Summary
एफएम रंजक अमूल्य मदद की synaptic गतिशीलता को समझने में किया गया है. एफएमएस अलग उत्तेजना की स्थिति के दौरान सामान्य फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे पीछा कर रहे हैं. हालांकि, एफएम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त रंगों के photoconversion अलग synaptic पुटिका पूल के दृश्य की अनुमति देता है, अन्य ultrastructure घटकों के बीच synaptic BOUTONS में,.
Protocol
1) ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर neuronal पेशी जंक्शन तैयार (NMJ)
- तैयार मानक ड्रोसोफिला खारा (130 मिमी NaCl, 36 मिमी sucrose, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी Hepes, 7.3 पीएच 4.
- खारा (1.1) में तैयारी काटना. ड्रोसोफिला लार्वा पृष्ठीय पक्ष एक Sylgard डिश में pined है; पृष्ठीय पक्ष अनुदैर्ध्य sectioned है, और आंतरिक अंगों को हटा रहे हैं. तैयारी और फिर फैला है pined. कई उदर की मांसपेशियों को फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है.
2) उत्तेजना और एफएम धुंधला
- यह कम प्रकाश स्थितियों में सभी निम्न चरणों करते हैं, के क्रम में विरंजन से एफएम रंगों की रक्षा के लिए उचित है.
- नसों का रासायनिक उत्तेजना के लिए, उच्च पोटेशियम बफर का उपयोग किया है. ड्रोसोफिला (1.1 देखें) खारा तैयार KCl के 90 मिमी और FM1-43 डाई के 10 सुक्ष्ममापी युक्त. समाधान प्रकाश से सुरक्षित रखें.
- स्नान कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पहले से तैयार बफर के साथ तैयारी.
- मानक ड्रोसोफिला खारा (1.1) के साथ धो कोशिकी FM1-43 डाई हटायें. निर्धारण करने के लिए तेजी से आगे बढ़ें.
3) फिक्सिंग
- स्नान फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) में 2.5% glutaraldehyde के साथ कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए तैयारी. Morphological सुविधाओं का अच्छा संरक्षण के लिए है, glutaraldehyde paraformaldehyde के लिए पसंद है.
- पीबीएस के साथ एक बार धो और फिर 4 सीएल राष्ट्रीय राजमार्ग के 100 मिमी में 15 मिनट के लिए जलमग्न तैयारी छोड़ . इस कदम क्रम में शेष glutaraldehyde लगानेवाला के मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझाने किया जाता है.
- राष्ट्रीय राजमार्ग 4 सीएल समाधान सामान्य पीबीएस के साथ बाहर धो लें.
4) Photoconversion
- 4 में 30 मिनट के लिए NMJ तैयारी सेते ° सी पीबीएस में diaminobenzidine (थपका) के 1.5 मिलीग्राम 1 मिलीलीटर युक्त.
- फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे नमूना स्थिति. ढूँढें और फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग कर एक अपेक्षाकृत कम बढ़ाई पानी विसर्जन उद्देश्य (0.5 20x NA) ध्यान केंद्रित.
- अधिकतम दीपक तीव्रता के साथ नमूना रोशन जब तक एफएम डाई पूरी तरह से प्रक्षालित (चित्रा 1C). नियंत्रण अगर photoconversion हुआ है, संचरण प्रकाश के तहत नमूना एफएम डाई कदम विरंजन के पहले और बाद में जांच की सलाह दी जाती है. यदि photoconversion जगह लेता है, एक गहरे भूरे रंग वेग (चित्रा 1C) की उम्मीद है. रोशनी के समय चर रहा है, रोशनी और शक्ति तैयारी में थपका प्रवेश पर भी पर निर्भर करता है. सबसे तैयारी के लिए, हम ~ 30-45 मिनट की रोशनी बार इष्टतम जब एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर पाया. छोटा रोशनी समय उच्च बढ़ाई उद्देश्यों (60x) के लिए उपयोग किया जाता है.
- रोशनी के लिए हम एक दीपक आवास से युक्त एक वापस दर्पण है, जो वापस बिखरे हुए प्रकाश बीम एकत्र, और इसलिए कुल तीव्रता बढ़ जाती है के साथ एक पारा दीपक का उपयोग करें, पसंद करते हैं.
5) EM के लिए नमूना प्रसंस्करण
- Osmication
- पेड़ मात्रा में पानी की आज़मियम tetroxide (लगभग 300 μl नमूना प्रति) की एक मात्रा के साथ एक समाधान तैयार करें. कार्य आज़मियम tetroxide का उपयोग हुड के तहत किया जाना चाहिए, दस्ताने और ऐ सुरक्षा के उपकरण का उपयोग.
- कमरे के तापमान (हुड के अंतर्गत) पर 1 घंटे के लिए आज़मियम tetroxide समाधान में तैयारी सेते हैं.
- पीबीएस (4-5 बार 5 मिनट) के साथ बड़े पैमाने पर धो और एक साफ कांच फ्लास्क प्रत्येक नमूने हस्तांतरण.
