Summary
Colorants FM ont été d'une aide précieuse dans la compréhension de la dynamique des synapses. FMS sont normalement suivies sous le microscope à fluorescence dans des conditions de stimulation différents. Toutefois, photoconversion de colorants FM combinée avec la microscopie électronique permet la visualisation des différents bassins des vésicules synaptiques, parmi les composants ultrastructure d'autres, en boutons synaptiques.
Abstract
La fusion des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique (exocytose) est une étape nécessaire dans la libération de neurotransmetteurs et de la communication neuronale. Les vésicules sont ensuite extraites de la membrane plasmique (endocytose) et regroupés avec la catégorie générale des vésicules au sein de la terminaison nerveuse, jusqu'à ce qu'ils subissent une nouvelle exo-endocytose et du cycle (recyclage des vésicules). Ces processus ont été étudiés en utilisant une variété de techniques comme la microscopie électronique, les enregistrements électrophysiologiques, l'ampérométrie et des mesures de capacitance. Surtout, au cours des deux dernières décennies un certain nombre de marqueurs marqués par fluorescence émergé, permettant de suivre les techniques optiques vésicules dans leur dynamique de recyclage. L'un des marqueurs les plus couramment utilisés est le styryle ou FM colorant 1; structurellement, tous les colorants contiennent FM une tête hydrophile et une queue lipophile reliés par un anneau aromatique et une ou plusieurs doubles liaisons (Fig. 1B). Une expérience de teinture classique FM pour étiqueter un pool de vésicules consiste à baigner la préparation (fig. 1AI) avec le colorant lors de la stimulation du nerf (électriquement ou avec haute K +). Cela induit le recyclage des vésicules et le chargement ultérieur de la teinture dans des vésicules récemment endocytose (figure 1A I-III). Après le chargement des vésicules avec un colorant, un second tour de la stimulation dans un bain de teinture sans se déclencher la libération FM par exocytose (Fig. 1A IV-V), processus qui peut être suivie par une surveillance de la diminution d'intensité de fluorescence (décoloration).
Bien que les colorants FM ont grandement contribué au domaine de recyclage des vésicules, il n'est pas possible de déterminer la localisation exacte ou la morphologie des vésicules individuels en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Pour cette raison, nous expliquons ici comment FM colorants peuvent également être utilisés comme marqueurs de l'endocytose utilisant la microscopie électronique, à travers photoconversion. La technique exploite la propriété photoconversion de colorants fluorescents pour générer des espèces réactives de l'oxygène sous un éclairage intense. Les préparatifs marqués par fluorescence sont immergés dans une solution contenant diaminobenzidine (DAB) et illuminé. Espèces réactives générées par les molécules de colorant oxyder le DAB, qui forme une société stable, précipité insoluble qui a un aspect sombre et peuvent être facilement distingués en microscopie électronique 2,3. Comme DAB n'est oxydé dans le voisinage immédiat de molécules fluorescentes (comme les espèces réactives de l'oxygène sont de courte durée), la technique garantit que les structures ne sont marqués par fluorescence va contenir le précipité denses aux électrons. La technique permet donc l'étude de l'emplacement exact et la morphologie des activement le recyclage des organelles.
Protocol
1) Préparation de Drosophila melanogaster jonction musculaire neuronale (JNM)
- Préparer la norme drosophile salin (130 mM NaCl, 36 mM de saccharose, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, 5 mM Hepes, pH 7,3 4.
- Disséquer la préparation dans une solution saline (1,1). Les larves de drosophile se languissait dorsale côte dans un plat Sylgard; sur la face dorsale longitudinale est sectionné, et les organes internes sont enlevés. La préparation est ensuite étiré et se languissait. Plusieurs muscles ventraux peuvent être ensuite utilisées.
2) La stimulation et la coloration FM
- Il est conseillé de faire toutes les étapes suivantes dans des conditions de faible éclairage, afin de protéger les colorants FM de blanchiment.
- Pour une stimulation chimique des nerfs, un tampon de potassium est utilisé. Préparer la drosophile salin (voir 1.1) contenant 90 mM de KCl et 10 pM de FM1-43 colorant. Conserver la solution abri de la lumière.
- Bain de la préparation avec le tampon préalablement préparé pendant 1 minute à température ambiante.
- Laver à la norme drosophile saline (1.1) pour enlever extracellulaire FM1-43 colorant. Procéder rapidement à la fixation.
3) de fixation
- Bain de la préparation avec du glutaraldéhyde à 2,5% en tampon phosphate salin (PBS) pendant 45 minutes à température ambiante. Pour une bonne conservation des caractéristiques morphologiques, le glutaraldéhyde est préféré à paraformaldéhyde.
- Laver une fois avec du PBS, puis laissez la préparation immergé pendant 15 minutes dans 100 mM de NH 4 Cl. Cette étape est effectuée afin d'étancher les groupes aldéhydes libres du fixateur glutaraldéhyde restant.
