Summary
FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.
Abstract
플라즈마 막 (exocytosis)와 시냅스 vesicles의 융합은 신경 전달 물질 릴리스와의 연결을 통신에 필요한 단계입니다. 그들이 새로운 엑소과 endocytosis주기 (소포 재활용)을 받아야 때까지 vesicles 그런 다음, 플라즈마 막 (endocytosis)에서 검색 및 신경 터미널 내에 vesicles의 일반 수영장과 함께 그룹화됩니다. 이러한 프로세스는 이러한 전자 현미경, 전기 생리학 녹음, amperometry 및 커패시턴스 측정과 같은 기술을 사용하여 다양한 연구하고 있습니다. 중요한 것은 지난 20 년간 동안 찬란 분류 마커의 숫자는 광학 기술들이 재활용 역학 vesicles를 추적할 수있게 나타났다. 가장 일반적으로 사용되는 마커 중 하나는 styryl 또는 FM 염료 1, 구조적, 모든 FM 염료는 친수성 머리와 아로마 링과 하나 이상의 이중 채권 (그림의 1B)을 통해 연결된 lipophilic 꼬리가 포함되어 있습니다. vesicles의 수영장 레이블 클래식 FM 염료의 실험 (전기 또는 높은 K +와 함께) 신경의 자극 동안 염료와 준비 (그림 1Ai)를 목욕으로 구성되어 있습니다. 이것은 최근 endocytosed vesicles (그림 1A I - III)에 소포 재활용 및 염료의 후속 로딩을 유도. 염료, 염료없는 욕조에서 자극의 두 번째 라운드로 vesicles 로딩 후 exocytosis를 통해 FM 릴리스 (그림 1A IV - V), 형광 강도 감소 (destaining)를 모니터링하여 다음 수있는 프로세스를 실행하는 것입니다.
FM 염료는 소포 재활용 분야에 크게 공헌했지만, 그것은 종래의 형광 현미경을 사용하여 개별 vesicles의 정확한 지방화이나 형태를 결정하는 것은 불가능합니다. 그런 이유로, 우리는 어떻게 FM 염료가 photoconversion 통해 전자 현미경을 사용하여 endocytic 마커로도 사용될 수 있습니다 여기에 설명합니다. photoconversion 기술은 강한 조명 아래의 반응 산소 종을 생성하는 형광 염료의 속성을 이용. 찬란 분류 준비는 diaminobenzidine (DAB)을 포함하는 솔루션에 빠져들와 조명입니다. 염료 분자에 의해 생성되는 반응 종족은 어두운 모습을 쉽게 전자 현미경 2,3로 구분할 수 안정, 불용성 침전물을 형성 DAB를 산화. DAB에만 형광 분자 (반응 산소 종은 단기 살고 있으므로)의 바로 근처에 산화되기 때문에, 기술은 찬란 표시된 구조는 전자 - 밀도 침전물을 포함 될 것을 보장합니다. 기술은 따라서 적극적으로 organelles을 재활용의 정확한 위치와 형태의 연구를 수 있습니다.
Protocol
Drosophila melanogaster의 연결 근육질 교차로 1) 준비 (NMJ)
- 표준 Drosophila 호수 (130 MM NaCl, 36 MM의 자당, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 5 MM Hepes, 산도 7.3 4 준비합니다.
- 식염 (1.1)의 준비를 해부하다. Drosophila의 애벌레는 Sylgard 접시에 지느러미 측면까지 pined이며 지느러미쪽에 세로 sectioned이며, 내장은 제거됩니다. 준비 나서 뻗어와 pined 있습니다. 여러 복부 근육 그런 다음 사용할 수 있습니다.
2) 자극과 FM 염색법
- 표백에서 FM 염료를 보호하기 위해, 낮은 조명 조건에있는 모든 다음 단계를 수행하는 것이 좋습니다입니다.
- 신경의 화학적 자극에 대한 높은 칼륨 버퍼가 사용됩니다. KCl 90 MM 및 FM1 - 43 염색 10 μm의를 포함하는 Drosophila 호수 (1.1 참조) 준비합니다. 조명으로부터 보호 솔루션을 유지.
- 실온에서 1 분 이전에 준비를 버퍼로 준비 목욕탕.
- 세포외 FM1 - 43 염료를 제거하는 표준 Drosophila 호수 (1.1)로 씻으십시오. 고정으로 급속하게 진행합니다.
3) 고정
- 실온에서 45 분간 인산염 버퍼 호수 (PBS)에 2.5 %의 글루 타 알데히드와 함께 준비 목욕탕. 형태학의 특징을 잘 보존 들어, 글루 타 알데히드는 paraformaldehyde로 선호합니다.
- PBS로 한번 씻어 후 NH 4 Club 호텔의 100 밀리미터에서 15 분 잠수 준비를 두십시오. 이 단계는 남아있는 글루 타 알데히드 정착액의 무료 알데히드 그룹을 담금질하기 위해 수행됩니다.
- 정상 PBS로 NH 4 Club 호텔 솔루션을 씻으십시오.
