Summary
FM-färgämnen har varit till ovärderlig hjälp i förståelsen av synaptiska dynamik. FMS är normalt följs under fluorescerande mikroskopet under olika stimulering förhållanden. Dock medger photoconversion av FM färgämnen i kombination med elektronmikroskopi visualisering av olika synaptiska vesikler pooler, bland annat ultrastruktur komponenter, synaptiska boutons.
Abstract
Sammansmältningen av synaptiska vesiklar med plasmamembranet (exocytos) är ett obligatoriskt steg i signalsubstansen release och neuronal kommunikation. Den blåsor därefter hämtas från plasmamembranet (endocytos) och grupperas tillsammans med den allmänna pool av blåsor i nervändsluten, tills de genomgå en ny exo-och endocytos cykel (vesikler återvinning). Dessa processer har studerats med hjälp av olika tekniker såsom elektronmikroskopi, elektrofysiologi inspelningar amperometry och mätningar kapacitans. Viktigt under de senaste två decennierna ett antal fluorescerande markörer fram, vilket gör att optiska metoder för att spåra blåsor i deras återvinning dynamik. En av de mest använda markörerna är styryl eller FM-färg 1, strukturellt, alla FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofil svans ansluten via en aromatisk ring och en eller flera dubbelbindningar (Figur 1B). En klassisk FM färgämne experiment att märka en pool av blåsor består i att bada beredningen (bild 1Ai) med färgen under stimulering av nerv (elektriskt eller med höga K +). Detta leder vesikler återvinning och den efterföljande lastning av färgämnet i nyligen endocyteras blåsor (bild 1A I-III). Efter lastning av blåsor med färg, en andra omgång av stimulering i ett färgämne utan badet skulle utlösa FM genom exocytos (bild 1A IV-V), process som kan följas av att övervaka fluorescensintensitet minskning (avfärgning).
Även FM-färgämnen har bidragit starkt till området för vesikler återvinning, är det inte möjligt att avgöra det exakta lokalisering eller morfologi av enskilda blåsor med hjälp av konventionella fluorescensmikroskopi. Därför förklarar vi här hur FM-färgämnen kan också användas som endocytic markörer med hjälp av elektronmikroskopi, genom photoconversion. Den photoconversion Tekniken utnyttjar ägs av fluorescerande färger för att generera reaktiva syreradikaler under intensiv belysning. Fluorescerande preparat är nedsänkt i en lösning innehållande Diaminobenzidin (DAB) och belysta. Reaktiva ämnen som genereras av färg molekyler oxiderar DAB, som utgör en stabil, olöslig fällning som har ett mörkt utseende och kan lätt urskiljas i elektronmikroskopi 2,3. Eftersom DAB är bara oxideras i omedelbar närhet av fluorescerande molekyler (som den reaktiva syreradikaler är kortlivade), ser den teknik som bara fluorescerande strukturer kommer att innehålla elektron-täta fällning. Tekniken gör alltså att studera den exakta platsen och morfologi aktivt återvinning organeller.
Protocol
1) Beredning av Drosophila melanogaster neuronal muskulär trafikplats (NMJ)
- Förbered standard Drosophila saltlösning (130 mM NaCl, 36 mM sackaros, 5 mm KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mm MgCl 2, 5 mm Hepes, pH 7,3 4.
- Dissekera beredningen i saltlösning (1,1). Den Drosophila Larverna är trånade ryggsidan upp i en Sylgard maträtt, ryggsidan är uppställd längsgående, och de inre organen tas bort. Preparatet är sedan sträcks och trånade. Flera ventrala muskler kan då användas.
2) Stimulering och FM färgning
- Det är lämpligt att göra alla följande steg i svagt ljus, för att skydda FM-färgämnen från blekning.
- För kemisk stimulering av nerverna, är hög kalium buffert används. Förbered Drosophila saltlösning (se 1.1) med 90 mm KCl och 10 mikrometer i FM1-43 färgämne. Förvara lösningen skyddas från ljus.
- Bad beredningen med den tidigare beredda buffert i 1 minut vid rumstemperatur.
- Tvätta med standard Drosophila koksaltlösning (1,1) för att ta bort extracellulära FM1-43 färgämne. Gå vidare snabbt till fixering.
3) Fastställande
- Bad beredningen med 2,5% glutaraldehyd i fosfatbuffrad-saltlösning (PBS) i 45 minuter i rumstemperatur. För god konservering av morfologiska funktioner är glutaraldehyd föredrog att paraformaldehyd.
- Tvätta en gång med PBS och sedan lämna förberedelserna under vatten i 15 minuter i 100 mm av NH 4 Cl. Detta steg görs för att släcka den fria aldehyd grupper av resterande glutaraldehyd fixativ.