- निर्जलीकरण
- अलग 30, 50, 90, 70, 95 और इथेनॉल के 100% से युक्त समाधान तैयार.
- 5 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना के लिए 30% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना के लिए 50% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना के लिए 70% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- 5 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना के लिए 90% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- प्रत्येक नमूने के 5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें (3x दोहराने).
- प्रत्येक नमूने के 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें (3x दोहराने).
- एम्बेड और आगे प्रसंस्करण
- इथेनॉल का एक मात्रा के साथ मिश्रण EPON राल 1 की मात्रा. यह निरंतर रोटेशन (2-4 घंटे) के तहत तैयार में जोड़ें.
- 100% EPON में खुली बोतल में तैयारी प्लेस, शेष इथेनॉल लुप्त हो जाना करने की अनुमति (4-6 घंटे).
- 60 डिग्री सेंटीग्रेड पर 36 घंटे के लिए molds में तैयार रखें.
- इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रसंस्करण. 50-80 एनएम पतली वर्गों में तैयार करने की प्रक्रिया, मानक ultramicrotomy प्रक्रियाओं का उपयोग.
- इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग
- तैयारी पारंपरिक EM प्रक्रियाओं का उपयोग imaged है.
6) प्रतिनिधि परिणाम
परिणाम की उम्मीद आंकड़े 1C और 2 में उल्लिखित हैं. सीमा सड़क संगठन के गठन में रोशनी प्रक्रिया के परिणामwn थपका वेग, जो दोनों प्रतिदीप्ति और ट्रांसमिशन इमेजिंग में दिखाई जाएगी. रोशनी के दौरान पहली घटना प्रतिदीप्ति के लापता होने एफएम डाई धुंधला के साथ जुड़े है. पृष्ठभूमि एल्डिहाइड लगानेवाला द्वारा प्रेरित प्रतिदीप्ति, इसके विपरीत में, प्रयोग भर में दिखाई जाएगी. विरंजन जगह आम तौर पर रोशनी की शुरुआत के बाद ~ 10-20 मिनट में लेता है. आमतौर पर कोई photoconversion उत्पाद इस समय बिंदु पर देखा जा सकता है है.
रोशनी, जारी रखा होना चाहिए और एक भूरे रंग थपका संचय के कारण छाया (चित्र 1C iv) ~ 10 मिनट के बाद तैयारी के लिए बारी के लिए यह स्पष्ट नहीं है थपका वर्षण और एफएम डाई विरंजन क्यों जगह एक साथ नहीं ले जाएगा, यह संभव है कि एक अपेक्षाकृत बड़ी ऑक्सीकरण थपका की राशि के एकत्रीकरण और तेज़ी से पहले जमा करने की जरूरत है, और इसलिए इस प्रतिक्रिया विरंजन प्रक्रिया की तुलना में धीमी है. इस स्तर पर, तथापि, तैयारी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रसंस्करण के लिए तैयार नहीं है के रूप में थपका वर्षा की संभावना अधूरा है. हम 5-10 मिनट के लंबे समय तक इंतजार है, जिसके दौरान तैयार (presynaptic तंत्रिका टर्मिनल) एक काले भूरे रंग या काले () रंग, पूर्ण रूपांतरण के संकेत मानता है पसंद करते हैं. सामान्य सतह की तैयारी के एक मामूली रूपांतरण (उदाहरण के लिए, एक neuromuscular जंक्शन में मांसपेशी फाइबर के) इस स्तर पर देखा जा सकता है है. यह सबसे अधिक संभावना autofluorescence (और / या लगानेवाला प्रतिदीप्ति) द्वारा थपका प्रेरित के एक रूपांतरण के लिए संबंधित है, और यह प्रक्रिया के लिए हानिकारक नहीं है.
तैयारी तो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए संसाधित है, और अंधेरे vesicles (लेबल) की उपस्थिति के लिए जाँच की जानी चाहिए. जैसा कि हम 5,6 पहले दिखा दिया है, इन vesicles गैर लेबल लोगों की तुलना में ज्यादा denser, और इसलिए आसानी से प्रतिष्ठित (चित्रा 2B) . अच्छी तरह से vesicles के विभिन्न प्रकार के भेद का मौका वृद्धि करने के लिए, कोई विपरीत बढ़ाने वर्गों के पद धुंधला हो जाना (कोई uranyl एसीटेट या नेतृत्व साइट्रेट धुंधला) प्रदर्शन किया जाना चाहिए, आज़मियम धुंधला सबसे सेलुलर तत्वों का पालन करने के लिए पर्याप्त है, और के रूप में नहीं है थपका वेग के रूप में अंधेरा है.
