Summary
FM Farbstoffe haben eine unschätzbare Hilfe für das Verständnis der synaptischen Dynamik worden. FMs sind in der Regel unter dem Fluoreszenzmikroskop bei unterschiedlichen Bedingungen Stimulation gefolgt. Allerdings ermöglicht Photokonversion FM Farbstoffe mit Elektronenmikroskopie kombiniert die Visualisierung verschiedener synaptischer Vesikel-Pools, unter anderem Ultrastruktur Komponenten in synaptischen boutons.
Abstract
Die Fusion von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran (Exozytose) ist ein erforderlicher Schritt in die Freisetzung von Neurotransmittern und die neuronale Kommunikation. Die Vesikel werden dann von der Plasmamembran (Endozytose) abgerufen und zusammen mit dem allgemeinen Pool von Vesikeln innerhalb der Nervenendigung gruppiert, bis sie eine neue Exo-und Endozytose-Zyklus (Vesikel Recycling) zu unterziehen. Diese Prozesse wurden untersucht mit einer Vielzahl von Techniken wie der Elektronenmikroskopie, Elektrophysiologie Aufnahmen, Amperometrie und Kapazitätsmessungen. Wichtig ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten eine Reihe von fluoreszenzmarkierten Marker entwickelt, so dass optische Techniken, um Vesikel in deren Recycling Dynamik zu verfolgen. Einer der am häufigsten verwendeten Marker ist der Styryl-oder FM-Farbstoff 1, strukturell, enthalten alle FM Farbstoffe einem hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schwanz durch einen aromatischen Ring und einen oder mehrere Doppelbindungen (Abb. 1B) verbunden. Ein klassischer FM Farbstoff experimentieren, um einen Pool von Vesikeln Etikett besteht in Baden die Vorbereitung (Abb. 1Ai) mit dem Farbstoff während der Stimulation des Nervs (elektrisch oder mit hoher K +). Dies induziert Vesikel-Recycling und die anschließende Beladung des Farbstoffs in jüngster Zeit durch Endozytose Vesikel (Abb. 1A i-iii). Nach dem Laden der Vesikel mit Farbstoff, eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-freie Bad löst die FM durch Exozytose (Abb. 1A iv-v), Prozess, der durch die Überwachung der Fluoreszenz-Intensität zu verringern (Entfärbung) verfolgt werden kann.
Obwohl FM Farbstoffe stark auf den Bereich der Vesikel-Recycling beigetragen haben, ist es nicht möglich, die genaue Lokalisation und Morphologie der einzelnen Vesikel mit herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie bestimmen. Aus diesem Grund erklären wir hier, wie FM-Farbstoffe können auch als endocytischen Marker mit Hilfe der Elektronenmikroskopie verwendet werden, durch Photokonversion. Die Photokonversion Technik nutzt die Eigenschaft von Fluoreszenzfarbstoffen an reaktiven Sauerstoffspezies unter intensiver Beleuchtung erzeugen. Fluoreszenzmarkierten Präparate werden in einer Lösung mit Diaminobenzidin (DAB) getaucht und beleuchtet. Reaktive Spezies durch die Farbstoffmoleküle generiert oxidieren die DAB, die eine stabile, unlösliche Niederschlag, ein dunkles Aussehen hat und kann problemlos in der Elektronenmikroskopie 2,3 unterschieden werden Formen. Da DAB ist nur in der unmittelbaren Nähe von fluoreszierenden Molekülen (wie die reaktive Sauerstoff-Spezies kurzlebig sind) oxidiert, sorgt für die Technik, die nur fluoreszenzmarkierten Strukturen werden den Elektronen-dichten Niederschlag enthalten. Die Technik ermöglicht so die Studie über die genaue Lage und Morphologie der aktiv Recycling Organellen.
Protocol
1) Herstellung von Drosophila melanogaster neuronalen muskulös Kreuzung (NMJ)
- Bereiten Standard Drosophila Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 36 mM Saccharose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7.3 4.
- Präparieren Sie die Vorbereitung in Kochsalzlösung (1,1). Die Drosophila-Larven ist dorsal-up in einem Sylgard Gericht verzehrte, die Dorsalseite ist im Schnitt längs, und die inneren Organe entfernt werden. Das Präparat wird dann gestreckt und schmachtete. Mehrere ventralen Muskeln können dann verwendet werden.
