Summary
Coloranti FM sono stati di enorme aiuto nella comprensione delle dinamiche sinaptiche. FM sono normalmente seguiti sotto il microscopio a fluorescenza in condizioni di stimolazione differenti. Tuttavia, fotoconversione di coloranti FM combinato con il microscopio elettronico permette la visualizzazione di diverse piscine delle vescicole sinaptiche, tra i componenti ultrastruttura altro, in boutons sinaptica.
Abstract
La fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana plasmatica (esocitosi) è un passo necessario nel rilascio dei neurotrasmettitori e la comunicazione neuronale. Le vescicole sono poi recuperati dalla membrana plasmatica (endocitosi) e raggruppati con la riserva generale di vescicole all'interno del terminale nervoso, fino a subire un nuovo ciclo eso-ed endocitosi (riciclo delle vescicole). Questi processi sono stati studiati usando una varietà di tecniche come la microscopia elettronica, le registrazioni elettrofisiologiche, amperometria e misure di capacità. È importante sottolineare che nel corso degli ultimi due decenni una serie di marker fluorescente emerse, consentendo tecniche ottiche per monitorare vescicole nelle loro dinamiche di riciclaggio. Uno degli indicatori più comunemente usato è il styryl o FM colorante 1, strutturalmente, tutti i coloranti FM contengono una testa idrofila e una coda lipofila collegato tramite un anello aromatico e uno o più doppi legami (Fig. 1B). Un esperimento di tintura classica FM per etichettare un pool di vescicole consiste nel fare il bagno nella preparazione (Fig. 1Ai) con il colorante durante la stimolazione del nervo (elettricamente o con elevata K +). Questo induce il riciclo delle vescicole e il caricamento successivo del colorante in vescicole di recente endocitato (Fig. 1A I-III). Dopo aver caricato le vescicole con colorante, un secondo round di stimoli in una tintura senza bagno sarebbe innescare il rilascio FM per esocitosi (Fig. 1A IV-V), processo che può essere seguita attraverso il monitoraggio della riduzione dell'intensità di fluorescenza (decolorazione).
Sebbene coloranti FM hanno contribuito grandemente al settore del riciclaggio delle vescicole, non è possibile determinare la localizzazione esatta o morfologia delle vescicole individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Per questo motivo, spieghiamo qui come FM coloranti possono essere utilizzati anche come marcatori endocitico usando la microscopia elettronica, attraverso fotoconversione. La tecnica fotoconversione sfrutta la proprietà di coloranti fluorescenti per generare specie reattive dell'ossigeno sotto illuminazione intensa. Preparati fluorescente sono immersi in una soluzione contenente diaminobenzidina (DAB) e illuminato. Specie reattiva, generate dalle molecole di colorante ossidare il DAB, che forma una stalla, precipitato insolubile che ha un aspetto scuro e sono facilmente riconoscibili in microscopia elettronica a 2,3. Come DAB è solo ossidato nelle immediate vicinanze di molecole fluorescenti (come le specie reattive dell'ossigeno sono di breve durata), la tecnica fa sì che le strutture solo fluorescente stanno per contenere l'elettrone-denso precipitato. La tecnica permette quindi lo studio della posizione esatta e la morfologia del attivamente riciclaggio organelli.
Protocol
1) Preparazione della giunzione Drosophila melanogaster neuronale muscolare (NMJ)
- Preparare standard di Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM saccarosio, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 Hepes mM, pH 7.3 4.
- Sezionare la preparazione in soluzione salina (1,1). Le larve di Drosophila si struggeva dorsale laterale in un piatto Sylgard, il lato dorsale è sezionato longitudinale, e gli organi interni vengono rimossi. La preparazione è poi allungato e si struggeva. Diversi muscoli ventrali possono essere poi utilizzati.
2) La stimolazione e colorazione FM
- Si consiglia di fare tutte le seguenti operazioni in condizioni di scarsa illuminazione, al fine di proteggere coloranti FM da sbiancamento.
- Per la stimolazione chimica dei nervi, buffer di potassio alto viene utilizzato. Preparare Drosophila salina (cfr. punto 1.1) contenente 90 mM di KCl e 10 mM di FM1-43 colorante. Tenere la soluzione al riparo dalla luce.
- Bagno la preparazione con il buffer precedentemente preparato per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Lavare con standard di Drosophila salina (1,1) per rimuovere extracellulare FM1-43 colorante. Procedere rapidamente alla fissazione.
3) di fissaggio
- Bagno la preparazione con glutaraldeide al 2,5% in PBS (PBS) per 45 minuti a temperatura ambiente. Per la buona conservazione delle caratteristiche morfologiche, glutaraldeide è preferito a paraformaldeide.
- Lavare una volta con PBS e poi lasciare la preparazione sommerso per 15 minuti in 100 mM di NH 4 Cl. Questo passo è fatto al fine di estinguere i gruppi aldeidi libera del fissativo glutaraldeide rimanenti.