चित्रा 1: एफएम रंजक और यह photoconversion के लिए उपयोग. (ए) लोड हो रहा है और उत्तेजना के तहत एफएम डाई का उपयोग vesicles distaining के लिए एक शास्त्रीय प्रयोग के चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं. (I) एफएम डाई में नमूना सेते बफर युक्त. (Ii) (विद्युत या रासायनिक) उत्तेजित करने के लिए एफएम डाई की उपस्थिति में पुटिका संलयन प्रेरित. (Iii) उत्तेजना के बाद subsequence endocytosis एफएम अभी भी कोशिकी बफर में मौजूद डाई के साथ कुछ vesicles लोड होगा . (Iv) बफर के साथ धोने से कोशिकी एफएम डाई बदलें. (V) एक नई उत्तेजना भरी हुई vesicles उत्पन्न करने के लिए exocytosis पर अपने एफएम डाई जारी करेंगे. (बी) योजनाबद्ध सिर, पुल, और डाई FM1-43 की पूंछ दिखा . (सी) ड्रोसोफिला NMJ में एक photoconversion प्रयोग के उदाहरण हैं. (I) NMJ FM1-43, बाहरी डाई अणु और फिक्सिंग धोने के साथ लोड करने के बाद, एक तंत्रिका टर्मिनल के प्रतिदीप्ति एक पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोप (63x) के साथ मनाया जा सकता है. (Ii-iii) सतत रोशनी के तहत डाई पूरी तरह से प्रक्षालित है . (Iv) जब रोशनी जारी है, एक काले रंग diaminobenzidine वर्षा के कारण प्रकट होता है. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2: EM photoconverted नमूने के उदाहरण (क) छवि एक तंत्रिका synaptic vesicles युक्त टर्मिनल से पता चलता है उनमें से नहीं है, लेकिन photoconverted हैं, यह पर्याप्त रोशनी या ऊतक में गरीब diaminobenzidine पैठ नहीं होने की वजह से हो सकता है.. (बी) कई अंधेरे (भरा) vesicles कि एफएम photoconversion के माध्यम से चला गया के साथ Synaptic bouton . एक समग्र अंधेरे टर्मिनल है जहां कोई vesicles या organelles अलग पहचाना जाता है (सी) रोशनी परिणामों के अतिरिक्त . स्केल सलाखों 200 एनएम का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Discussion
कुछ महत्वपूर्ण कदम ध्यान में रखा जाना चाहिए:
- थपका ऊष्मायन तैयारियाँ पूरी तरह से और धोने और शमन के बाद ही किया जाना चाहिए. अन्यथा गैर - प्रतिक्रिया व्यक्त glutaraldehyde थपका के साथ बातचीत और उसके वर्षा के कारण (आमतौर पर फ्लैट क्रिस्टल, जो घने इलेक्ट्रॉन नहीं कर रहे हैं के रूप में) होगा. तैयारी जहां इस वर्षा बहुतायत से जगह लेता है शायद ही कभी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रयोग करने योग्य हैं.
- प्रदीप्ति बार अलग रोशनी समय के साथ कई समान तैयारी का परीक्षण करके, अनुकूलित चाहिए. हमारे अनुभव में, इष्टतम रूपांतरण (चित्रा 2B) के बारे में 5 मिनट के समय खिड़की (उदाहरण के लिए, के बीच 35 और 40 मिनट रोशनी की शुरुआत के बाद) में हासिल की है. अपर्याप्त रोशनी (2A चित्रा) लेबल organelles की कमी है, और / या आंशिक रूप से लेबल organelles (जैसे vesicles के रूप में उनकी मात्रा का केवल आधा में थपका होते दिखने में) द्वारा विशेषता है. लांग रोशनी, इसके विपरीत में, रूपांतरण थपका रूपांतरण उत्पाद जम जाता है, में परिणाम cytosol (चित्रा 2C) में organelles और बच distorts. तैयारी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में काले संरचनाओं के रूप में थोड़ा नमूदार आकारिकी के साथ दिखाई देते हैं.
हम Caenorhabditis एलिगेंस, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, zebrafish (Danio rerio) और मेंढक (राणा pipiens और राणा esculenta) से neuromuscular जंक्शनों सहित कई तैयारी में तकनीक का इस्तेमाल किया है. हम भी सभ्य न्यूरॉन्स और neuroendocrine कोशिकाओं सहित संवर्धित कोशिकाओं में तकनीक का इस्तेमाल किया है. यह भी चूहे मस्तिष्क (synaptosomes) से synapses शुद्ध में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, हम तकनीक अधिकांश तैयारियाँ जो vesicular झिल्ली तेज उपयोग में प्रयोग करने योग्य होना करने के लिए उम्मीद है.
तकनीक यह endocytosed organelles की स्थिति और आकारिकी का निर्धारण करने में आज तक सबसे ज्यादा संवेदनशील तकनीक है. यह 5,6,7,8 vesicles के विशिष्ट शारीरिक पूल सहित, हाल ही में endocytosed organelles की सटीक स्थान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह भी रिसाइकिलिंग मार्ग में संख्या और organelles की आकारिकी 9,10 उदाहरण के लिए देखने के निर्धारण में इस्तेमाल किया गया है है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
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