Summary
FM boyalar sinaptik dinamiklerin anlaşılmasına çok değerli yardım edilmiştir. FMS normalde farklı stimülasyon sırasında floresan mikroskop altında takip edilmektedir. Ancak, elektron mikroskobu ile kombine FM boyaların Fotoçevrim sinaptik BOUTONS, diğer ultrastrüktür bileşenleri arasında, farklı sinaptik vezikül havuzları görselleştirme sağlar.
Abstract
, Plazma zarı (ekzositoz) ile sinaptik veziküllerin füzyon nörotransmitter salınımı ve nöron iletişim içinde gerekli bir adım. Veziküller daha sonra yeni bir exo-endositoz döngüsü (vezikül geri dönüşüm) geçmesi kadar, plazma zarı (endositoz) alınır ve sinir terminali içinde vezikül genel havuzu ile birlikte gruplandırılmıştır. Bu süreçler, elektron mikroskobu, elektrofizyoloji kayıtları, amperometri ve kapasite ölçümleri gibi çeşitli teknikler kullanılarak çalışılmıştır. Önemlisi, son yirmi yılda, floresan ile işaretlenmiş belirteçlerin bir dizi ortaya optik teknikleri, geri dönüşüm dinamikleri veziküller izlemenize olanak sağlayacak. En sık kullanılan belirteçler Bir styryl veya FM boya 1; yapısal, tüm FM boyalar Hidrofilik bir baş ve aromatik bir halka ve bir veya daha fazla çift bağ (Şekil 1B) ile bağlı bir lipofilik kuyruk içerir. Veziküller bir havuz etiket klasik FM boya deneyi sinirin uyarılması sırasında boya ile hazırlanması (Şekil 1Ai) banyo (elektrik veya yüksek K +) oluşur. Bu son endocytosed veziküller (Şekil 1A i-iii) vezikül boya, geri dönüşüm ve sonraki yükleme neden olur. Boya, boya banyosuna stimülasyon ikinci turda veziküller yükledikten sonra ekzositoz yoluyla FM sürümü (Şekil 1A iv-v), floresan yoğunluğu azaltmak (destaining) izleme ile takip edilebilir süreci tetikleyebilir.
FM boyalar vezikül geri dönüşüm alanında büyük katkıları olmasına rağmen, geleneksel floresan mikroskobu kullanarak, bireysel veziküller tam lokalizasyonu ya da morfolojisi belirlemek mümkün değil. Bu nedenle, biz burada Fotoçevrim yoluyla nasıl FM boyalar, elektron mikroskobu kullanılarak endositik belirteç olarak da kullanılabilir. Açıklar. Fotoçevrim tekniği, yoğun aydınlatma altında reaktif oksijen türleri oluşturmak için floresan boyaların özelliği patlatır. Floresan etiketli hazırlıkları diaminobenzidin (DAB) içeren bir çözüm batık ve ışıklı. Boya molekülleri tarafından oluşturulan reaktif türler, karanlık bir görünüme sahiptir ve elektron mikroskobu 2,3 kolayca ayırt edilebilir, istikrarlı, çözünmez çökelti oluşturur DAB, okside . DAB sadece floresan moleküller (reaktif oksijen türleri kısa ömürlü olduğu gibi) hemen yakınında okside olduğu gibi, bu teknik sadece floresan etiketli yapıları elektron-yoğun bir çökelti içeren olmasını sağlar. Bu teknik böylece aktif organelleri geri dönüşüm tam yeri ve morfolojisi çalışma sağlar.
Protocol
1) Hazırlık Drosophila melanogaster nöronal kas kavşağı (NMJ)
- Standart Drosophila tuzlu su hazırlayın (130 mM NaCl, 36 mM sukroz, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Serum fizyolojik (1.1) hazırlık parçalara ayır. Drosophila larvaları bir Sylgard tabak içinde dorsal yan pined; dorsal tarafına uzunlamasına kesitli ve iç organlar çıkarılır. Hazırlık sonra gergin ve pined. Birkaç karın kasları daha sonra kullanılabilir.
2) Uyarılma ve FM boyama
- Ağartma FM boyalar korumak amacıyla, düşük ışık koşullarında aşağıdaki adımları yapmanız tavsiye edilir.
- Sinirleri kimyasal uyarımı için, yüksek oranda potasyum tampon kullanılır. Drosophila salin (1.1), 90 mM KCl FM1-43 boya 10 mcM içeren hazırlayın. Işıktan koruyarak çözüm tutun.
- Oda sıcaklığında 1 dakika için önceden hazırlanmış bir tamponu ile hazırlık Banyosu.
- Ekstrasellüler FM1-43 boya kaldırmak için standart Drosophila serum fizyolojik (1.1) ile yıkayın. Fiksasyon hızla devam edin.
3) Sabitleme
- Fosfat tamponlu salin (PBS) oda sıcaklığında 45 dakika süreyle% 2.5 lik gluteraldehit ile hazırlık Hamamı. Morfolojik özellikleri iyi korunması için, glutaraldehid paraformaldehid tercih edilir.