- Laver la solution NH 4 Cl avec la normale du PBS.
4) photoconversion
- Incuber la préparation JNM pendant 30 minutes à 4 ° C dans du PBS contenant 1,5 mg ml-1 de la diaminobenzidine (DAB).
- Position de l'échantillon sous le microscope à fluorescence. Trouvez et se concentrer le signal de fluorescence en utilisant un objectif de grossissement relativement faible immersion dans l'eau (20x 0,5 NA).
- Eclairer l'échantillon avec l'intensité maximale de la lampe jusqu'à ce que le colorant est complètement blanchi FM (figure 1C). Pour contrôler si photoconversion a eu lieu, est conseillé de vérifier à l'échantillon sous la lumière de transmission avant et après la teinture-blanchiment FM étape. Si photoconversion a lieu, un précipité brun foncé est prévu (figure 1C). Le temps d'éclairage est variable, en fonction de la force d'éclairage et aussi sur la pénétration DAB dans la préparation. Pour la plupart des préparations, nous avons trouvé les temps d'illumination de ~ 30-45 minutes pour être optimale lorsque vous utilisez un objectif 20x. Périodes plus courtes sont l'éclairage utilisé pour des objectifs plus élevés de grossissement (60x).
- Pour l'éclairage, nous préférons utiliser une lampe au mercure, avec un boîtier de lampe contenant un miroir en arrière, qui recueille les faisceaux de lumière rétrodiffusée, et donc augmente l'intensité totale.
5) Traitement de l'échantillon pour EM
- Osmication
- Préparer une solution avec un volume de tétroxyde d'osmium dans le volume des arbres de l'eau (env. 300 ul par échantillon). Le travail en utilisant le tétroxyde d'osmium doit être fait sous le capot, en utilisant des gants et des équipements de protection aye.
- Incuber la préparation de la solution de tétroxyde d'osmium pendant 1 heure à température ambiante (sous le capot).
- Laver abondamment avec du PBS (4-5 fois 5 minutes) et transférer chaque échantillon dans une fiole de verre propre.
- Déshydratation
- Préparer des solutions séparées contenant 30, 50, 70 90, 95 et 100% d'éthanol.
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 30% à chaque échantillon pendant 5 minutes.
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 50% à chaque échantillon pendant 5 minutes.
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 70% à chaque échantillon pendant 5 minutes.
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 90% à chaque échantillon pendant 5 minutes.
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 95% à chaque échantillon pendant 5 minutes (répéter 3x).
- Ajouter 1 ml d'éthanol à 100% à chaque échantillon pendant 5 minutes (répéter 3x).
- Intégration et le traitement ultérieur
- Mélanger 1 volume d'Epon résine avec un volume d'éthanol. Ajoutez-le à la préparation sous une rotation continue (2-4 heures).
- Placer la préparation dans 100% en Epon flacons ouverts, permettent l'éthanol restant de s'évaporer (4-6 heures).
- Placer la préparation dans des moules à 60 ° C pendant 36 heures.
- Traitement de la microscopie électronique. Processus de la préparation dans 50-80 nm sections minces, en utilisant des procédures ultramicrotomie standard.
- Imagerie par microscopie électronique
- La préparation est imagée en utilisant les procédures classiques EM.
6) Résultats Représentant
Les résultats attendus sont décrits dans les figures 1C et 2. La procédure de l'éclairage dans la formation de broprécipitent DAB wn, qui sera visible dans les deux fluorescence et imagerie de transmission. La première occurrence lors de l'illumination est la disparition de la fluorescence associée à la coloration de teinture FM. La fluorescence de fond induit par le fixateur d'aldéhyde, en revanche, sera visible tout au long de l'expérience. Le blanchiment a lieu généralement dans ~ 10-20 minutes après le début de l'illumination. Généralement, aucun produit photoconversion peut être observé à ce point dans le temps.
Illumination devrait être poursuivi, et après ~ 10 minutes les préparatifs vont se tourner vers une teinte brune due à l'accumulation de DAB (figure 1C iv) Il est difficile de comprendre pourquoi la DAB et FM précipitations de teinture blanchiment n'ont pas lieu simultanément, il est possible qu'une relativement grande quantité de DAB oxydée doit s'accumuler avant l'agrégation et la précipitation, et que par conséquent, cette réaction est plus lent que le processus de blanchiment. A ce stade, cependant, la préparation n'est pas prêt pour le traitement de la microscopie électronique, que la précipitation est probablement incomplète DAB. Nous préférons attendre 5-10 minutes plus, au cours de laquelle la préparation (terminaison nerveuse présynaptique) suppose un brun foncé (ou noir) de couleur, indiquant une conversion complète. Une conversion légère de la surface générale de la préparation (par exemple, des fibres musculaires dans une jonction neuromusculaire) peut être observée à ce stade. Il est très probablement liée à une conversion des DAB induite par autofluorescence (et / ou de fluorescence fixateur), et il n'est pas préjudiciable à la procédure.