- Lavare i 4 soluzione Cl NH con normale PBS.
4) fotoconversione
- Incubare la preparazione NMJ per 30 minuti a 4 ° C in PBS contenente 1,5 mg ml-1 di diaminobenzidina (DAB).
- Posizionare il campione al microscopio a fluorescenza. Trovare e mettere a fuoco il segnale fluorescente con un relativamente basso dell'acqua obiettivo ingrandimento immersione (20x 0,5 NA).
- Illuminare il campione con la massima intensità della lampada fino a quando il colorante FM è completamente sbiancato (Figura 1C). Per controllare se fotoconversione si è verificato, è consigliabile verificare presso il campione sotto la luce di trasmissione prima e dopo la tintura, candeggio FM passo. Se fotoconversione avviene, un precipitato marrone scuro è atteso (Figura 1C). Il tempo di illuminazione è variabile, a seconda della illuminazione e forza anche sulla penetrazione DAB nella preparazione. Per la maggior parte preparati, abbiamo trovato i tempi di illuminazione di circa 30-45 minuti per essere ottimale quando si utilizza un obiettivo 20x. Illuminazione periodi più brevi sono utilizzate per gli obiettivi di ingrandimento superiore (60x).
- Per l'illuminazione preferiamo usare una lampada al mercurio, con una lampada contenente uno specchio posteriore, che raccoglie il back-sparsi fasci di luce, e quindi aumenta l'intensità totale.
5) Elaborazione del campione per EM
- Osmication
- Preparare una soluzione con un volume di tetrossido di osmio albero dei volumi di acqua (circa 300 ml per campione). Lavoro con tetrossido di osmio deve essere fatto sotto il cofano, usando guanti e aye dispositivi di protezione.
- Incubare la preparazione della soluzione osmio tetrossido per 1 ora a temperatura ambiente (Sotto il cofano).
- Lavare a lungo con PBS (4-5 volte 5 minuti) e trasferire ogni campioni da una bottiglia di vetro pulito.
- Disidratazione
- Preparare soluzioni separate contenenti 30, 50, 70 90, 95 e 100% di etanolo.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 30% per ogni campione per 5 minuti.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 50% per ogni campione per 5 minuti.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% per ogni campione per 5 minuti.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 90% per ogni campione per 5 minuti.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 95% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x).
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x).
- Incorporare e l'ulteriore elaborazione
- Mescolare 1 volume di Epon resina con un volume di etanolo. Aggiungerlo alla preparazione in rotazione continua (2-4 ore).
- Mettere il preparato in Epon 100% in flaconi aperti, lasciare evaporare l'etanolo residuo (4-6 ore).
- Mettere il preparato in stampi a 60 ° C per 36 ore.
- Microscopia elettronica di elaborazione. Processo di preparazione nel 50-80 nm sezioni sottili, utilizzando le procedure ultramicrotomy standard.
- Microscopia elettronica a immagini
- La preparazione è ripreso con i convenzionali procedure di EM.
6) Rappresentante Risultati
I risultati attesi sono descritti nelle figure 1C e 2. L'illuminazione risultati della procedura nella formazione di brown precipitare DAB, che sarà visibile sia in fluorescenza e di imaging di trasmissione. Il verificarsi prima durante illuminazione è la scomparsa della fluorescenza associata alla colorazione colorante FM. La fluorescenza di fondo indotto dalla fissativo aldeide, al contrario, sarà visibile in tutto l'esperimento. Lo sbiancamento avviene di solito in ~ 10-20 minuti dopo l'inizio di illuminazione. Tipicamente nessun prodotto fotoconversione può osservare a questo punto del tempo.
L'illuminazione deve essere continuato, e dopo ~ 10 minuti i preparativi si trasformi in una tonalità marrone a causa di accumulo di DAB (Fig. 1C iv) Non è chiaro perché le precipitazioni DAB e FM colorante sbiancamento non avvengono simultaneamente, è possibile che una relativamente grande quantità di DAB ossidato ha bisogno di accumulare prima di aggregazione e precipitazione, e che quindi questa reazione è più lento il processo di sbiancamento. In questa fase, tuttavia, il preparato non è pronto per l'elaborazione di microscopia elettronica, come la precipitazione DAB è probabilmente incompleto. Noi preferiamo aspettare 5-10 minuti più lunghi, durante i quali la preparazione (terminale nervoso presinaptico) assume un colore marrone scuro (o nero) a colori, indicativo di completa conversione. Una conversione leggera della superficie generale della preparazione (per esempio, delle fibre muscolari in una giunzione neuromuscolare) si possono osservare in questa fase. E 'molto probabilmente legati alla conversione del DAB indotta da autofluorescenza (e / o fluorescenza fissativo), e non è dannoso per la procedura.