2) Stimulation und FM-Färbung
- Es ist ratsam, alle folgenden Schritte bei schlechten Lichtverhältnissen zu tun, um FM Farbstoffe vor dem Ausbleichen zu schützen.
- Für die chemische Stimulation der Nerven ist eine hohe Kalium-Puffer verwendet. Bereiten Drosophila Kochsalzlösung (siehe 1.1) mit 90 mM KCl und 10 uM FM1-43-Farbstoff. Halten Sie die Lösung vor Licht geschützt.
- Bath die Zubereitung mit der zuvor hergestellten Puffer für 1 Minute bei Raumtemperatur.
- Wash mit Standard Drosophila Kochsalzlösung (1,1) an extrazelluläre FM1-43 Farbstoff zu entfernen. Gehen Sie schnell zu einer Fixierung.
3) Befestigung
- Bath die Zubereitung mit 2,5% Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Für eine gute Erhaltung der morphologischen Merkmale, ist Glutaraldehyd zu Paraformaldehyd bevorzugt.
- Wash einmal mit PBS und verlassen dann die Vorbereitung für 15 Minuten in 100 mM NH 4 Cl untergetaucht. Dieser Schritt ist getan, um den freien Aldehydgruppen der verbleibenden Glutaraldehyd Fixierlösung zu stillen.
- Waschen Sie die NH 4 Cl-Lösung mit normalen PBS.
4) Photokonversion
- Inkubieren Sie die NMJ Vorbereitung für 30 Minuten bei 4 ° C in PBS mit 1,5 mg ml-1 von Diaminobenzidin (DAB).
- Position der Probe unter dem Fluoreszenzmikroskop. Suchen und konzentrieren das Fluoreszenzsignal mit einer relativ niedrigen Vergrößerung Wasserimmersionsobjektiv (20x 0,5 nA).
- Illuminate der Probe mit der maximalen Intensität, bis die Lampe FM Farbstoff ist völlig gebleicht (Abbildung 1C). Um zu steuern, wenn Photokonversion aufgetreten ist, ist es ratsam, bei der Probe unter Sendelicht überprüfen vor und nach dem FM Farbstoff-Bleiche. Wenn Photokonversion stattfindet, ist ein dunkelbrauner Niederschlag zu erwarten (Abbildung 1C). Die Belichtungszeit ist variabel, abhängig von der Beleuchtungsstärke und auch von der DAB Eindringen in die Vorbereitung. Für die meisten Vorbereitungen haben wir festgestellt, Belichtungszeiten von ca. 30-45 Minuten als optimal bei Verwendung eines 20x-Objektiv. Kürzere Zeiträume Beleuchtung sind für höhere Vergrößerung Ziele (60x) verwendet.
- Für die Beleuchtung bevorzugen wir eine Quecksilberlampe verwendet, mit einem Lampengehäuse mit einem Rückspiegel, die rückgestreuten Lichtstrahlen sammelt, und erhöht damit die gesamte Intensität.
5) Die Verarbeitung der Probe für die EM
- Osmication
- Bereiten Sie eine Lösung mit einem Volumen von Osmiumtetroxid in Baum Mengen an Wasser (ca. 300 ul pro Probe). Die Arbeit mit Osmiumtetroxid muss unter der Haube getan werden, mit Handschuhen und aye Schutzausrüstung.
- Inkubieren Sie die Vorbereitung in der Osmiumtetroxid-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (unter der Haube).
- Wash ausgiebig mit PBS (4-5 mal 5 Minuten) und übertragen jeweils Proben zu einer sauberen Glaskolben.
- Austrocknung
- Separate Lösungen mit 30, 50, 70 90, 95 und 100% Ethanol.
- 1 ml 30% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten.
- 1 ml 50% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten.
- 1 ml 70% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten.
- 1 ml 90% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten.
- 1 ml 95% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten (Wiederholung 3x).
- 1 ml 100% Ethanol zu jeder Probe für 5 Minuten (Wiederholung 3x).
- Embedding und Weiterverarbeitung
- 1 Volumenteil Epon-Harz mit einem Volumen von Ethanol. Fügen Sie es um die Vorbereitung unter ständiger Rotation (2-4 Stunden).
