋とアイアイの保護装置を使用して、フードの下で行う必要があります。
- 室温で1時間四酸化オスミウム溶液（フードの下で）の準備をインキュベートする。
- PBSで洗う（4-5回5分）と清浄なガラスのフラスコに各サンプルを移す。
- 脱水
- 30、50、70 90、95およびエタノールの100％を含む別の溶液を調製。
- 5分間、各サンプルに30％エタノール1 mlを追加します。
- 5分間の各サンプルに50％エタノール1 mlを追加します。
- 5分間、各サンプルに70％エタノール1 mlを追加します。
- 5分間、各サンプルに90％エタノール1 mlを追加します。
- （3倍を繰り返す）5分間、各サンプルに95％エタノール1 mlを追加します。
- （3倍を繰り返す）5分間、各サンプルに100％エタノール1 mlを追加します。
- 埋め込みとその後の処理
- エタノールの一冊とエポン樹脂の1ボリュームを混在させる。連続回転の下準備（2-4時間）に追加します。
- オープンフラスコで100％エポンで準備を置き、残りのエタノールを蒸発させる（4-6時間）。
- 36時間60℃で金型の準備を置きます。
- 電子顕微鏡の処理。標準ultramicrotomyの手順を使用して、50〜80 nmの薄いセクションで準備を処理します。
- 電子顕微鏡イメージング
- 製剤は、従来のEMの手順を用いて結像される。
6）代表結果
期待した結果が図1Cと図2に概説されています。仲間の形成における照明の手続の結果蛍光と透過イメージングの両方で表示されるWNのDABの沈殿物、。照明時の最初のオカレンスは、FM色素の染色に関連付けられている蛍光の消失です。アルデヒド系固定液により誘発されるバックグラウンドの蛍光は、対照的に、実験を通して目に見えるようになります。漂白は、照明の開始後〜10〜20分で一般的に行われます。一般的には光電製品は、この時点で観察することはできません。
照明は継続すべきである、と〜10分後の製剤は、それは同時には行われませんなぜDAB降水量とFM色素が漂白不明であるDAB蓄積による茶色の色調（図1C IV）に変わります、それは、その比較的大きな可能性があります酸化DABの量は、凝集し沈殿する前に蓄積する必要があるため、この反応は、漂白工程よりも遅いということ。 DABの降水量はおそらく不完全であるとして、この段階では、しかし、準備には、電子顕微鏡の処理のための準備ができていません。我々は準備（シナプス前神経終末が）完全な変換を示す暗褐色（または黒色）の色を、想定している間に、5〜10分長く待つことを好む。準備の一般的な表面のわずかな変換（例えば、神経筋接合部における筋線維のは）この段階で観察することができます。それはおそらく自家蛍光（および/または固定液蛍光）により誘発されるDABの変換に関連して、そしてそれは、プロシージャに有害ではない。
準備をして電子顕微鏡用に処理され、そしてダーク（ラベル）小胞の有無をチェックする必要があります。我々は5,6の前に説明したように、これらの小胞は、非標識のものよりもはるかに高密度であるため、容易に（図2B）区別されます。よく小胞の異なる種類を区別する機会を増やすために、セクションのないコントラスト増強後の染色は、（無酢酸ウラニルまたはクエン酸鉛で染色）実行されるべきである。オスミウム染色は、ほとんどの携帯電話の要素を観察するのに十分である、ととしてではないDABの沈殿物として暗い。
図1：FM染料、それは光変換のために使用します 。 （A）刺激下でFM色素を使用して小胞をロードするとdistainingのための古典的な実験の手順を表します。 （ 私は ）バッファが含まれているFM色素でサンプルをインキュベートする。 （ⅱ）FM色素の存在下で小胞融合を誘導するために（電気的または化学的）刺激。 （ⅲ）刺激後のサブシーケンスのエンドサイトーシスは細胞外のバッファに残っているFM色素で、いくつかの小胞をロードします。 （ⅳ）バッファーで洗浄することにより細胞外FM色素を交換してください。 （V）新しい刺激がロードされた小胞は、エキソサイトーシスの際、FM色素を解放するために誘発される。 （B）回路図は、FM1 - 43色素のヘッド、ブリッジとテールを示している。 ショウジョウバエ NMJの光電変換実験の（C）の例。 （ⅰ）外部色素分子と固定し、洗浄、FM1 - 43でNMJをロードした後、神経末端の蛍光は、従来の落射蛍光顕微鏡（63x）で観察することができます。 （II - III）の連続照明下では色素が完全に漂白です。 （ⅳ）照明が続くと、黒い色は、ジアミノベンジジンの析出による表示されます。スケールバーは10μmを表す。
図2：photoconvertedサンプルのEMの例（A）画像はシナプス小胞を含む神経端末を示していますが、それらのphotoconvertedであり、これは組織に十分な照明や 貧しいジアミノベンジジンの浸透を持っていないことが原因である可能性があります。 （B）FM光変換を経ていくつかの暗い（充填）小胞とシナプスブートン。は小胞やオルガネラは区別がない全体的な暗いターミナルの照明の結果の（C）超過。スケールバーは200nmを表す。
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Discussion
いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。
- DABのインキュベーションは、準備の徹底した洗浄と急冷後に行ってください。そうでなければ非反応グルタルアルデヒドは、DABと相互作用し、（通常は高密度電子ではないフラットな結晶の形で）その降水量が発生します。この降水量が豊富に行われる準備は、電子顕微鏡のためまれに使用できます。
- 照明時間は、異なる照明時間を持ついくつかの同一の準備をテストすることにより、最適化する必要があります。我々の経験では、最適な変換（図2B）は、約5分（例えば、照明の開始後35〜40分）の時間枠で達成されます。不十分な照明（図2A）は、標識された細胞小器官の欠如、および/または部分的に標識された細胞小器官（例えば、その体積の半分だけで、DABを含むように表示される小胞など）によって特徴付けられる。長い照明は、対照的に、オーバー変換の結果はDABの変換製品は、細胞質ゾル（図2C）に細胞小器官とエスケープを歪め、蓄積。準備はほとんど観察形態で、電子顕微鏡の黒い構造として表示されます。
我々は線虫Caenorhabditis elegans、キイロショウジョウバエ 、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）とカエル（ ヒョウガエルとヨーロッパトノサマガエル ）から神経筋接合部を含むいくつかの準備、のテクニックを使用している。我々はまた、培養神経細胞と神経内分泌細胞を含む培養細胞、のテクニックを使用している。また、ラットの脳（シナプトソーム）からシナプスを精製で問題なく使用できます。したがって、我々は技術は小胞の膜の取り込みを使用するほとんどの製剤で使用可能であることを期待しています。
技術はそれがエンドサイトーシス細胞小器官の位置と形態を決定する際に、これまでで最も敏感なテクニックです。それは小胞5,6,7,8の特定の生理的なプールを含む最近のエンドサイトーシス細胞小器官、の正確な位置を決定するために使用されていました。それは、例えば9,10のために参照してリサイクルの経路で細胞小器官の数と形態を決定する際にも使用されています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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