- PBS ile bir kez yıkayın ve sonra 15 dakika süreyle 100 mM NH 4 Cl batık hazırlık bırakın . Bu adım, kalan glutaraldehid fiksatif serbest aldehit grupları gidermek için yapılır.
- NH 4 Cl çözüm normal PBS ile yıkayın.
4) Fotoçevrim
- 4 NMJ hazırlık az 30 dakika boyunca inkübe ° C PBS içinde diaminobenzidin (DAB), 1.5 mg ml-1 içeren.
- Floresan mikroskop altında örnek yerleştirin. Nispeten düşük büyütme suya daldırma objektif (20x 0.5 NA) kullanarak floresan sinyali bulun ve odaklanır.
- FM boya tamamen beyazlatılmış (Şekil 1C) kadar maksimum lamba yoğunluğu ile örnek aydınlatın. Fotoçevrim oluştu olup olmadığını kontrol etmek için, iletim ışığı altında FM boya adım beyazlatma öncesi ve sonrası örnek kontrol edilmesi tavsiye edilmektedir. Fotoçevrim yer alıyorsa, koyu kahverengi bir çökelti (Şekil 1C) bekleniyor. Aydınlatma süresi de hazırlık içine DAB penetrasyon üzerine aydınlatma gücü ve bağlı olarak değişkendir. En hazırlıkları için, 20x objektif kullanırken ~ 30-45 dakika aydınlatma süreleri optimum olarak bulundu. Kısa aydınlatma süreleri, yüksek büyütme hedefleri (60x) için kullanılır.
- Aydınlatma için geri saçılan ışık ışınları toplar ve bu nedenle toplam yoğunluğunu artırır arka ayna içeren bir lamba konut, bir cıva lambası kullanmayı tercih.
5) EM için örnek İşleme
- Osmication
- Bir hacim su ağacın hacmi osmium tetroksit (örnek başına yaklaşık 300 ul) ile bir çözüm hazırlayın. Osmiyum tetroksit kullanarak, eldiven ve aye koruma araçları kullanarak başlık altında yapılması gerekir. Çalışma
- Osmiyum tetroksit çözüm olarak hazırlanması (Kaputun altında) oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
- PBS (4-5 kez 5 dakika) ile iyice yıkayın ve temiz bir cam şişeyi her örnekler aktarmak.
- Kurutma
- 30, 50, 70 90, 95 ve% 100 etanol içeren ayrı çözümler hazırlayın.
- 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 30 etanol ekleyin.
- 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 50 etanol ekleyin.
- 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 70 etanol ekleyin.
- 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 90 etanol ekleyin.
- (3x tekrar) 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 95 etanol ekleyin.
- (3x tekrar) 5 dakika boyunca her bir örnek için 1 ml% 100 etanol ekleyin.
- Gömme ve daha fazla işlem
- EPON reçine bir hacim etanol ile 1 hacim karıştırın. (2-4 saat) sürekli dönme altında hazırlanması ekleyin.
- % 100 EPON açık şişeler hazırlık yerleştirin, kalan etanol buharlaşmasına izin (4-6 saat).
- 60 ° C'de 36 saat için hazırlık kalıplara yerleştirin.
- Elektron mikroskobu işleme. Standart ultramicrotomy prosedürleri kullanarak, 50-80 nm ince bölümlerde hazırlık süreci.
- Elektron mikroskobu görüntüleme
- Hazırlık geleneksel EM prosedürlerini kullanarak görüntülü.
6) Temsilcisi Sonuçlar
Beklenen sonuçlar Şekil 1C ve 2 de özetlenmiştir. Bro oluşumunu aydınlatma işlemi sonuçlarıwn DAB çökelti, floresan ve transmisyon görüntüleme hem de görünür olacaktır. FM boya boyama ile ilişkili floresan aydınlatma sırasında ilk geçtiği ortadan kalkması. Aldehit fiksatif tarafından uyarılan eşiğe, aksine, deney boyunca görünür olacaktır. Ağartma ~ aydınlatma başladıktan sonra 10-20 dakika tipik olarak yer alır. Genellikle hiçbir Fotoçevrim ürün bu noktada gözlenebilir.
Aydınlatma devam edilmelidir ve hazırlıkları ~ 10 dakika sonra aynı anda yer almayan neden DAB yağış ve FM boya kasar belirsiz DAB birikimi nedeniyle kahverengi bir gölge (Şekil 1C iv) dönecek, ki nispeten yüksek mümkün okside DAB miktarı toplama ve yağış önce birikmesine ihtiyaç duyar ve bu nedenle bu reaksiyon ağartma işlemi daha yavaş. Bu aşamada, DAB yağış, büyük olasılıkla eksik Bununla birlikte, hazırlanması, elektron mikroskobu işlem için hazır değildir. Biz hazırlanması sırasında (presinaptik sinir terminal) tam bir dönüşüm gösteren bir koyu kahverengi veya siyah renk, varsayar, 5-10 dakika daha uzun süre beklemek tercih ederler. Genel yüzey hazırlama (örneğin, nöromüsküler bileşke kas lifleri) hafif bir dönüşüm bu aşamada görülebilir. Büyük olasılıkla otofloresans (ve / veya fiksatif floresan) ile DAB uyarılan bir dönüşüm için ilgili ve bu işlem için zararlı değildir.