La preparazione viene poi elaborato per la microscopia elettronica, e devono essere controllati per la presenza di buio (con etichetta) vescicole. Come abbiamo dimostrato prima di 5,6, queste vescicole sono molto più denso non etichettati quelli, e sono quindi facilmente distinguibili (Figura 2B). Per aumentare la possibilità di distinguere bene i diversi tipi di vescicole, nessun contrasto di miglioramento colorazione posto di sezioni deve essere eseguita (non acetato di uranile o citrato di macchie di piombo), la colorazione osmio è sufficiente osservare elementi più cellulari, e non è così scuro come precipitare DAB.
Figura 1: coloranti FM e lo uso per fotoconversione. (A) Rappresentare le fasi di un esperimento classico per il carico e sequestro vescicole usando colorante FM sotto stimolazione. (I) Incubare il campione in FM colorante contenente tampone. (Ii) Stimolare (elettricamente o chimicamente) per indurre la fusione delle vescicole in presenza di FM colorante. (Iii) Il endocitosi sottosuccessione dopo la stimolazione verrà caricato alcune vescicole con colorante FM ancora presenti nel buffer extracellulare. (Iv) Sostituire il colorante extracellulare FM con il lavaggio con soluzione tampone. (V) Un nuovo stimolo indurrà vescicole caricato per liberare la loro tintura FM su esocitosi. (B) Schema che mostra il, ponte di testa e la coda della FM1-43 colorante. (C) Esempio di un esperimento fotoconversione in Drosophila NMJ. (I) Dopo aver caricato il NMJ con FM1-43, il lavaggio esterno molecole di colorante e di fissaggio, la fluorescenza di una terminazione nervosa può essere osservato con un microscopio convenzionale epifluorescenza (63x). (Ii-iii) Sotto illuminazione continua il colorante è completamente imbiancato. (Iv) In condizioni di illuminazione continua, un colore nero sembra a causa di precipitazioni diaminobenzidina. Barra di scala rappresenta 10 micron.
Figura 2: EM esempi di campioni photoconverted (A) L'immagine mostra un terminale nervose contenenti vescicole sinaptiche, ma non di loro sono photoconverted, questo potrebbe essere causato da non avere un'illuminazione sufficiente o scarsa penetrazione diaminobenzidina nel tessuto.. (B) bouton Synaptic con diversi scura (piena) vescicole che ha attraversato fotoconversione FM. (C) Eccesso di risultati illuminazione in un terminale complessivo buio dove non vescicole o organelli sono distinguibili. Barre di scala rappresentano 200 nm.
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Discussion
A pochi passi critici devono essere presi in considerazione:
- L'incubazione DAB deve essere eseguita solo dopo il lavaggio accurato e tempra dei preparativi. Altrimenti la glutaraldeide non ha reagito interagirà con DAB e provocare la sua precipitazione (in genere sotto forma di cristalli piatti, che non sono densi di elettroni). Preparativi in cui questo avviene precipitazioni abbondantemente sono raramente utilizzabili per la microscopia elettronica.
- Tempi di illuminazione deve essere ottimizzata, testando diverse preparazioni identiche con tempi di illuminazione differenti. Nella nostra esperienza, la conversione ottimale (Figura 2B) è raggiunto in una finestra temporale di circa 5 minuti (per esempio, tra i 35 ei 40 minuti dopo l'inizio di illuminazione). Illuminazione insufficiente (Figura 2A) è caratterizzata da una mancanza di organuli etichettati, e / o organelli parzialmente etichettati (come vescicole che sembra contenere DAB solo in metà del loro volume). Illuminazione lungo, al contrario, si traduce in più di conversione del prodotto di conversione DAB si accumula, distorce gli organelli e fugge nel citosol (Figura 2C). I preparativi appaiono come strutture nero in microscopia elettronica, con poca morfologia osservabili.
Abbiamo utilizzato la tecnica in diversi preparati, tra cui giunzioni neuromuscolari da Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, pesce zebra (Danio rerio) e rana (Rana pipiens e Rana esculenta). Abbiamo anche utilizzato la tecnica in cellule in coltura, tra colture di neuroni e cellule neuroendocrine. Può anche essere utilizzato con successo in sinapsi purificata da cervello di ratto (sinaptosomi). Pertanto, ci aspettiamo che la tecnica sia utilizzabile nella maggior parte dei preparati che utilizzano l'assorbimento della membrana vescicolare.
La tecnica è la tecnica più sensibile fino ad oggi nel determinare il posizionamento e la morfologia degli organelli endocitosi. E 'stato utilizzato per determinare la posizione esatta di organelli recentemente endocitato, tra cui specifiche piscine fisiologiche di vescicole 5,6,7,8. E 'stato anche utilizzato per determinare il numero e la morfologia degli organelli nella via di riciclaggio vedi ad esempio 9,10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
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