La préparation est ensuite traitée pour la microscopie électronique, et doivent être vérifiés pour la présence de l'obscurité (marqué) des vésicules. Comme nous l'avons démontré, avant 5,6, ces vésicules sont beaucoup plus denses que les non-étiquetées petits, et sont donc faciles à distinguer (figure 2B). Pour augmenter les chances de distinguer ainsi les différents types de vésicules, pas d'amélioration du contraste coloration après des sections doit être effectué (pas de coloration ou de l'acétate d'uranyle citrate de plomb), la coloration d'osmium est suffisante pour observer la plupart des éléments cellulaires, et n'est pas aussi sombre que précipiter DAB.
Figure 1: les colorants FM et de l'utiliser pour photoconversion. (A) représentent les étapes d'une expérience classique pour le chargement et distaining vésicules à l'aide de colorants FM sous stimulation. (I) incuber l'échantillon en FM colorants contenant un tampon. (Ii) stimuler (électriquement ou chimiquement) pour induire la fusion des vésicules en présence de FM colorant. (Iii) L'endocytose séquence après stimulation va charger quelques vésicules avec de la teinture FM toujours présent dans la mémoire tampon extracellulaire. (Iv) Remplacer le colorant extracellulaire FM par un lavage avec du tampon. (V) Une nouvelle stimulation induira vésicules chargées de libérer leurs colorants FM sur l'exocytose. (B) Schéma montrant la tête, le pont et la queue de la teinture FM1-43. (C) Exemple d'une expérience photoconversion chez la drosophile JNM. (I) Après le chargement du JNM par FM1-43, le lavage des molécules de colorant et externes de fixation, la fluorescence d'une terminaison nerveuse peut être observée avec un microscope conventionnel épifluorescence (63x). (II-III) sous illumination continue la teinture est complètement blanchi. (Iv) Lorsque l'éclairage continue, une couleur noire apparaît à cause de précipitations diaminobenzidine. La barre d'échelle représente 10 um.
Figure 2: EM exemples d'échantillons photoconverted (A) L'image montre une terminaison nerveuse contenant les vésicules synaptiques, mais pas d'entre eux sont photoconverted, ce qui pourrait être causé par ne pas avoir un éclairage suffisant ou la pénétration diaminobenzidine pauvres dans le tissu.. (B) Bouton synaptique avec plusieurs sombres (rempli) des vésicules qui sont passés par photoconversion FM. (C) Excédent des résultats d'illumination globale dans un terminal sombres où aucune des vésicules ou organites sont distinguables. Barres d'échelle représentent 200 nm.
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Discussion
A quelques critiques devraient être prises en compte:
- L'incubation DAB doit être effectuée uniquement après un lavage soigneux et trempe des préparatifs. Sinon, le glutaraldéhyde n'ayant pas réagi va interagir avec le DAB et provoquer sa précipitation (généralement sous la forme de cristaux plats, qui ne sont pas denses aux électrons). Les préparatifs où cette précipitation a lieu en abondance sont rarement exploitables pour la microscopie électronique.
- Reprises éclairage doit être optimisée, en testant plusieurs préparations identiques avec des temps d'illumination différentes. Dans notre expérience, la conversion optimale (figure 2B) est réalisée dans une fenêtre de temps d'environ 5 minutes (par exemple, entre 35 et 40 minutes après le début de l'illumination). Éclairage insuffisant (figure 2A) est caractérisée par un manque d'organites étiquetés, et / ou organites partiellement étiquetées (comme les vésicules qui paraît contenir des DAB dans seulement la moitié de leur volume). Un éclairage longue, en revanche, les résultats dans plus de la conversion du produit de conversion DAB s'accumule, déforme les organelles et s'échappe dans le cytosol (figure 2C). Les préparatifs apparaissent comme des structures noires en microscopie électronique, avec une morphologie peu observables.
Nous avons utilisé la technique dans plusieurs préparations, y compris les jonctions neuromusculaires de Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, le poisson-zèbre (Danio rerio) et la grenouille (Rana pipiens et Rana esculenta). Nous avons également utilisé la technique dans les cellules cultivées, y compris les neurones cultivés et les cellules neuroendocrines. Il peut également être utilisé avec succès dans les synapses purifiées de cerveau de rat (synaptosomes). Par conséquent, nous nous attendons à la technique pour être utilisable dans la plupart des préparations qui utilisent l'absorption membrane vésiculaire.
La technique est la technique la plus sensible à ce jour pour déterminer le positionnement et la morphologie des organites endocytose. Il a été utilisé pour déterminer l'emplacement exact des organites récemment endocytose, y compris les piscines physiologiques spécifiques des vésicules 5,6,7,8. Il a également été utilisé pour déterminer le nombre et la morphologie des organites dans la voie de recyclage voir par exemple 9,10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
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