- Legen Sie die Vorbereitung in 100% Epon in offenen Flaschen, damit das restliche Ethanol verdampfen (4-6 Stunden).
- Legen Sie die Vorbereitung in Formen bei 60 ° C für 36 Stunden.
- Elektronenmikroskopie Verarbeitung. Prozess der Vorbereitung in 50-80 nm dünne Schnitte, mit Standard-Ultramikrotomie Verfahren.
- Elektronenmikroskopie Bildgebung
- Die Zubereitung ist abgebildet mit herkömmlichen Verfahren EM.
6) repräsentative Ergebnisse
Die erwarteten Ergebnisse sind in den Abbildungen 1C und 2 dargestellt. Die Beleuchtung Verfahren führt zur Bildung von brown DAB Niederschlag, der sichtbar sein in beiden Fluoreszenz und Transmission Bildgebung. Das erste Auftreten bei der Beleuchtung ist das Verschwinden der Fluoreszenz mit der FM Farbstoff Färbung verbunden. Die Hintergrund-Fluoreszenz durch die Aldehyd-Fixativ induzierte dagegen sichtbar sein wird während des gesamten Experiments. Die Bleiche erfolgt in der Regel in ~ 10-20 Minuten nach dem Start der Beleuchtung. In der Regel keine Photokonversion Produkt kann zu diesem Zeitpunkt beobachtet werden.
Die Beleuchtung sollte fortgesetzt werden und nach ca. 10 Minuten die Vorbereitungen zu einer braunen Farbton durch DAB Akkumulation (Abb. 1C iv) wiederum Unklar ist, warum DAB Niederschlags-und FM Farbbleichung nicht gleichzeitig erfolgen, es ist möglich, dass eine relativ große Menge an oxidiertem DAB muss vor Aggregation und Präzipitation ansammeln, und dass daher diese Reaktion ist langsamer als die Bleiche. In diesem Stadium ist jedoch die Vorbereitung nicht bereit für die Elektronenmikroskopie Verarbeitung, wie die DAB Niederschläge wahrscheinlich unvollständig. Wir bevorzugen es, 5-10 Minuten länger warten, während der die Vorbereitung (präsynaptischen Nervenendigung) eine dunkelbraune (oder schwarze) Farbe, was auf eine vollständige Umsetzung übernimmt. Eine leichte Umwandlung der allgemeinen Oberfläche des Präparates (z. B. der Muskelfasern in einer neuromuskulären Synapse) kann in diesem Stadium beobachtet werden. Es ist sehr wahrscheinlich zu einem Umsatz von DAB induziert durch Autofluoreszenz (und / oder Fixiermittel Fluoreszenz) verwandt, und es ist nicht schädlich für das Verfahren.
Das Präparat wird dann für die Elektronenmikroskopie aufbereitet und sollten auf das Vorhandensein von dunkler (beschriftet) Vesikeln überprüft werden. Wie wir bereits 5,6 gezeigt haben, sind auch diese Vesikel viel dichter als nicht-markierten diejenigen, und sind daher leicht zu unterscheiden (Abbildung 2B). Um die Wahrscheinlichkeit zu unterscheiden und die unterschiedlichen Arten von Vesikeln zu erhöhen, sollten keine kontrastverstärkenden post Färbung der Schnitte durchgeführt (keine Uranylacetat oder Bleicitrat-Färbung) werden, die Osmium-Färbung ist ausreichend für die meisten zellulären Elemente zu beobachten, und ist nicht als dunkel wie DAB Niederschlag.