- Tvätta NH 4 Cl-lösning ut med normal PBS.
4) Photoconversion
- Inkubera NMJ förberedelse för 30 minuter vid 4 ° C i PBS som innehåller 1,5 mg ml-1 i Diaminobenzidin (DAB).
- Placera provet i den fluorescerande mikroskop. Hitta och fokusera fluorescerande signal med hjälp av en relativt låg förstoring mål nedsänkning i vatten (20x 0,5 NA).
- Belysa provet med den högsta lampans intensitet tills FM färgen är helt blekt (Figur 1C). För att kontrollera om photoconversion har inträffat, är lämpligt att kontrollera på provet under överföringen ljus före och efter FM-dye-blekning steg. Om photoconversion sker, är en mörkbrun fällning väntat (Figur 1C). Den brinntid varierar, beroende på belysningen styrka och också på DAB-penetration i beredningen. För de flesta preparat hittade vi belysning gånger på ~ 30-45 minuter för att vara optimalt när man använder en 20x mål. Kortare belysning perioder används för högre förstoring mål (60x).
- För belysning vi föredrar att använda en kvicksilverlampa med ett lykthus som innehåller en back spegel, som samlar back-spridda ljusstrålar och därmed ökar den totala intensiteten.
5) Behandling provet för EM
- Osmication
- Bered en lösning med en volym av osmium Tetroxide i träd mängder vatten (ca 300 l per prov). Arbetet med osmium Tetroxide måste göras under huven, med hjälp av handskar och ja skyddsutrustning.
- Inkubera förberedelserna i osmium Tetroxide lösningen för en timme vid rumstemperatur (Under huven).
- Tvätta mycket med PBS (4-5 gånger 5 minuter) och överför varje prov på en ren glasflaska.
- Dehydrering
- Bered separata lösningar som innehåller 30, 50, 70 90, 95 och 100% etanol.
- Tillsätt 1 ml 30% etanol till varje prov i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml 50% etanol till varje prov i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml 70% etanol till varje prov i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml 90% etanol till varje prov i 5 minuter.
- Tillsätt 1 ml 95% etanol till varje prov i 5 minuter (upprepa 3x).
- Tillsätt 1 ml 100% etanol till varje prov i 5 minuter (upprepa 3x).
- Bädda och vidareförädling
- Blanda 1 volymdel Epon harts med en volym av etanol. Lägg till beredningen under ständig rotation (2-4 timmar).
- Placera preparatet i 100% Epon i öppna flaskor, att återstående etanolen avdunstar (4-6 timmar).
- Placera preparatet i formarna vid 60 ° C i 36 timmar.
- Elektronmikroskopi bearbetning. Process beredningen i 50-80 nm tunna delar, med hjälp av vanliga ultramicrotomy förfaranden.
- Elektronmikroskopi imaging
- Beredningen är avbildas med konventionella EM förfaranden.
6) representativa resultat
De förväntade resultaten beskrivs i figurerna 1C och 2. Belysningen förfarande resulterar i bildandet av broWN DAB fällning, som kommer att synas i både fluorescens och överföring avbildning. Den första händelsen under belysning försvinnandet av fluorescens i samband med FM-dye färgning. Bakgrunden fluorescens framkallas av aldehyd fixativ, däremot, kommer att vara synlig under hela försöksperioden. Blekning sker vanligtvis i ~ 10-20 minuter efter start av belysning. Normalt ingen photoconversion produkt kan observeras vid denna tidpunkt.
Belysning bör fortsätta, och efter ~ 10 minuter förberedelserna kommer att vända sig till en brun nyans på grund av DAB ackumulation (fig 1c iv) Det är oklart varför DAB nederbörd och FM färg blekning inte ske samtidigt, det är möjligt att en relativt stor mängden oxiderat DAB behöver samla innan aggregering och nederbörd, och att det därför denna reaktion är långsammare än blekningsprocessen. I detta skede är dock beredningen inte är redo för elektronmikroskopi bearbetning, eftersom DAB nederbörd är sannolikt ofullständig. Vi föredrar att vänta 50-10 minuter längre, under vilken preparatet (presynaptiska nervändsluten) antar en mörkbrun (eller svart) färg, tecken på total omställning. En liten ombyggnad av den allmänna ytan av preparatet (t.ex. av muskelfibrer i en neuromuskulära förbindelsen) kan observeras i detta skede. Det är mest sannolikt relaterade till en konvertering av DAB-inducerad av autofluorescens (och / eller fixeringsmedel fluorescens), och det är inte skadligt för förfarandet.