Sonra elektron mikroskobu için hazırlık işlenir ve koyu (etiketli) veziküllerin varlığı için kontrol edilmelidir. 5,6 önce gösterdiğimiz gibi, bu veziküller olmayan etiketli olanlardan daha çok yoğun ve bu nedenle kolayca ayırt edilir (Şekil 2B). Veziküller farklı türleri ayırt şansını artırmak için, bölümden hiçbir kontrast tutan yazılan boyama (hiçbir uranil asetat ve kurşun sitrat boyama) yapılabilir; osmiyum boyama en hücresel elemanları gözlemlemek için yeterli ve gibi değildir DAB çökelek gibi karanlık.
Şekil 1: FM boyalar ve Fotoçevrim için kullanılacak. (A) uyarımı altında FM boya kullanarak veziküller yükleme ve distaining için klasik bir deney adımları temsil etmek. (I) FM boya içeren tampon örnek inkübe edin. (Ii) FM boya varlığı vezikül füzyon ikna etmek için (elektriksel ya da kimyasal) geliştirin . (Iii) stimülasyon sonra altdizi endositoz ekstrasellüler tampon hala mevcut FM boya ile bazı veziküller yük olacaktır. (Iv) tamponu ile yıkanarak ekstraselüler FM boya değiştirin. (V) yeni bir stimülasyon ekzositoz üzerine onların FM boya serbest yüklü veziküller neden olacaktır. (B) Şematik başkanı, köprü ve FM1-43 boya kuyruk gösteriyor. (C), Drosophila NMJ bir Fotoçevrim deney örneği . (I) dış boya molekülleri ve sabitleme yıkama FM1-43, NMJ yükledikten sonra, bir sinir terminal floresan geleneksel bir Epifloresans mikroskobu (63x) ile tespit edilebilir. (Ii-iii) sürekli aydınlatma altında boya tamamen beyazlatılmış. (Iv) aydınlatma devam ederken, siyah renk diaminobenzidin yağış nedeniyle görünür. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder.
Şekil 2: photoconverted EM photoconverted örnekleri örnekleri (A) görüntü sinaptik vezikül içeren bir sinir terminal gösterir, ama bu, yeterli aydınlatma veya fakir doku diaminobenzidin penetrasyonu olmaması neden olabilir . (B) FM Fotoçevrim geçti birkaç koyu (dolu) veziküller Synaptic bouton. (C), herhangi bir vezikül veya organelleri ayırt genel bir karanlık terminal aydınlatma sonuçları Fazla . Ölçek çubuklar 200 nm temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birkaç kritik adımlar dikkate alınmalıdır:
- DAB inkübasyon sadece hazırlıkları iyice yıkama ve soğutma sonra yapılmalıdır. Aksi takdirde olmayan tepki glutaraldehid DAB ile etkileşim ve yağış yoğun elektron değildir şeklinde düz kristaller, (genellikle) neden olacaktır. Bu yağış bol bol yer alır elektron mikroskobu için hazırlıklar nadiren kullanılabilir.
- Aydınlatma kez farklı aydınlatma kez birkaç özdeş hazırlıkları test optimize edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, optimal dönüştürme (Şekil 2B), yaklaşık 5 dakikalık bir zaman penceresi (örneğin, 35 ile aydınlatma başladıktan sonra 40 dakika) elde edilir. Yetersiz aydınlatma (Şekil 2A) etiketli organeller eksikliği ve / veya kısmen etiketli organeller (kendi hacminin sadece yarım DAB içeren görünen veziküller gibi) ile karakterizedir. Uzun aydınlatma, kontrast, DAB dönüşüm ürün birikir dönüşüm, sonuçları organelleri sitoplazmada (Şekil 2C) ve kaçar bozan. Hazırlıkları biraz gözlemlenebilir morfolojisi, elektron mikroskobu siyah yapıları olarak görünür.
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Zebra balığı (Danio rerio) ve kurbağası (Rana pipiens ve Rana esculenta) nöromüsküler kavşak dahil olmak üzere çeşitli hazırlıklar, tekniği kullanılmıştır. Ayrıca kültür nöronlar ve nöroendokrin hücreler de dahil olmak üzere kültür hücreleri, tekniği kullanılmıştır. Ayrıca sıçan beyin (sinaptozomlarda) sinapsların saflaştırılmış başarıyla kullanılabilir. Bu nedenle, teknik veziküler membran alımı kullanan en preparatlar kullanılabilir olması için bekliyoruz.
Bu teknik, endocytosed organellerin konumlandırma ve morfoloji belirlenmesinde bugüne kadar en hassas bir tekniktir. Bu son endocytosed organelleri vezikül 5,6,7,8 belirli fizyolojik havuzları da dahil olmak üzere tam yerini belirlemek için kullanılmıştır. Örneğin 9,10 için geri dönüşüm yolu organellerin sayı ve morfolojisi belirlenmesinde de kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