Abbildung 1: FM Farbstoffe und es zu benutzen für Photokonversion. (A) stellen die Stufen einer klassischen Experiment zum Be-und distaining Vesikel mit FM Farbstoff unter Stimulation. (I) Inkubieren der Probe in FM Farbstoff enthaltenden Puffer. (Ii) Förderung (elektrisch oder chemisch) an Vesikelfusion in Anwesenheit von FM Farbstoff zu induzieren. (Iii) Die Teilfolge Endozytose nach Stimulation wird einige Vesikel mit FM Farbstoff noch in der extrazellulären Puffer zu laden. (Iv) Ersetzen Sie die extrazelluläre FM Farbstoff durch Waschen mit Puffer. (V) Ein neuer Stimulation induziert beladenen Vesikel, ihre FM Farbstoff auf Exozytose freizugeben. (B) Schematische Darstellung der Kopf-, Brücken-und Schwanz des FM1-43-Farbstoff. (C) Beispiel für eine Photokonversion Experiment in Drosophila NMJ. (I) Nach dem Laden der NMJ mit FM1-43-, Wasch-externen Farbstoffmoleküle und Fixieren, kann die Fluoreszenz einer Nervenendigung mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop (63x) beobachtet werden. (Ii-iii) Unter kontinuierlicher Beleuchtung der Farbstoff vollständig gebleicht. (Iv) Wenn die Beleuchtung setzt, erscheint eine schwarze Farbe durch Diaminobenzidin Niederschlag. Scale-Balken repräsentiert 10 pm.
Abbildung 2: EM Beispiele photokonvertiertem Proben (A) Das Bild zeigt eine Nervenendigung mit synaptischen Vesikeln, aber nicht von ihnen sind photokonvertiertem; dies könnte durch nicht genügend Beleuchtung oder arme Diaminobenzidin Eindringen in das Gewebe verursacht werden.. (B) Synaptic bouton mit mehreren dunklen (gefüllt) Bläschen, die durch FM Photokonversion ging. (C) Excess der Beleuchtung ergibt sich insgesamt eine dunkle Terminal, wo keine Bläschen oder Organellen sind unterscheidbar. Scale-Balken 200 nm.
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Discussion
Ein paar kritische Schritte sollten berücksichtigt werden:
- Die DAB Inkubation sollten nur nach gründlichem Waschen und Abschrecken der Vorbereitungen durchgeführt werden. Andernfalls wird der nicht umgesetzte Glutaraldehyd wird mit DAB zu interagieren und zu seinen Niederschlag (in der Regel in Form von flachen Kristallen, die nicht Elektron dichten). Die Vorbereitungen, wo dieser Niederschlag findet reichlich sind selten brauchbar für die Elektronenmikroskopie.
- Illumination Zeiten sollten optimiert werden, indem Sie probeweise mehrere identische Präparate mit unterschiedlichen Belichtungszeiten. In unserer Erfahrung ist eine optimale Umsetzung (Abbildung 2B) in einem Zeitfenster von ca. 5 Minuten (zum Beispiel zwischen 35 und 40 Minuten nach Beginn der Beleuchtung) erreicht. Unzureichende Beleuchtung (Abbildung 2A) wird durch einen Mangel des markierten Organellen, und / oder teilweise beschriftet Organellen (wie Vesikel scheinbar DAB nur in der Hälfte ihres Volumens enthalten) gekennzeichnet. Lange Beleuchtung, im Gegensatz, verzerrt Ergebnisse in Über-Umwandlung der DAB Umwandlungsprodukt ansammelt, die Organellen und flüchtet in das Zytosol (Abbildung 2C). Die Vorbereitungen erscheinen als schwarze Strukturen in der Elektronenmikroskopie, mit wenig beobachtbare Morphologie.
Wir haben die Technik in mehreren Präparaten, einschließlich neuromuskulären Verbindungen von Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Zebrafisch (Danio rerio) und Frosch (Rana pipiens und Rana esculenta) verwendet. Wir haben auch die Technik in kultivierten Zellen, einschließlich kultivierten Neuronen und neuroendokrinen Zellen verwendet. Es kann auch erfolgreich in gereinigtem Synapsen aus Rattenhirn (Synaptosomen) verwendet werden. Daher erwarten wir, die Technik in den meisten Zubereitungen, die Vesikelmembran Aufnahme verwenden nutzbar.
Die Technik ist es die empfindliche Technik zur Bestimmung der Position und Morphologie der Endozytose Organellen date. Es wurde verwendet, um die genaue Lage des kürzlich endozytierten Organellen, einschließlich der spezifischen physiologischen Pools von Vesikeln 5,6,7,8 bestimmen. Es hat sich auch in der Bestimmung der Anzahl und Morphologie der Organellen in der Recycling-Weg sehen, zum Beispiel 9,10 verwendet.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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