Preparatet är sedan bearbetas för elektronmikroskopi, och bör kontrolleras med avseende på förekomst av mörka (märkt) blåsor. Som vi har visat tidigare 5,6, dessa blåsor är mycket tätare än icke-märkta sådana, och är därför lätt att se skillnad (Figur 2B). För att öka chansen att skilja väl olika typer av blåsor bör ingen kontrastförstärkande efter färgning av avsnitten utföras (inga AUC acetat eller bly citrat färgning), den osmium färgningen är tillräckligt att konstatera flesta cellulära element, och är inte lika mörka som DAB fällning.
Figur 1: FM-färgämnen och IT-användning för photoconversion. (A) representerar de olika stegen i ett klassiskt experiment för lastning och distaining blåsor med FM färgämnet i stimulans. (I) Inkubera provet i FM-färg som innehåller buffert. (Ii) Stimulera (elektriskt eller kemiskt) för att inducera vesikelfusion i närvaro av FM färgämne. (Iii) subsequence endocytos efter stimulering kommer att ladda en del blåsor med FM färg kvar i den extracellulära buffert. (Iv) Byt ut extracellulära FM-dye genom att tvätta med buffert. (V) En ny stimulans kommer att framkalla lastade blåsor att släppa sin FM färg på exocytos. (B) Schematisk visar huvudet, bron och svans av FM1-43 färgämne. (C) Exempel på en photoconversion experiment i Drosophila NMJ. (I) Efter laddar NMJ med FM1-43, tvätt externa färg molekyler och fastställande kan fluorescens ett nervändslut observeras med en konventionell epifluorescensmikroskop (63x). (Ii-iii) Enligt kontinuerlig belysning färgen är helt blekt. (Iv) När belysning fortsätter visas en svart färg på grund av Diaminobenzidin nederbörd. Skala stapel representerar 10 mikrometer.
Figur 2: EM exempel på photoconverted prover (A) Bilden visar ett nervändslut som innehåller synaptiska vesikler, men inte av dem är photoconverted, detta kan bero på att inte ha tillräckligt med belysning eller dålig Diaminobenzidin penetrering i vävnaden.. (B) Synaptic Bouton med flera mörka (fylld) vesikler som gick igenom FM photoconversion. (C) Överskott av belysning resulterar i en total mörker terminal där inga blåsor eller organeller är urskiljbara. Skala stapel 200 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Några viktiga åtgärder som bör beaktas:
- DAB inkubation ska endast ske efter noggrann tvätt och härdning av förberedelserna. Annars icke-reagerade glutaraldehyd kommer att interagera med DAB och orsaka dess nederbörd (vanligtvis i form av platta kristaller, som inte är elektron tätt). Förberedelserna där denna utfällning sker i överflöd är sällan användbara för elektronmikroskop.
- Belysning gånger bör optimeras, genom att testa flera identiska preparat med olika belysning tider. Enligt vår erfarenhet är optimal konvertering (Figur 2B) uppnås i ett tidsfönster på ca 5 minuter (till exempel mellan 35 och 40 minuter efter start av belysning). Otillräcklig belysning (Figur 2A) kännetecknas av en brist på märkt organeller, och / eller delvis märkt organeller (såsom vesiklar ser ut att innehålla DAB i bara hälften av sin volym). Lång belysning, däremot, snedvrider resulterar i över-konvertering DAB konvertering produkten ackumuleras, de organeller och flyr in i cytosolen (figur 2C). Förberedelserna visas som svart strukturer i elektronmikroskop, med lite observerbara morfologi.
Vi har använt tekniken i flera preparat, inklusive neuromuskulära korsningar från Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, sebrafisk (Danio rerio) och groda (Rana pipiens och Rana esculenta). Vi har även använt tekniken i odlade celler, inklusive odlade nervceller och neuroendokrina celler. Den kan även användas med framgång i renat synapser från råtta hjärnan (synaptosomes). Därför förväntar vi oss tekniken för att kunna användas i de flesta preparat som används SVD membran upptag.
Tekniken är den mest känsliga metoden hittills för att fastställa positionering och morfologi endocyteras organeller. Den användes för att bestämma den exakta platsen för nyligen endocyteras organeller, inklusive specifika fysiologiska pölar av blåsor 5,6,7,8. Den har också använts för att bestämma antalet och morfologi av organeller i återvinningen väg se till exempel 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | |
| Epon resin | Plano GmbH | R1030 | |
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | |
| Axioskop 2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus Corporation | Dry objective | |
| 100W Hg Lamp | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Lamp housing with back mirror | Carl Zeiss, Inc. | 1007-980 | |
| MRm camera | Carl Zeiss, Inc. | 0445-554 | Image acquisition |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | |
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | |
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | |
| EM | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