4) Photoconversion
- 4 30 분 NMJ 준비를 품어 ° PBS에서 C는 diaminobenzidine (DAB)의 1.5 MG ML - 1을 포함.
- 형광 현미경 샘플을 위치. 상대적으로 낮은 배율 물 침지 목표 (20x 0.5 NA)를 사용하여 형광 신호를 찾아 중점을두고 있습니다.
- FM의 염료가 (그림 1C) 완전히 표백 때까지 최대 램프 강도와 샘플을 조명. photoconversion가 발생하면 제어하려면, FM 염료 표백 단계 이전과 이후 전송 조명 아래의 예제에서 확인하는 것이 좋습니다. photoconversion이 이루어지는 경우, 어두운 갈색 침전물은 (그림 1C) 예정입니다. 조명 시간은 준비에 DAB 보급에 따라 또한 조명의 강도와에 따라 변수이다. 대부분의 준비를 위해 20x 목표를 사용하는 경우 ~ 30-45분의 조명 시간이 최적으로 발견했습니다. 짧은 조명 기간은 높은 배율의 목표 (60x)에 사용됩니다.
- 조명을 위해 우리는 백 흩어진 빛의 광선을 수집하고, 따라서 총 강도를 증가 돌려 거울을 포함하는 램프 주택, 수은 램프를 사용하는 것을 선호합니다.
5) EM에 대한 샘플을 처리
- Osmication
- 물이 나무 볼륨에 오스뮴 tetroxide (샘플 당 약 300 μl) 중 하나 볼륨있는 솔루션을 준비합니다. 오스뮴의 tetroxide를 사용하는 것은 장갑 알겠 보호 장비를 사용하여 후드 아래에 이루어져야합니다. 작업
- 실온 (후드 아래)에서 1 시간 오스뮴의 tetroxide 솔루션의 준비를 품어.
- PBS (4-5 회 5 분)와 함께 광범위하게 씻고 깨끗한 유리 플라스크에 각각의 샘플을 전송합니다.
- 탈수
- 30, 50, 70 90, 95 및 에탄올의 100 %를 포함하는 별도의 솔루션을 준비합니다.
- 5 분 각각의 샘플을 30 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 5 분 각 샘플의 50 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 5 분 각각의 샘플을 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 5 분 각각의 샘플을 90 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- (배를 반복) 5 분 동안 각각의 샘플을 95 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- (배를 반복) 5 분 동안 각 샘플에 100 % 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 퍼가기 및 추가 처리
- 에탄올 중 하나 볼륨 Epon 수지 1 볼륨을 섞는다. 연속 회전 (2~4시간)에서 준비에 추가합니다.
- 오픈 flasks 100 % Epon에 준비를 놓고, 나머지 에탄올이 증발하도록 (4-6 시간).
- 36 시간 동안 60 ° C에서 금형의 준비를 놓습니다.
- 전자 현미경 처리. 표준 ultramicrotomy 절차를 사용하여 50-80 nm의 얇은 부분의 준비를 처리합니다.
- 전자 현미경 이미징
- 준비는 종래의 EM 절차를 사용하여 몇 군데 있습니다.
6) 대표 결과
예상 결과는 그림 1C 2에 요약되어 있습니다. 형제의 형성에 조명 절차 결과형광 및 전송 영상 모두에서 표시됩니다 wn의 DAB의 침전물. 조명 중에 첫 번째 사건은 FM 염색의 얼룩과 관련된 형광의 실종이다. 알데히드 정착액에 의해 유도된 배경 형광은 반대로, 실험을 통해 확인할 수 있습니다. 표백은 조명의 시작 후 ~ 10~20분에서 일반적으로 이루어진다. 일반적으로 더 photoconversion 제품이 시점에서 관찰 수 없습니다.
조명은 계속되어야하고, ~ 10 분 후에 준비가 그것은 동시에 자리를하지 않는 이유 DAB 석출 및 FM 염료는 표백 불분명 DAB 축적으로 인해 갈색 그늘 (그림 1C IV)를 설정하는 것이며 그것은 비교적 큰 수 있습니다 산화 DAB의 금액은 집합과 침전하기 전에 축적해야하고, 따라서이 반응은 표백 과정을보다 느린입니다. DAB의 석출 가능성이 불완전으로이 단계에서는, 그러나, 준비, 전자 현미경 처리를위한 준비가되지 않습니다. 우리는 그 동안 준비 (presynaptic 신경 터미널) 완료 변환을 나타내는 어두운 갈색 (또는 검은색) 색상, 가정, 5-10분 이상 기다려야하는 것을 선호합니다. 준비의 일반적인 표면의 약간의 전환 (예를 들어, 신경근육학 교차점에있는 근육 섬유의)은이 단계에서 볼 수 있습니다. 그것은 가능성이 높습니다 autofluorescence (및 / 또는 정착액 형광)에 의해 유도된 DAB의 전환과 관련, 그리고 그것은 프로 시저에 해로운하지 않습니다.
준비 그러면 전자 현미경에 대한 처리이며, 어두운 (레이블) vesicles의 존재를 확인하여야한다. 우리가 5,6하기 전에 보여주는 것처럼, 이러한 vesicles가 아닌 표시된 것들보다 훨씬 밀도 있고, 따라서 쉽게 (그림 2B) 구분합니다. 잘 vesicles의 다른 유형을 구별의 기회를 증가하려면 섹션에 대한 대비를 향상 포스트 얼룩은 (NO uranyl 아세테이트 또는 리드의 구연 산염의 얼룩) 수행되지 않을 것입니다, 오스뮴의 얼룩은 대부분의 세포 요소를 관찰하기에 충분하고, 같이하지 않습니다 DAB의 침전물로 어두운.
그림 1 : FM 염료하고 photoconversion을 위해 사용합니다. (A) 자극하에 FM 염료를 사용하여 vesicles를로드하고 distaining에 대한 고전적인 실험의 단계를 나타냅니다. (I)는 버퍼를 포함하는 FM 염료에 샘플을 품어. (2) FM 색소의 존재에 소포의 융합을 유도하기 위해 (전기 또는 화학적으로) 자극. (3) 자극 후 subsequence의 endocytosis가 세포 버퍼에있는 사람들 FM 색소 몇 가지 vesicles을로드합니다. (IV) 버퍼와 함께 세탁하여 세포 FM 염료를 교체하십시오. (V) 새로운 자극이 exocytosis에 따라 자신의 FM 염료를 공개로드 vesicles을 유발합니다. (B) 도식의 머리, 다리와 FM1 - 43 염료의 꼬리를 보여주는. Drosophila NMJ에 photoconversion의 실험 (C) 예. (I) 외부 염료 분자와 고정을 세척 FM1 - 43와 NMJ를 로딩 후 신경 단말기의 형광은 종래의 epifluorescence 현미경 (63x)로 볼 수 있습니다. (II - III) 지속적인 조명 아래 염료가 완전히 표백됩니다. (4) 조명이 계속되면 검은 색깔은 diaminobenzidine의 침전으로 인해 나타납니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.
그림 2 : EM 그들의 photoconverted 샘플 예제 (A) 이미지 시냅스 vesicles를 포함하는 신경 터미널을 보여줍니다,하지만이 photoconverted되며 이것은 충분한 조명이나 조직에서 가난한 diaminobenzidine의 침투를 가지고 있지으로 인해 발생할 수 있습니다.. (B) FM photoconversion 겪은 여러 어두운 (가득) vesicles와 시냅틱 부통. 더 vesicles 또는 organelles는 구별할 수없는 전반적인 어두운 조명 터미널에서 결과의 (C) 초과. 스케일 바는 200 나노미터를 나타냅니다.
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Discussion
몇 가지 중요한 단계를 고려해야한다 :
- DAB 보육은 준비 철저한 세척과 담금질 후에 실시하여야한다. 그렇지 않은 반응 글루 타 알데히드는 DAB과 상호 작 용할 수 있으며 (일반적으로 고밀도 전자되지 않은 평면 결정의 형태로)의 강수량을 일으킬 것입니다. 이 강수량이 넘치게 이루어지는 준비는 전자 현미경에 대한 거의 사용할 수 있습니다.
- 조명 시간은 다른 조명 시간을 몇 가지 동일한 준비를 테스트하여 최적화해야합니다. 우리의 경험에서 최적의 변환 (그림 2B)은 약 5 분 시간 창 (예 : 35 사이에 40 분 조명의 시작 후)에 이루어진다. 부족 조명 (그림 2A)이 표시 organelles 부족, 및 / 또는 부분적으로 표시된 organelles (예 : 자신의 부피의 절반 밖에에서 DAB를 포함 나타나는 vesicles)에 의해 특징입니다. 긴 조명 반면, DAB 변환 제품이 축적을 통해 변환, 결과는 cytosol (그림 2C)에 organelles과 탈출을 왜곡. 준비가 거의 관찰 형태로, 전자 현미경의 구조 검정색으로 나타납니다.
우리는 Caenorhabditis 엘레간스, Drosophila melanogaster, zebrafish (Danio rerio)와 개구리 (라나 pipiens와라나 esculenta)에서 신경근육학 분기점 등 여러 준비에 기술을 사용해 왔습니다. 우리는 또한 교양 뉴런과 neuroendocrine 세포를 포함하여 교양 세포에서 기술을 사용해 왔습니다. 또한 쥐의 두뇌 (synaptosomes)에서 시냅스를 정화에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 따라서, 우리는 기술이 기공을 갖는 막 이해를 사용하는 대부분의 준비에 사용할 것으로 예상.
기술은 endocytosed organelles의 위치와 형태를 결정 날짜에 가장 민감한 기술입니다. 그것은 vesicles 5,6,7,8의 특정 생리 수영장을 포함한 최근 endocytosed organelles의 정확한 위치를 결정하는 데 사용되었다. 이것은 예를 들어 9,10에 대한 참조 재활용 경로에 organelles의 수와 형태를 결정에도 사용되고 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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